罐內(nèi)水性涂料抗微生物侵染的試驗(yàn)方法研究

郭曉苑，　李彩玲，　謝飛鴻，　劉靜霞，　周少璐，　謝小保

廣東省微生物研究所，華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣州 510070

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罐內(nèi)水性涂料抗微生物侵染的試驗(yàn)方法研究

郭曉苑，李彩玲，謝飛鴻，劉靜霞，周少璐，謝小保*

廣東省微生物研究所，華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣州 510070

本文介紹了推薦性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T30792-2014《罐內(nèi)水性涂料抗微生物侵染試驗(yàn)方法》制訂的必要性及制訂依據(jù)。針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)適用范圍、測(cè)試菌種、測(cè)試條件和實(shí)驗(yàn)程序等內(nèi)容分別進(jìn)行了系統(tǒng)的描述。

水性涂料； 抗菌性能； 測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)

水性涂料主要由乳液、顏料、填充料、助劑和水組成，為微生物的生長(zhǎng)創(chuàng)造了良好的條件，在溫度適宜時(shí)會(huì)促使微生物在罐內(nèi)生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生代謝作用，從而引起產(chǎn)品pH值、氣味、色澤、凝聚、破乳、粘度等變化，造成產(chǎn)品變質(zhì)。為了防止微生物在水性涂料儲(chǔ)藏和使用過(guò)程中的生長(zhǎng)繁殖，保護(hù)產(chǎn)品不被破壞，須在水性涂料中加入防腐劑,抑制或殺死微生物，延長(zhǎng)產(chǎn)品的保藏時(shí)間[1-4]。但是加入防腐劑后，水性涂料的抗微生物侵染的效果及其穩(wěn)定性需要一個(gè)科學(xué)的檢測(cè)方法與評(píng)價(jià)體系來(lái)進(jìn)行測(cè)試和評(píng)價(jià)，因此，建立抗微生物侵染功效的測(cè)試方法具有重要的實(shí)際意義。

目前水性涂料在罐內(nèi)貯藏期間抗微生物侵染性能測(cè)試方法主要有美國(guó)材料與試驗(yàn)協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)ASTM D 2574-06《容器中乳化漆耐微生物侵染的試驗(yàn)方法》，該標(biāo)準(zhǔn)于2012年進(jìn)行了修訂，我國(guó)還沒(méi)有相關(guān)測(cè)試方法和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，不同的企業(yè)、不同的協(xié)會(huì)測(cè)試時(shí)，采用的試驗(yàn)菌種、接種方式、培養(yǎng)方法等都有一定的差異。因此為規(guī)范水性涂料抗微生物侵染功效的評(píng)價(jià)方法，防止水性涂料受到微生物污染，需要研究制訂水性涂料的抗微生物侵染的試驗(yàn)方法和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[5-6]。

1　測(cè)試菌種

水性涂料抗微生物侵染功效試驗(yàn)中測(cè)試菌株的選擇非常重要。選用實(shí)際使用過(guò)程中經(jīng)常污染的微生物，能更好地代表實(shí)際污染狀況和正確評(píng)價(jià)防腐體系的作用效果。一般應(yīng)包括革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌、酵母菌中的至少一種。由于使用前罐內(nèi)涂料密封包裝，空氣少，不適合霉菌生長(zhǎng)。因此霉菌引起罐內(nèi)涂料變質(zhì)的可能性較低。美國(guó)ASTM D 2574推薦使用假單胞菌(如銅綠假單胞菌)和腸桿菌(如產(chǎn)氣腸桿菌)，同時(shí)還可選擇從腐敗變質(zhì)的涂料中分離的菌作為測(cè)試菌。

通過(guò)對(duì)我國(guó)水性涂料微生物污染情況的調(diào)查研究，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、產(chǎn)氣腸桿菌和白色假絲酵母是常見(jiàn)的涂料中污染微生物，因此選用這些菌種進(jìn)行抗微生物侵染功效試驗(yàn)，本標(biāo)準(zhǔn)采用菌種為大腸桿菌(Escherichiacoli)ATCC 25922，金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC 6538，銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC 10145，產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)ATCC 49701。

根據(jù)產(chǎn)品的用途，可增加其他細(xì)菌作為測(cè)試菌種。

2　接種和培養(yǎng)

