氧化石墨烯/十二烷基二甲基芐基氯化銨復(fù)合物的制備和抗菌性能研究

葉小莉，　施慶珊，　譚紹早

1.廣東省微生物研究所 省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510070；2.暨南大學(xué)化學(xué)系,廣東 廣州 510632

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氧化石墨烯/十二烷基二甲基芐基氯化銨復(fù)合物的制備和抗菌性能研究

葉小莉1,2，施慶珊1*，譚紹早2

1.廣東省微生物研究所 省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510070；2.暨南大學(xué)化學(xué)系,廣東 廣州 510632

本文研究了氧化石墨烯/十二烷基二甲基芐基氯化銨(GO-1227)復(fù)合抗菌材料的制備及其抗菌性能。通過傅立葉紅外光譜的檢測，確定GO-1227復(fù)合物已經(jīng)成功合成。為了研究復(fù)合物的抗菌活性，以大腸桿菌為代表，通過觀察大腸桿菌的表面形貌變化和細(xì)菌體外離子濃度變化，證明GO-1227復(fù)合物具有相對(duì)于原材料更好的抗菌性能。

氧化石墨烯； 十二烷基二甲基芐基氯化銨； 納米復(fù)合材料； 抗菌性

在最近幾年，大量的復(fù)合物抗菌劑已經(jīng)得到快速發(fā)展。因?yàn)樵谌粘Ｉ詈蜕a(chǎn)環(huán)境中，細(xì)菌可以很容易地生存和繁殖，如飲用水、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)、行業(yè)的循環(huán)冷卻、石油、化工、電力和紡織等水系統(tǒng)。細(xì)菌的存在會(huì)導(dǎo)致流體系統(tǒng)被腐蝕而停工。此外，它可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的健康問題，涉及有關(guān)醫(yī)療裝置的感染，甚至食品工業(yè)的污染[1]。因此，抗菌材料在我們的生產(chǎn)和生活中發(fā)揮著越來越重要的作用，提高抗菌性和抗菌劑使用效率已成為一個(gè)重要的研究課題[2，3]。

自從發(fā)現(xiàn)了十二烷基二甲基芐基氯化銨(1227)具有更好的抗菌性能后，1227作為消毒劑得到了廣泛的研究和應(yīng)用[4，5]。盡管1227抗菌性很好，但是其分子很容易團(tuán)聚， 導(dǎo)致其抗菌性不能被充分利用。為了解決這個(gè)問題， 科研工作者制備了季銨鹽復(fù)合抗菌材料， 通過將季銨鹽負(fù)載到各種載體上， 制備出分散性良好的復(fù)合抗菌材料，如：以碳材料為載體。氧化物石墨烯(GO)是一種眾所周知的含有羧基、羥基和環(huán)氧官能團(tuán)的致密蜂窩結(jié)構(gòu)的碳原子層[6]，并具有良好的抗菌性[7]。

本論文以氧化石墨烯、十二烷基二甲基芐基氯化銨等為原料， 制備了分散性良好的GO-1227復(fù)合材料。從材料結(jié)構(gòu)和抗菌性能兩個(gè)角度進(jìn)行研究，通過傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR)檢測手段，證明抗菌復(fù)合材料制備成功，以及其具有更優(yōu)異的抗菌性能[8]。本研究結(jié)果對(duì)于減少有害微生物對(duì)資源的損耗、降低致病微生物對(duì)人類健康的威脅具有重要意義。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器

試劑：自制氧化石墨烯(GO)，十二烷基二甲基芐基氯化銨(1227)，氯化鈉，實(shí)驗(yàn)室自制去離子水。藥品均為分析純。

儀器：攪拌器，離心機(jī)，燒杯，試管，冷凍干燥箱，空氣搖床。

1.2實(shí)驗(yàn)過程

將采用Hummers 法[6]制備的氧化石墨烯洗凈，干燥，備用。取0.05 g的氧化石墨烯均勻分散在20 mL蒸餾水中，再向其加入0.2 g十二烷基二甲基芐基氯化銨，室溫下攪拌4 h后，用超純水清洗和離心三次，然后，再冷凍干燥，得到氧化石墨烯-十二烷基二甲基芐基氯化銨(GO-1227)納米復(fù)合物。

