盾殼霉抗逆性菌株的篩選

金　強(qiáng)，　段作營(yíng)，　夏森玉，　沈志松，　李華鐘，　金　堅(jiān)*

1. 江南大學(xué)藥學(xué)院， 江蘇 無(wú)錫 214122； 2. 江南大學(xué)工業(yè)微生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 無(wú)錫 214122；3. 無(wú)錫楗農(nóng)生物科技有限公司， 江蘇 無(wú)錫 214122

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盾殼霉抗逆性菌株的篩選

金強(qiáng)1，段作營(yíng)2，夏森玉3，沈志松3，李華鐘2，金堅(jiān)1*

1. 江南大學(xué)藥學(xué)院， 江蘇 無(wú)錫 214122； 2. 江南大學(xué)工業(yè)微生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 無(wú)錫 214122；3. 無(wú)錫楗農(nóng)生物科技有限公司， 江蘇 無(wú)錫 214122

通過(guò)測(cè)定野生型盾殼霉JN-CM菌株對(duì)所選的各種農(nóng)藥和化肥的耐受性，確定草甘膦、吡蟲(chóng)啉和磷肥對(duì)盾殼霉具有較大的抑制作用。采用紫外誘變方式分別篩選了對(duì)草甘膦、吡蟲(chóng)啉和磷肥具有一定耐受性的突變菌株，分別命名為UV-G(草甘膦抗性)、UV-I(吡蟲(chóng)啉抗性)和UV-P(磷肥抗性)。此3種抗性突變株具有良好的遺傳穩(wěn)定性，同時(shí)在生長(zhǎng)繁殖能力及侵染相關(guān)酶活性方面與野生菌株無(wú)明顯差異，具有良好的應(yīng)用潛力。

盾殼霉； 突變菌株； 紫外誘變

菌核病是一種廣泛分布的植物真菌病害，其病原菌為核盤(pán)菌(Sclerotiniasclerotriorum)[1,2]。核盤(pán)菌在生長(zhǎng)后期形成菌核，菌核是一種抗逆性極強(qiáng)的休眠結(jié)構(gòu)，在條件合適的情況下會(huì)繼續(xù)萌發(fā)侵染植株，產(chǎn)生病害[3]?，F(xiàn)在我國(guó)大量使用化學(xué)殺菌劑進(jìn)行菌核病的防治，對(duì)生態(tài)環(huán)境，人類健康都會(huì)造成不利影響。生物防治是現(xiàn)階段用于植物病害的另一種有效手段，其具有專一性強(qiáng)、作用時(shí)間久、無(wú)致病性的特點(diǎn)，對(duì)于菌核病的生物防治主要是利用生防菌盾殼霉(Coniothyriumminitans)進(jìn)行。

盾殼霉是核盤(pán)菌的一種重寄生菌[4]，研究表明盾殼霉可以寄生并破壞核盤(pán)菌的細(xì)胞壁，分泌的β-1-3葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶等可以分解和利用菌核，導(dǎo)致細(xì)胞壁塌陷，菌核變軟，核盤(pán)菌死亡[5]。以盾殼霉為有效成分的生物農(nóng)藥產(chǎn)品已經(jīng)上市，并得到廣泛的應(yīng)用。現(xiàn)有產(chǎn)品在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，為操作方便，節(jié)省人工成本，一般是和一定濃度的農(nóng)藥和化肥聯(lián)合施用。但有些化肥和農(nóng)藥會(huì)對(duì)盾殼霉的生長(zhǎng)和侵染造成影響，從而使相互共存存在問(wèn)題，篩選有關(guān)耐受性菌株是解決這一問(wèn)題的有效途徑[6]。

本文主要研究所選化肥及農(nóng)藥對(duì)盾殼霉孢子萌發(fā)及菌絲生長(zhǎng)的影響，通過(guò)紫外誘變的方式篩選對(duì)化肥、農(nóng)藥具有一定耐受能力的抗性菌種，并對(duì)抗性菌株的生長(zhǎng)繁殖能力及酶學(xué)活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株與培養(yǎng)基

盾殼霉菌株(C.minitans)JN-CM由無(wú)錫楗農(nóng)生物科技有限公司提供；核盤(pán)菌(S.sclerotriorum)為本研究室從江蘇省句容市某發(fā)病油菜地中分離得到。

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDB)：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH。如需要配置馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基，則添加瓊脂15～20 g。