培養(yǎng)方法有涂布培養(yǎng)法和稀釋培養(yǎng)法

涂布培養(yǎng)方法：稱(chēng)取100 g供測(cè)試的樣品2份，分別接種1 mL細(xì)菌菌懸液和1 mL酵母菌懸液，充分混合均勻，將樣品保存在30 ℃±2 ℃條件下，并于0時(shí)、第3 d、第5 d、第7 d分別測(cè)定樣品中的細(xì)菌和酵母菌含量。如果第7d沒(méi)有檢測(cè)到微生物，則重新接種。將2個(gè)無(wú)菌棉簽分別浸入已接種的2個(gè)涂料試樣中，通過(guò)在容器側(cè)壁上輕輕擠壓棉簽去掉多余的涂料(大約有200 mg的涂料會(huì)留在棉簽上)。將接種細(xì)菌的棉簽頭上的涂料均勻地涂布在TSA平板表面上，將接種酵母菌的棉簽頭上的涂料均勻地涂布在PDA平板表面上(相對(duì)保持在棉簽上的200 mg涂料，約只有50 mg的涂料會(huì)被涂在平板上)，試驗(yàn)重復(fù)3次。TSA平板置于36 ℃±1 ℃恒溫培養(yǎng)24 h～48 h，計(jì)數(shù)得到細(xì)菌菌落數(shù)， PDA培養(yǎng)基置于28 ℃±1 ℃培養(yǎng)48 h～72 h，計(jì)數(shù)得到酵母菌落數(shù)。

稀釋培養(yǎng)法：將供測(cè)試的樣品分成兩份各100 g，然后分別接種1 mL混合細(xì)菌液和1 mL酵母菌懸液，充分混合均勻，將樣品保存在30 ℃±2 ℃條件下，并于0 d、第3 d、第7 d、第14 d 、第21 d和第28 d分別測(cè)定樣品中的細(xì)菌和酵母菌含量。取10 g樣品加入到含90 mL稀釋液的錐形瓶中，充分搖勻做成1∶10的均勻稀釋液；吸取1∶10稀釋液1.0 mL加到9.0 mL稀釋液中，混勻做成1∶100稀釋液，依此方法可做成10倍遞增稀釋液。在做10倍遞增稀釋的同時(shí)，即以吸取該稀釋度的移液管吸取1 mL稀釋液于滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。細(xì)菌培養(yǎng)基采用TSA培養(yǎng)基，36 ℃±1 ℃恒溫培養(yǎng)24 h～48 h，酵母菌培養(yǎng)基采用PDA培養(yǎng)基。

3　防腐效果評(píng)價(jià)

涂布培養(yǎng)法按下表1對(duì)水性涂料抗微生物侵染功效進(jìn)行等級(jí)評(píng)價(jià)，0級(jí)抗微生物效果最好，3級(jí)效果最差。

表1　涂布培養(yǎng)法抗微生物侵染功效分級(jí)表

稀釋培養(yǎng)法采用評(píng)價(jià)等級(jí)(見(jiàn)表2)為：細(xì)菌于第7 d時(shí)細(xì)菌菌落總數(shù)減少百分率，至第28 d時(shí)無(wú)增長(zhǎng)，酵母菌于第7 d時(shí)菌落總數(shù)減少百分率，至第28 d時(shí)無(wú)增長(zhǎng)等條件為產(chǎn)品的抗微生物性能設(shè)立4個(gè)評(píng)價(jià)等級(jí)即0級(jí)、1級(jí)、2級(jí)和3級(jí)。等級(jí)的判斷要以細(xì)菌和酵母菌同時(shí)符合要求為條件，如果細(xì)菌和酵母菌的評(píng)判等級(jí)有差異時(shí)，以數(shù)字大的等級(jí)作為最終的產(chǎn)品評(píng)價(jià)等級(jí)。

表2　稀釋培養(yǎng)法抗微生物侵染功效分級(jí)表

4　方法驗(yàn)證

4.1防腐劑功效驗(yàn)證

在水性涂料中加入不同抗菌劑或不同含量相同抗菌劑，采用單一菌接種培養(yǎng)和混合菌接種培養(yǎng)進(jìn)行抗微生物侵染試驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，除樣品F外，單一菌接種培養(yǎng)與混合菌接種培養(yǎng)的結(jié)果一致，由于混合菌接種法更能代表實(shí)際污染的條件和狀況，測(cè)試結(jié)果能真實(shí)反映產(chǎn)品抗微生物侵染的功效，能保證產(chǎn)品的安全，且更相對(duì)省時(shí)省力，因此混合菌接種的方法更容易被生產(chǎn)企業(yè)所采用和接受，所以本標(biāo)準(zhǔn)采用混合菌接種方法進(jìn)行抗微生物侵染功效的測(cè)試和評(píng)價(jià)。

