應(yīng)用正交設(shè)計(jì)篩選小葉章誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方

張玉，冷海楠，徐明怡，倪紅偉，王麗媛（黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所濕地與生態(tài)保育國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150040）

應(yīng)用正交設(shè)計(jì)篩選小葉章誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方

張玉，冷海楠，徐明怡，倪紅偉*，王麗媛
（黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所濕地與生態(tài)保育國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150040）

以小葉章的莖段作外植體，采用正交設(shè)計(jì)法，考察6-BA、TDZ、NAA三種激素對小葉章初代培養(yǎng)產(chǎn)生的影響，確定適宜的激素種類及水平，優(yōu)化篩選出適宜小葉章的誘導(dǎo)培養(yǎng)基.研究表明，激素6-BA是莖段誘導(dǎo)的關(guān)鍵因素；適宜小葉章初代培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方為：1/2MS+6-BA0.5 mg·L-1+ TDZ0.1mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1。

小葉章；正交設(shè)計(jì)；誘導(dǎo)培養(yǎng)基

小葉章（CalamagrostisangustifoliaKom.）又名苫房草，是禾本科拂子茅屬多年生根莖型草本植物，在我國主要分布于東北、華北、內(nèi)蒙古等地區(qū)的平原低洼濕地，是三江平原典型草甸、沼澤化草甸的建群植物和優(yōu)勢植物［1-4］。近年來，小葉章的種群受到嚴(yán)重的破壞，生態(tài)功能下降。而無性繁殖是種群擴(kuò)繁的常用方法。尤其通過組織培養(yǎng)方法不僅可以克服種子繁殖中存在的問題，而且可以克服扦插繁殖速度慢、繁殖率低的缺點(diǎn)［5］。因此利用組織培養(yǎng)技術(shù)，建立完整的小葉章組培快繁體系，顯得尤為重要。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2015年6月至2015年12月在黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。選取當(dāng)年新生無病蟲害、生長健壯的幼嫩莖段作為外植體。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1培養(yǎng)基條件

以MS為基本培養(yǎng)基，添加蔗糖30g·L-1和瓊脂6 g·L-1，調(diào)整pH值為5.5-5.8，配制分裝后于121℃滅菌20 min。培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照強(qiáng)度40μmol·m-2·s-1每天光照16 h·d-1。

1.2.2外植體預(yù)處理

將采集的莖段，去除葉片和葉柄，流水沖洗30min，剪成4-6 cm長的莖段（每段帶1個(gè)節(jié)），再用適量的洗潔精水沖洗2遍，自來水沖洗干凈后置于超凈工作臺(tái)中。

1.2.3外植體消毒試驗(yàn)

在超凈工作臺(tái)上，用75％酒精浸泡30s，無菌水沖洗2次；用0.1％Hgcl2溶液消毒2、4、6、8、10、15min，期間不斷搖晃，無菌水沖洗5次，用無菌濾紙吸干表面水分，于消毒過的濾紙上切除上下切口處的褐化部分，將材料切成1.5-2.0 cm、帶1-2個(gè)葉腋的莖段并吸干莖段上的水分，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。比較0.1％Hgcl2不同消毒時(shí)間的滅菌效果，7d后觀察污染情況，14 d后統(tǒng)計(jì)污染率、成活率。污染率（％）=（污染數(shù)/接種數(shù)）×100％；成活率（％）=芽誘導(dǎo)直接成苗率/接種未污染芽數(shù)×100％。

1.2.4誘導(dǎo)試驗(yàn)

將消毒好的小葉章莖段接種在初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS，同時(shí)添加不同種類和濃度的激素。按照表1設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)的因素和水平，采用L9（34）正交表設(shè)計(jì)初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基（表2）。每瓶一個(gè)莖段，每個(gè)處理接種30瓶，重復(fù)3次。30天后統(tǒng)計(jì)腋芽萌芽率。篩選小葉章莖段不定芽誘導(dǎo)啟動(dòng)的最佳激素濃度配比。

1.3數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Microsoft Excel 2003和DPS 7.5分析軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1不同處理對小葉章外植體消毒效果的影響

由表3可以看出，不同的消毒時(shí)間對小葉章外植體的接種是有一定的影響的。

隨著0.1％HgCl2消毒時(shí)間的增加，外植體污染率下降，而成活率先升高后降低，4min時(shí)達(dá)到最高，71.6％，當(dāng)消毒15min時(shí)，外植體全部死亡，所以75％酒精30s+0.1％HgCl24 min消毒效果最好。