明膠培養(yǎng)基：明膠10 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH。

MCD培養(yǎng)基：NH4H2PO42.0 g；K2HPO41.0 g；MgSO4·7H2O 0.5 g；KCl 0.5 g； FeSO40.01 g；1% ZnSO41 mL；0.5% CuSO41 mL，加入5 g研成粉末的菌核，定容到1 000 mL[7]。

1.1.2供試農(nóng)藥及化肥

41%草甘膦(美國(guó)孟山都公司)；10% 吡蟲(chóng)林(海利爾藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司)；5% 啶蟲(chóng)脒(萬(wàn)邦生物有限公司)；1.14% 甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽(山東恒豐化學(xué)有限公司)；氮肥(有效成分尿素)；磷肥(有效成分過(guò)磷酸鈣)；鉀肥(有效成分硝酸鉀)來(lái)自河北省沃豐科技有限公司。

1.2菌株培養(yǎng)及孢子懸液制備

(1) 平板培養(yǎng)及孢子懸液制備：取盾殼霉試管斜面用接種針刮取后點(diǎn)種在PDA平板上，或吸取孢子懸液加入到PDA平板涂布后培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為20 ℃，10 d后用無(wú)菌水洗下菌落上的分生孢子，用雙層擦鏡紙過(guò)濾制成孢子懸液，取樣用顯微鏡鏡檢計(jì)算孢子的含量，根據(jù)使用需要稀釋到相應(yīng)含量。

(2) 液體培養(yǎng)：取100 μL的盾殼霉孢子懸液(108CFU/mL)接種到100 mL液體培養(yǎng)基(PDB或MCD)，20 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)。

1.3盾殼霉菌株生長(zhǎng)情況測(cè)定

1.3.1菌株萌發(fā)率測(cè)定

取100 μL的孢子懸液(107CFU/mL)涂布平板，20 ℃培養(yǎng)36 h后，在顯微鏡下測(cè)定孢子萌發(fā)率(隨機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)鏡頭，每個(gè)鏡頭超過(guò)30個(gè)孢子，芽管長(zhǎng)度大于孢子直徑視為萌發(fā)，每次測(cè)量5個(gè)視野)。

1.3.2菌絲生長(zhǎng)速度測(cè)定

取長(zhǎng)有10 d盾殼霉菌株的PDA平板，用5 mm打孔器切取菌落邊緣的菌絲塊并接種到新的PDA平板中央，記錄第5 d和第10 d的菌落直徑，利用十字交叉法計(jì)算該平板上的菌絲生長(zhǎng)速度[8]。

1.3.3菌體干重測(cè)定

取100 mL PDB液體培養(yǎng)物(20 ℃，200 r/min培養(yǎng)10 d)用濾紙過(guò)濾，將所得盾殼霉菌體在60 ℃烘干至恒重。

1.4農(nóng)藥和化肥對(duì)盾殼霉生長(zhǎng)的影響

1.4.1盾殼霉對(duì)農(nóng)藥和化肥耐受性測(cè)定

根據(jù)所選農(nóng)藥和化肥的正常使用濃度，每種制成三個(gè)不同濃度含藥平板，分別測(cè)定盾殼霉的萌發(fā)率和菌絲生長(zhǎng)速度，以不加藥劑為空白對(duì)照。按式1計(jì)算抑制率。

(1)

A:空白對(duì)照的萌發(fā)率或菌絲生長(zhǎng)速度；Ai：各處理的萌發(fā)率或菌絲生長(zhǎng)速度。

1.4.2農(nóng)藥和化肥對(duì)菌株最小全抑制濃度測(cè)定

每種供試藥劑都制成7個(gè)濃度的含藥平板，以不加藥劑作為對(duì)照，測(cè)定各濃度下的孢子萌發(fā)率，規(guī)定孢子萌發(fā)率最先為零的濃度即為最小全抑制濃度。

