幾種常用防腐劑對(duì)日化產(chǎn)品中腐敗微生物抑制效果研究

楊　娟，　劉永龍，　林　芮，　梁　健，　陳　娟，　黃小茉,3，　邱曉穎,3*

1.廣東迪美生物技術(shù)有限公司，廣州 510663； 2.廣東省防霉抗菌工程技術(shù)研究中心，廣州 510070；3.廣東省微生物研究所 省部共建華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510070

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幾種常用防腐劑對(duì)日化產(chǎn)品中腐敗微生物抑制效果研究

楊娟1,2，劉永龍1,2，林芮1,2，梁健1,2，陳娟1,2，黃小茉1,2,3，邱曉穎1,2,3*

1.廣東迪美生物技術(shù)有限公司，廣州 510663； 2.廣東省防霉抗菌工程技術(shù)研究中心，廣州 510070；3.廣東省微生物研究所 省部共建華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510070

了解幾種常用防腐劑在日化產(chǎn)品基質(zhì)中的防腐效果。采用最低抑菌濃度方法測(cè)試卡松、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、苯氧乙醇、咪唑烷基脲、苯甲醇對(duì)腐敗微生物的抑菌活性；采用微生物挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證卡松、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、咪唑烷基脲、苯氧乙醇和苯甲醇的抑菌效果。日化產(chǎn)品中分離的腐敗微生物對(duì)卡松耐受性接近0.0015%，接近《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》2007版的限定，其它4種防腐劑在規(guī)定的使用范圍內(nèi)對(duì)分離的微生物都具有較好的抑制效果；卡松劑量在0.0015%、對(duì)羥基苯甲酸甲酯劑量在0.2%、咪唑烷基脲劑量在0.075%、苯甲醇劑量在0.2%時(shí)日化產(chǎn)品能通過微生物挑戰(zhàn)。日化企業(yè)應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況篩選、復(fù)配防腐劑，建立更加高效、經(jīng)濟(jì)的防腐體系。

防腐劑； 最低抑菌濃度； 微生物挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)

日化產(chǎn)品指的是人們?nèi)粘Ｉ钪惺褂玫目萍蓟瘜W(xué)品，包括洗發(fā)水、沐浴露、化妝品等，隨著人們對(duì)日化產(chǎn)品的需求不斷提高，越來越多的生物原料被添加到日化產(chǎn)品中，在改善產(chǎn)品功能的同時(shí)，更增加了產(chǎn)品被微生物污染的機(jī)會(huì)[1-3]。近年來國(guó)內(nèi)外關(guān)于市售日化用品微生物污染狀況調(diào)查研究表明，微生物指標(biāo)不合格的產(chǎn)品仍然占有一定比例[4-6]。2015年本團(tuán)隊(duì)共檢測(cè)了37家不同公司的2 037件日化產(chǎn)品，其中被微生物污染的共有179件，經(jīng)過分離鑒定，發(fā)現(xiàn)在變質(zhì)產(chǎn)品中檢出率最高的微生物為銅綠假單胞菌(Pseudomonasaerugimosa)；枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)；微桿菌(Microbacteriumsp.)；洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderiacepacia)；黑曲霉(Aspergillusniger)；繩狀青霉(Penicilliumfuniculosum)等。

為了保障日化用品品質(zhì)安全，添加防腐劑成為抑制微生物污染的主要手段，但防腐劑添加量過少，易誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，添加量過多，會(huì)對(duì)人體安全產(chǎn)生影響[7,8]，防腐劑的防腐效果評(píng)價(jià)是日化用品研發(fā)中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。我國(guó)一些機(jī)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)及美國(guó)FDA對(duì)防腐劑使用情況公布表明，日化用品的常用防腐劑主要有對(duì)羥基苯甲酸酯類(后文簡(jiǎn)稱甲酯)、苯氧乙醇、甲基異噻唑啉酮(后文簡(jiǎn)稱卡松)、咪唑烷基脲、苯甲醇等[9]。本研究采用最低抑菌濃度(MIC)和微生物防腐挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)評(píng)估這幾種防腐劑對(duì)日化產(chǎn)品中常見的腐敗微生物的防腐效果，選擇出使用量低且能夠有效抑制微生物生長(zhǎng)的防腐劑，為日化企業(yè)選擇防腐劑提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