表3　抗微生物侵染效能測(cè)試結(jié)果

雖然采用涂布培養(yǎng)法和稀釋培養(yǎng)法測(cè)試結(jié)果的評(píng)價(jià)等級(jí)相同，但是測(cè)試過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，涂布培養(yǎng)法計(jì)數(shù)時(shí)易受到水性涂料的的干擾，加入TTC后有助于菌落計(jì)數(shù)，但該法相對(duì)更加省時(shí)省力，而稀釋培養(yǎng)法計(jì)數(shù)不受水性涂料性狀的影響，結(jié)果更加穩(wěn)定，但試驗(yàn)工作量大且時(shí)間長(zhǎng)。

4.2產(chǎn)品方法驗(yàn)證

根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方法對(duì)市場(chǎng)上銷(xiāo)售的水性涂料產(chǎn)品進(jìn)行了抗微生物侵染功效的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果顯示市售水性涂料的抗微生物侵染效果較好，多數(shù)產(chǎn)品都達(dá)到了0級(jí)。1級(jí)和2級(jí)各有一個(gè)產(chǎn)品。檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了該方法的可行性。

表4　市售水性涂料抗微生物侵染效能實(shí)驗(yàn)

注：*為0 d的菌落數(shù)。

4.3比對(duì)試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

檢測(cè)人員對(duì)不同品牌水性涂料和對(duì)照樣進(jìn)行了比對(duì)實(shí)驗(yàn)，考核方法的重復(fù)性及可靠性，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)證明不同的檢測(cè)人員對(duì)同一樣品測(cè)試結(jié)果的重復(fù)性較好，比對(duì)測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表5。

5　結(jié)論

依據(jù)本研究制訂的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T30792-2014《罐內(nèi)水性涂料抗微生物侵染試驗(yàn)方法》，其部分內(nèi)容參考了美國(guó)材料與試驗(yàn)協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)ASTM D 2574-06(2012))，并增加了涂料中其他常見(jiàn)的污染菌作為測(cè)試菌種，菌種代表性更強(qiáng)，為了更好的定量評(píng)價(jià)涂料的抗微生物侵染效果，參考ASTM E 640-06水性化妝品防腐功效的測(cè)試方法[7]，增加了稀釋培養(yǎng)法，引入了微生物減少百分率，能定量的表征涂料的抗微生物侵染效果，消除了微生物測(cè)試時(shí)的抗菌劑的抑菌作用，結(jié)果更加準(zhǔn)確，使標(biāo)準(zhǔn)具有更強(qiáng)的可操作性和適用性。

表5　不同檢測(cè)人員的比對(duì)試驗(yàn)

[1]陳逸君，楊光雄、朱優(yōu)君.水性涂料及其原料的防腐、防霉.涂料工業(yè)[J].2003，33(3):49-50.

[2]謝俊斌, 陳北秋. 水性涂料罐內(nèi)防腐殺菌劑穩(wěn)定性研究[J]. 涂料工業(yè), 2007, 37(3):59-61.

[3]王玉琦，楊云峰. 水性建筑涂料中防霉劑的選擇[J]. 中國(guó)涂料, 2005,20(5):46-49.

[4]彭紅，謝小保，歐陽(yáng)友生等.涂料用防霉劑、抗菌劑和抗藻劑[J].中國(guó)涂料，2007,22(12):48-53.

[5]中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，GB/T30792-2014 罐內(nèi)水性涂料抗微生物侵染的試驗(yàn)方法 [S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2014:1-8.

[6]ASTM D 2575-2006(2012) Standard test method for resistance of emulsion paints in the container to attack by microorganisms[S]. West Conshohocken,2012.

[7]ASTM E640-2006(2012) Standard Test Method for Preservatives in Water-Containing Cosmetics[S]. West Conshohocken,2012.

Test method of water-borne coatings in containers for resisting microorganism contamination

GUO Xiao-yuan, LI Cai-ling, XIE Fei-hong, LIU Jing-xia, ZHOU Shao-lu, XIE Xiao-bao

Guangdong Institute of Microbiology, State Key Laboratory of Applied Microbiology Southern China, Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application, Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology, Guangzhou 510070

The necessity and basis of developing recommended national standard GB/T30792-2014 test method of water-borne coatings in the containers for resisting microorganism contamination were introduced, and the applied scope of the standard, tested strains，testing conditions and testing procedures were described systematically.

water-borne coatings； antibacterial activity； test method

10.3969/j.issn.1001-6678.2016.04.012

郭曉苑(1982～)，女，大學(xué)本科，研究方向，有害微生物防治。E-mail: 123736489@qq.com。

謝小保(1966～)，男，研究員，主要從事工業(yè)材料抗菌防霉機(jī)理的研究。E-mail：xiaobaoxie@126.com。