1.3納米復(fù)合材料的表征

采用Nicolet6700傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR)，從400 cm-1記錄到4 000 cm-1觀察復(fù)合物結(jié)構(gòu)；采用Philip TECNAI-10透射電子顯微鏡(TEM)觀察樣品的形貌；采用電感耦合等離子光譜(ICP)測試復(fù)合物的細(xì)菌體外離子濃度。

1.4TEM樣品制備

首先將培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)用品放入滅菌鍋中，121 ℃滅菌20 min。然后在無菌室將大腸桿菌從斜面刮下，加入到10 mL液體LB培養(yǎng)基中37 ℃活化8 h，取出，用0.8wt.%生理鹽水離心洗滌3次。將等量的細(xì)菌分別加入到事先準(zhǔn)備好的10 mL空白生理鹽水、一定濃度1227、GO懸浮液和GO-1227懸浮液中，使菌體濃度為1010CFU/mL。37 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h。取出少量，進(jìn)行TEM測試。

1.5抗菌性能測試

利用細(xì)菌體外離子濃度變化來探究復(fù)合物對(duì)大腸桿菌的抗菌性能。分別向試管中加入生理鹽水、一定濃度1227、GO懸浮液和GO-1227懸浮液，然后分別混入用0.8%鹽水稀釋的105～106CFU/mL大腸桿菌ATCC25922。將上述四支試管放置在37 ℃的空氣搖床中振動(dòng)培養(yǎng)24 h。分別取0 h和接觸24 h之后的溶液，進(jìn)行過濾、消化，分別測試K+,Ca2+，Na+，Mg2+等金屬濃度。重復(fù)測試三次。

2　結(jié)果與討論

2.1物相分析

用傅里葉變換紅外光譜探測樣本的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖1為(a)GO(b)1227(c)GO-1227的紅外光譜。GO在3 420 cm-1處出現(xiàn)O—H伸縮振動(dòng)峰，這可能是來自于空氣當(dāng)中的水分。除了這一點(diǎn)，還在1 729 cm-1、1 634 cm-1、1 396 cm-1和1 094 cm-1處出現(xiàn)吸收峰，它們分別屬于C=O、C=C、C—OH和C—O—C官能團(tuán)的振動(dòng)頻率。特別是1 729 cm-1處的C=O吸收峰，是氧化石墨烯最明顯的特征峰[9,10]?？梢?，石墨已經(jīng)成功被氧化成氧化石墨烯。從原料1227的紅外譜圖可以看出，1227在2 922 cm-1、2 851 cm-1、1 638 cm-1和1 474 cm-1處出現(xiàn)—CH3、—CH2、C=C和N—CH3等的特征吸收峰。然而，復(fù)合物GO-1227在2 922 cm-1、2 851 cm-1、1 729 cm-1、1 638 cm-1和1 474 cm-1等處出現(xiàn)吸收峰，分別為—CH3、—CH2、C=O、C=C和N—CH3基團(tuán)的特征峰，表明紅外譜圖包含了GO和1227的特征峰?？梢姳緦?shí)驗(yàn)已成功合成納米復(fù)合物GO-1227。

圖1　(a)GO (b)1227 (c)GO-1227的紅外光譜圖

2.2形貌分析

用TEM觀察被生理鹽水、GO、1227和GO-1227分別作用過的革蘭氏陰性大腸桿菌的形貌(圖2)。對(duì)于空白對(duì)照，用生理鹽水保存24 h后細(xì)菌仍具有完整的鞭毛、細(xì)胞壁和細(xì)胞其他組成。與空白對(duì)照的細(xì)胞對(duì)比，被GO、1227和GO-1227處理后的細(xì)胞在圖片中顯示出明顯的差異。對(duì)于GO處理的細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)壁分離，鞭毛消失了，細(xì)胞壁有顯著變化，細(xì)胞壁已有明顯損壞。用1227處理過的細(xì)菌細(xì)胞壁有更明顯的變化，大腸桿菌的細(xì)胞壁已被完全分離，并且只有細(xì)胞內(nèi)膜和外膜被留下。然而，對(duì)于GO-1227，除了細(xì)胞壁有明顯的分離之外，細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)也有溢出的跡象。從這些圖像中，可以得出結(jié)論，GO-1227能夠非常有效地改變細(xì)菌細(xì)胞膜的滲透性。