表1　正交試驗(yàn)的因素和水平

表2　按正交表設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基配方

表3　不同消毒時(shí)間對小葉章莖段滅菌效果的影響

表4　不同植物生長調(diào)節(jié)劑對小葉章莖段初代培養(yǎng)的影響

2.2不同激素對小葉章腋芽誘導(dǎo)的影響

極差分析表4顯示：根據(jù)R值確定6-BA、TDZ、NAA對小葉章不定芽誘導(dǎo)的影響大小為：6-BA＞ NAA＞TDZ，從各因素水平均值（k）的大小可以看出最優(yōu)水平組合為：6-BA（0.5 mg·L-1）TDZ（0.1 mg·L-1）NAA（0.1 mg·L-1）；方差分析表5顯示：6-BA對試驗(yàn)結(jié)果的影響達(dá)極顯著水平（P＜0.01），TDZ、NAA對試驗(yàn)結(jié)果達(dá)到顯著差異（P＜0.05），根據(jù)F值可以看出，3個(gè)因素對試驗(yàn)結(jié)果的影響大小為6-BA＞NAA＞TDZ，同極差分析結(jié)果一致。

綜合極差分析與方差分析結(jié)果，得出小葉章芽誘導(dǎo)啟動(dòng)的最優(yōu)水平組合為6-BA（0.5 mg·L-1）TDZ（0.1 mg·L-1）NAA（0.1 mg·L-1），即：1/2MS+6-BA0.5 mg· L-1+TDZ0.1 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1。

3　討論

在植物的組織培養(yǎng)中，確定初代培養(yǎng)的配方往往是首要的工作。在試驗(yàn)初期階段若依靠進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選，則不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力且結(jié)果常常并非最佳組合，因而使試驗(yàn)帶有一定的盲目性。采用正交設(shè)計(jì)可以用較少的試驗(yàn)次數(shù)獲取較多的信息，是一種高效率、快速、經(jīng)濟(jì)的方法［6］。

表5　正交設(shè)計(jì)方差分析表（完全隨機(jī)模型）

圖1　芽誘導(dǎo)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果極差圖

本試驗(yàn)中以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，選用了6-BA、TDZ、NAA3種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，各設(shè)3個(gè)濃度，進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)，并對試驗(yàn)數(shù)據(jù)做了直觀分析和方差分析，以確定6-BA、TDZ、NAA對芽誘導(dǎo)的作用，進(jìn)而對芽誘導(dǎo)效應(yīng)做出準(zhǔn)確的評價(jià)。本試驗(yàn)中6-BA0.5 mg·L-1是一個(gè)較適宜的濃度，芽誘導(dǎo)雖然有相對較好的表現(xiàn)，但各種組合結(jié)果均處于一個(gè)低的水平。我們猜測：影響小葉章芽誘導(dǎo)的顯著因素可能是其他植物激素種類，也可能是培養(yǎng)條件與激素的互作的影響。由圖1可知：細(xì)胞分裂素6-BA濃度小于0.5mg/L可能效果會(huì)更好，這方面需要進(jìn)一步的試驗(yàn)工作來驗(yàn)證。

［1］倪紅偉.三江平原典型草甸小葉章種群地上器官生物量及其分層結(jié)構(gòu)［J］.植物研究，1996，16（03）：356-362.

［2］倪紅偉，臧淑英，高亦珂.三江平原沼澤化草甸小葉章種群地上生物量及其生長速率季節(jié)動(dòng)態(tài)的研究［J］.植物研究，1996，16（04）：122-128.

［3］倪紅偉，張興，賈利.三江平原典型草甸小葉章種群地上生物量動(dòng)態(tài)［J］.植物研究，1998，18（03）：72-79.

［4］王建波，倪紅偉，付小玲.大氣CO2濃度升高對小葉章光合色素含量和光合參數(shù)的影響［J］.國土與自然資源研究，2013 （01）：82-83.

［5］吳安湘，金曉玲，熊芳.珍稀瀕危植物組織培養(yǎng)研究進(jìn)展.西北植物學(xué)報(bào)，2006，26（1）：211-216.

［6］杜榮騫.生物統(tǒng)計(jì)學(xué)［M］.北京：高等教育出版社，1989.

（2016-01-18收稿劉曉佳編輯）

Selection of Induction Medium for Calamagrostisangustifolia by Orthogonal Design

ZHANG Yu et al
（Institute of Natural Resources and Ecology，HAS.National and Provincial Joint Engineering Laboratory of Wetlands and Ecological Conservation，Harbin 150040，China）

Young stem from Calamagrostisangustifolia was used as explants.The effects of three kinds of hormones including 6-BA，TDZ，and NAA on Calamagrostisangustifolia were studied.The proper induction medium isselected out by orthogonal design，moreover，the kind and suitable level of hormone were ascertained.The results show that 6-BA is the critical factor for induction，the optimummedium forinitiation is:1/2MS+6-BA 0.5 mg·L-1+TDZ0.1mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1.

Calamagrostisangustifolia；Orthogonal design；Induction medium

S188

A

1003-7853（2016）02-0087-03

黑龍江省科學(xué)院創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目

張玉（1983-），女，黑龍江東寧縣人，碩士，助理研究員，主要從事分子生態(tài)方向研究。

倪紅偉（1964-）。