由某日化企業(yè)提供的未添加任何防腐劑的洗發(fā)水基質(zhì)。

1.2培養(yǎng)基

卵磷脂、吐溫80-營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。生化試驗(yàn)培養(yǎng)基參見《微生物培養(yǎng)基的制造與應(yīng)用》[10]。

1.3防腐劑

卡松、甲酯、苯氧乙醇、咪唑烷基脲、苯甲醇，由廣東迪美生物技術(shù)有限公司提供。

1.4實(shí)驗(yàn)菌株

從變質(zhì)樣品中分離并鑒定的銅綠假單胞菌(Pseudomonasaerugimosa) JZK-055(洗發(fā)水)；枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)JZK-064(沐浴露)；微桿菌(Microbacteriumsp.)JZK-137(洗手液)；洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderiacepacia)JZK-105(洗潔精)；黑曲霉(Aspergillusniger)JZK-110(面霜)；繩狀青霉(Penicilliumfuniculosum)JZK-133(面膜)。

1.5實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1霉菌孢子懸液和細(xì)菌懸液的配制[11]

將黑曲霉和繩狀青霉從甘油管中分別接種到PDA平板，置于恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)好后用滅菌磷酸鹽緩沖液(PBS)洗脫孢子，并稀釋至5×106CFU/mL (血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù))備用。將1.4中細(xì)菌分別從甘油管中接種到卵磷脂、吐溫80-營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基, 置于搖床上 37 ℃ 振蕩培養(yǎng)12 h，取菌液1 mL, 離心棄上清, PBS各洗滌1次, 并用PBS分別稀釋至5×107CFU/mL (測(cè)OD600)備用。

1.5.2不同防腐劑對(duì)腐敗微生物的MIC研究

以無菌操作用PBS分別將卡松稀釋成質(zhì)量百分濃度為0.4%、0.3%、0.2%、0.15%和0.1%；甲酯濃度為20%、10%、5%、2%和1%；苯氧乙醇為40%、30%、20%、10%和5%；咪唑烷基脲濃度為10%、7.5%、5%、2.5%和1%；苯甲醇40%、30%、20%、10%和5%的稀釋液。制備100 mL的卵磷脂、吐溫80-營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基，將防腐劑按1%接種量加入培養(yǎng)基，制備成相應(yīng)濃度的培養(yǎng)基：卡松濃度為(μg/mL)40、30、20、15和10；甲酯濃度為(μg/mL)2 000、1 000、500、200和100；苯氧乙醇濃度為(μg/mL)4 000、3 000、2 000、1 000和500；咪唑烷基脲濃度為(μg/mL)1 000、750、500、250和100；苯甲醇濃度為(μg/mL)4 000、3 000、2 000、1 000和500。分別傾注平皿。將制備的5×107CFU/mL菌懸液取100 μL于含防腐劑的培養(yǎng)基上，以同種濃度的菌懸液接種到不含防腐劑的培養(yǎng)基上做空白對(duì)照。

1.5.3化妝品中添加不同防腐劑的微生物挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)

本次實(shí)驗(yàn)參考化妝品、 盥洗用品與香料協(xié)會(huì)(CTFA) 及美國(guó)藥典的微生物挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)方法[12,13]。即將從變質(zhì)日化用品中分離的霉菌混合后稀釋到5×106CFU/mL，分離的細(xì)菌混合后稀釋到5×107CFU/mL，分別取100 μL接種到50 g化妝品中，在第3 d、7 d、14 d、21 d和28 d用平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)微生物的存活狀態(tài)。當(dāng)細(xì)菌在七天之內(nèi)至少減少99.9%，并且測(cè)試7d～28 d內(nèi)沒有增加；霉菌在7 d之內(nèi)應(yīng)該至少減少90%，并且測(cè)試7 d～28 d內(nèi)沒有增加判定為挑戰(zhàn)通過。