1.5菌株誘變及突變株的篩選

確定對(duì)盾殼霉生長(zhǎng)具有較強(qiáng)抑制作用的農(nóng)藥或化肥種類，采用紫外誘變的方式篩選對(duì)該農(nóng)藥或肥料具有一定耐受性的盾殼霉突變菌株。對(duì)盾殼霉分生孢子懸浮液進(jìn)行紫外誘變[9](107CFU/mL，誘變條件：15 W，30 cm，10 min)，取100 μL孢子懸液涂布PDA平板，20 ℃培養(yǎng)。待長(zhǎng)出孢子后，洗下孢子涂布在加藥平板上(藥劑濃度為最小全抑制濃度)，長(zhǎng)出單菌落時(shí)挑出并接種到PDA平板培養(yǎng)到長(zhǎng)出孢子，再次洗下涂布到加藥平板上(最小全抑制濃度)，測(cè)定萌發(fā)率，萌發(fā)率80%以上即為抗性菌株。

1.6抗逆性菌株的遺傳穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

將挑選的抗性菌株接種到PDA平板上20 ℃培養(yǎng)15 d，制成孢子懸液再次轉(zhuǎn)接到PDA板上培養(yǎng)15 d，如此重復(fù)8次，取第8次的孢子懸液涂布到含藥平板(最小全抑制濃度)上。以菌株JN-CM為對(duì)照，比較各抗性株的萌發(fā)率。

1.7盾殼霉酶活的測(cè)定

1.7.1幾丁質(zhì)酶活測(cè)定

采用DNS法測(cè)定還原糖生成量[10]，通過(guò)還原糖生成量比較酶活高低。以膠體幾丁質(zhì)作為底物[11]，取1 mL酶液加入試管(以高溫滅活的酶液作為對(duì)照)，并加入1 mL 1%的膠體幾丁質(zhì)磷酸緩沖液，50 ℃水浴10 min，加入3 mL DNS終止反應(yīng)，沸水浴5 min后迅速拿出冷卻至室溫。酶活力單位定義為以每小時(shí)生成1 μmol的N-乙酰葡萄糖所需的酶量。

1.7.2β-1-3葡聚糖酶活測(cè)定

以海帶多糖為反應(yīng)底物。取1 mL粗酶液加入試管(以高溫滅活的酶液作為對(duì)照)，并加入0.8 mL的醋酸緩沖液和0.2 mL的海帶多糖(50 g/mL)，50 ℃水浴10 min，加入3 mL DNS終止反應(yīng)，沸水浴5 min后迅速冷卻至室溫。酶活力單位定義為測(cè)定條件下每分鐘分解海帶多糖生成1 μmol葡萄糖所需的酶量。

1.7.3蛋白酶酶活的測(cè)定

方法參見(jiàn)劉旭燕的論文[12]。

2　結(jié)果與討論

2.1JN-CM菌株對(duì)農(nóng)藥和化肥的耐受性

2.1.1菌株在正常使用濃度下對(duì)農(nóng)藥及化肥的耐受性

將所選農(nóng)藥和化肥分別與PDA平板混合，按正常使用濃度(在實(shí)際種植過(guò)程中的使用濃度)配制成以下3個(gè)濃度梯度，由低到高分別設(shè)置為處理1～處理3。(1) 草甘膦(g/L)：2.5、5、7.5；(2) 甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽(g/L)：0.25、0.5、1；(3) 啶蟲(chóng)脒(g/L)：0.25、0.375、0.5；(4) 吡蟲(chóng)林(g/L)：0.5、1、1.5；(5) 氮肥、鉀肥、磷肥(g/L)：2.5、5、7.5。測(cè)定各藥劑在不同濃度下對(duì)盾殼霉JN-CM孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)的影響，結(jié)果如表1、2所示。從表1、2可看出，除草劑草甘膦，殺蟲(chóng)劑吡蟲(chóng)林對(duì)盾殼霉孢子的萌發(fā)(最大抑制率分別為98.38%和80%)和菌絲生長(zhǎng)(最大抑制率分別為100%和41.76%)均有強(qiáng)烈的抑制作用；化肥與農(nóng)藥不同，只有磷肥對(duì)孢子的萌發(fā)有一定影響(最大抑制率為18.35%)，只有鉀肥對(duì)菌絲生長(zhǎng)有一定抑制(最大抑制率28.71%)。

表1　盾殼霉菌絲生長(zhǎng)的抑制率/%

表2　盾殼霉孢子萌發(fā)的抑制率/%

2.1.2所選化肥和農(nóng)藥對(duì)菌株的最小全抑制濃度

提高農(nóng)藥與化肥的加藥量，制成8個(gè)濃度梯度。(1)草甘膦：0、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6(g/L);(2)吡蟲(chóng)林：0、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5(g/L);(3)啶蟲(chóng)脒：0、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8(g/L);(4)甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽：0、10、12.5、15、17.5、20、22.5、25(g/L);(5)磷肥，氮肥，鉀肥：0、10、12.5、15、17.5、20、22.5、25(g/L)。提高加藥量后，各處理組的孢子萌發(fā)率變化如圖1所示。