圖2　經(jīng)(a)空白、(b)GO、(c)1227和(d)GO-1227分別作用過的大腸桿菌形貌圖

2.3材料抗菌性分析

大多數(shù)細(xì)菌都有 “吸鉀排鈉” 的功能，也就是指維持細(xì)胞內(nèi)外K+和Na+濃度差。這個(gè)功能對(duì)于維持細(xì)胞基礎(chǔ)電位和確保細(xì)胞內(nèi)外的離子滲透平衡具有重要作用。然而，當(dāng)細(xì)菌接觸了抗菌劑之后，細(xì)胞的這種功能被破壞。從圖3可以看出，細(xì)菌與抗菌材料作用24 h后，細(xì)胞體外的K+和Na+的含量比未處理的細(xì)菌顯著高得多，表明抗菌復(fù)合物能使細(xì)菌細(xì)胞膜通透性變大或損壞，所以造成細(xì)菌體內(nèi)的K+和Na+離子溢出。然而，用GO-1227處理細(xì)菌細(xì)胞體外的K+和Na+離子含量比用GO和1227處理的更高，這進(jìn)一步說明GO-1227的抗菌性更好。另一方面，相比于未處理的細(xì)菌，用抗菌材料處理過的細(xì)菌細(xì)胞體外的Ca2+和Mg2+的含量稍有增加。因?yàn)榧?xì)菌細(xì)胞膜的通透性增加，Ca2+和Mg2+通過離子濃度梯度的差異釋放到外部。因此，抗菌復(fù)合物GO-1227改變細(xì)菌的滲透性并打破離子濃度的平衡，從而證明其具有很強(qiáng)的抗菌效果。

圖3　抗菌材料處理24 h后大腸桿菌胞外離子濃度變化柱形圖

3　總結(jié)

本研究以氧化石墨烯、十二烷基二甲基芐基氯化銨等為原料，成功制備了分散性較好的GO-1227復(fù)合材料。對(duì)其抗菌性能進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，單一組分的氧化石墨烯和1227有較小的抗菌效果，而GO和1227復(fù)合得到GO-1227復(fù)合物，其抗菌性得到很大的提升，對(duì)大腸桿菌具有良好的抗菌性能。不僅因?yàn)閺?fù)合材料具有更優(yōu)良的比表面積和防止1227聚集的功能，從而使得復(fù)合物抗菌劑更容易吸附細(xì)菌，還由于兩種原料本身都具有抗菌性，因此提高了GO-1227復(fù)合物的抗菌性能。

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Preparation of graphene oxide/dodecyl dimethyl benzyl ammonium chloride complex and its antibacterial properties

YE Xiao-li1, 2， SHI Qing-shan1， TAN Shao-zao2

1. Guangdong Institute of Microbiology, State Key Laboratory of Applied Microbiology Southern China, Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application, Guangdong, Guangzhou, 510070 2. Jinan University, Guangdong, Guangzhou, 510632

Preparation of graphene oxide/dodecyl dimethyl benzyl ammonium chloride (GO-1227) complex and its antibacterial properties were described in this articale. The antibacterial properties of GO-1227 were investigated by bacterial surface morphology and ion concentration outside the cell dealt with the antimicrobial agent. The results showed that the obtained GO-1227 complex displayed enhanced antibacterial properties．

graphene oxide; dodecyl dimethyl benzyl ammonium chloride; nanocomposite; antimicrobial properties

10.3969/j.issn.1001-6678.2016.04.010

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目資助(項(xiàng)目編號(hào): 2013B050800023，2013B090600148)。

葉小莉(1991～)，女，在讀碩士生。Tel：020-87137649， E-mail：954740745@qq.com。

施慶珊(1966～)，男，研究員。E-mail：shiqingshan@hotmail.com。