2　結(jié)果與討論

2.15種防腐劑對(duì)日化產(chǎn)品中分離微生物的最低抑制濃度

卡松、甲酯、咪唑烷基脲、苯氧乙醇、苯甲醇是目前國(guó)內(nèi)外日化企業(yè)使用最為廣泛的幾類防腐劑?！痘瘖y品衛(wèi)生規(guī)范》2007版中規(guī)定對(duì)羥基苯甲酸酯的最大允許使用濃度為：混合酯0.8%，單酯0.4%；卡松的最大允許使用濃度為0.0015%；咪唑烷基脲的最大允許使用濃度為0.6%；苯氧乙醇和苯甲醇的的最大允許使用濃度為1%。

本實(shí)驗(yàn)采用微生物學(xué)瓊脂稀釋法進(jìn)行了需氧菌藥敏性最低抑制濃度測(cè)試。

表1　5種防腐劑對(duì)腐敗微生物的最低抑制濃度(μg/mL)

結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)從變質(zhì)樣品中分離的微生物對(duì)卡松的耐受性都比較高，接近或者超出了使用限量，可能是污染的微生物對(duì)卡松產(chǎn)生了耐受性。此外由于卡松含有氯離子，具有一定刺激性，國(guó)內(nèi)外對(duì)它在日化用品中的使用限制越來越嚴(yán)格，卡松的安全性和其在日化產(chǎn)品中的使用情況需要進(jìn)一步關(guān)注[14，15]，另外4種防腐劑在規(guī)定的使用范圍內(nèi)對(duì)分離的微生物都具有較好的抑制效果。同時(shí)這幾類防腐劑對(duì)真菌的抑制效果要優(yōu)于細(xì)菌。

不同微生物對(duì)不同防腐劑的敏感性差異較大，日化企業(yè)在挑選防腐劑時(shí)應(yīng)根據(jù)配方的要求和風(fēng)險(xiǎn)微生物狀況通過實(shí)驗(yàn)合理選擇，這對(duì)于日化產(chǎn)品微生物污染的預(yù)防，常用防腐劑的選擇具有重要意義。

2.2日化產(chǎn)品中添加不同防腐劑的微生物挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)

日化企業(yè)投產(chǎn)前對(duì)產(chǎn)品防腐體系的可靠性做效能測(cè)試是十分必要的，目前，國(guó)內(nèi)外配方設(shè)計(jì)時(shí)普遍采用防腐挑戰(zhàn)性試驗(yàn)評(píng)價(jià)防腐劑的有效性。通過微生物挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)方法可以為企業(yè)選擇既能有效抑菌，又能達(dá)到最低添加量實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品安全的防腐劑時(shí)提供參考。本次實(shí)驗(yàn)參考化妝品、盥洗用品與香料協(xié)會(huì)(CTFA)及美國(guó)藥典的微生物挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)方法，結(jié)果見表2。

表2　防腐劑對(duì)日化產(chǎn)品中分離細(xì)菌的挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)(CFU/mL)

*細(xì)菌混合液：銅綠假單胞菌(Pseudomonasaerugimosa)；枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)；微桿菌(Microbacteriumsp)；洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderiacepacia).

同一防腐劑對(duì)不同微生物有不同的MIC。配方設(shè)計(jì)時(shí)第一步會(huì)考慮MIC較小的防腐劑。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)5種防腐劑的MIC結(jié)果設(shè)計(jì)了3種劑量的微生物挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，5種防腐劑對(duì)霉菌抑制效果較好，都通過了霉菌混合液的挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)；但僅卡松劑量在0.0015%、甲酯劑量在0.2%、咪唑烷基脲劑量在0.075%、苯甲醇劑量在0.2%時(shí)能通過細(xì)菌混合菌液的挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)；苯氧乙醇在挑選的3個(gè)劑量均未能通過細(xì)菌混合菌液的挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)。而且通過微生物挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)的防腐劑劑量也要比MIC值要高。這說明選擇防腐劑時(shí)在參照防腐劑的MIC的同時(shí)還要考慮產(chǎn)品的配方因素, 確定適宜的防腐劑配方, 正確評(píng)價(jià)其性能后再投入使用。

表3　防腐劑對(duì)日化產(chǎn)品中分離霉菌的挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)(CFU/mL)

*霉菌混合液：黑曲霉(Aspergillusniger)；繩狀青霉(Penicilliumfuniculosum).

卡松含量在0.001%，甲酯含量在0.1%，咪唑烷基脲含量在0.05%，苯甲醇含量在0.4%時(shí)，單獨(dú)使用均未能通過微生物挑戰(zhàn)。將它們復(fù)配使用對(duì)日化產(chǎn)品中分離的細(xì)菌進(jìn)行挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表4。

表4　防腐劑復(fù)配使用對(duì)日化產(chǎn)品中分離細(xì)菌的挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)(CFU/mL)

結(jié)果表明，這4種防腐劑在一定濃度單獨(dú)使用時(shí)未能通過微生物挑戰(zhàn)，在復(fù)配使用后對(duì)分離細(xì)菌的抑制效果較好。但本實(shí)驗(yàn)僅只針對(duì)洗發(fā)水基質(zhì)，在其它不同配方體系產(chǎn)品中的抑菌效果還需進(jìn)一步研究。

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)選擇了市場(chǎng)上最常用的5種防腐劑，采用最低抑菌濃度(MIC)和微生物防腐挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)評(píng)估這幾種防腐劑對(duì)日化用品中常見腐敗微生物的的防腐效果。選取的5種防腐劑除卡松外，在規(guī)定的使用范圍內(nèi)對(duì)分離的微生物都具有較好的抑制效果；除苯氧乙醇外在洗發(fā)水中單獨(dú)使用都能通過微生物挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)，說明這幾種防腐劑在日化產(chǎn)品中雖然具有較好的防腐效果，但隨著在產(chǎn)品中長(zhǎng)期使用，已經(jīng)出現(xiàn)了耐藥性的趨勢(shì)，同時(shí)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)防腐劑在日化產(chǎn)品中的使用限制越來越嚴(yán)格，如即將施行的《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》2015版對(duì)卡松的使用范圍和使用劑量都進(jìn)行了進(jìn)一步限定。因此單一防腐劑已經(jīng)無法達(dá)到有效抑菌的效果，復(fù)合防腐劑的使用是未來的趨勢(shì)。

通過將防腐劑復(fù)配使用既可以拓展抑菌譜，又可以減少每種防腐劑的用量，相對(duì)安全且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。可以將具有良好抑菌效果的防腐劑重新組合，研究各組分之間在不同配方產(chǎn)品中的最優(yōu)配比，建立更加高效、經(jīng)濟(jì)的防腐體系。

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Effect evaluation of antiseptic preservatives commonly used in cosmetic products

YANG Juan1,2, LIU Yong-long1,2, LIN Rui1,2, LIANG Jian1,2, CHEN Juan1,2, Huang Xiao-mo1,2,3, QIU Xiao-yin1,2,3

1. Guangdong Demay Biological Technology Co., Ltd, Guangzhou 510663; 2.Guangdong Province antimicrobial Engineering Technology Research Center, Guangzhou 510070; 3. Guangdong Institute of Microbiology, State Key Laboratory of Applied Microbiology Southern China, Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application, Guangzhou 510070

In order to understand the antiseptic effects of preservatives commonly used in cosmetic products, the minimal inhibitory concentration and microbiology challenge test was used to evaluate the effects of different preservatives on different microbes. In the actual cosmetics products, the kathon tolerance of the microorganisms separated from the contaminated cosmetics was nearly 0.0015%, close to the standard limit. The other four kinds of preservatives within the prescribed application range had good inhibition effects on microorganisms, such as kathon at 0.0015%, methyl p-hydroxybenzoate at 0.2%, imidazolidinyl urea at 0.075%, and benzyl alcohol at 0.2%, respectively. These cosmetic products could pass microbial challenge test. Based on actual circumstances, cosmetic product enterprises should screen various compounded preservatives for establishing more efficient and economical preservative system.

preservative; minimal inhibitory concentration; microbiology challenge test

10.3969/j.issn.1001-6678.2016.04.007

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B090600148,2013B050800023)，揭陽市產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目(201429)。

楊娟(1989～)，女，碩士，工程師，電話：020-8244095。E-mail：yangjuanhust@163.com。

邱曉穎(1962～)，女，教授級(jí)高工，主要從事工業(yè)微生物控制技術(shù)研究。E-mail：xyqiu29@163.com。