從圖1可以看出，氮肥和鉀肥在測(cè)定濃度下對(duì)盾殼霉孢子萌發(fā)率并無(wú)較大影響，而其他各農(nóng)藥和化肥的最小全抑制濃度分別為：草甘膦為6 g/L、吡蟲(chóng)林為5 g/L、啶蟲(chóng)脒為7.5 g/L、阿維菌素為22.5 g/L、磷肥為25 g/L。結(jié)合2.1.1的結(jié)果，除草劑草甘膦，殺蟲(chóng)劑吡蟲(chóng)林對(duì)盾殼霉的生長(zhǎng)抑制作用顯著，需要篩選抗逆性菌株。磷肥在高濃度條件下也會(huì)對(duì)盾殼霉分生孢子的萌發(fā)造成顯著抑制。化肥在實(shí)際使用中，只有追肥才會(huì)采用噴灑，基肥通常直接施用于土壤，且化肥使用常出現(xiàn)過(guò)量施用的情況，因此盾殼霉與高濃度化肥直接接觸的概率較大，因此需要篩選對(duì)磷肥具有一定抗逆性的盾殼霉菌株。

2.2紫外誘變及JN-CM突變菌株的篩選

經(jīng)過(guò)紫外誘變后，在加藥平板上挑出盾殼霉單菌落接種到PDA平板，去除生長(zhǎng)較慢，不產(chǎn)孢子的菌株，每種挑選一株抗逆性菌株，分別命名為UV-G(草甘膦抗性)，UV-I(吡蟲(chóng)啉抗性)，UV-P(磷肥抗性)。

2.3抗性菌株遺傳穩(wěn)定性

將抗性株UV-G、UV-I和UV-P在PDA平板上連續(xù)傳代8次，然后涂布到含藥平板(最小全抑制濃度)上，測(cè)定各菌株孢子萌發(fā)率，以菌株JN-CM為對(duì)照。結(jié)果顯示，對(duì)照菌株孢子不能萌發(fā)，而各抗性株的孢子可正常萌發(fā)，且萌發(fā)率均在80%以上(數(shù)據(jù)未給出)，表明抗性可以穩(wěn)定遺傳。

2.4抗性株和對(duì)照株JN-CM的比較

2.4.1菌絲生長(zhǎng)情況及菌絲干重的比較

測(cè)定菌株UV-G、UV-I、UV-P和JN-CM在無(wú)選擇壓力條件下的生長(zhǎng)速率和菌絲干重。如圖2所示，菌株UV-P菌絲生長(zhǎng)最快，UV-I則比對(duì)照株生長(zhǎng)的慢。在菌絲干重方面，各菌株間差別不大。這說(shuō)明在無(wú)選擇壓力條件下，各抗性菌株生長(zhǎng)能力與對(duì)照株JN-CM相比無(wú)明顯差異。

圖1　各農(nóng)藥和化肥的最小全抑制濃度

2.4.2孢子萌發(fā)率的比較

取各抗逆性菌株的孢子懸液100 μL(106CFU/mL)涂布PDA平板，測(cè)定24 h、36 h和48 h的孢子萌發(fā)率，以菌株JN-CM作為對(duì)照。結(jié)果如圖3所示，雖然在萌發(fā)初期(24 h)，JN-CM的孢子萌發(fā)率要高于其他突變菌株，但到36 h時(shí)，各菌株的孢子萌發(fā)率相差不多，48 h各菌株的萌發(fā)率已經(jīng)基本一致，均達(dá)到95%以上，表明各菌株在萌發(fā)上并沒(méi)有明顯區(qū)別。

圖2　各菌株生長(zhǎng)情況比較

圖3　各菌株的萌發(fā)率比較

2.4.3與侵染相關(guān)的酶的活性

利用MCD培養(yǎng)基液體培養(yǎng)對(duì)抗性株和對(duì)照株6 d，發(fā)酵液離心取上清為粗酶液，分別測(cè)定酶活。結(jié)果如圖4所示，UV-I和UV-P菌株在各侵染相關(guān)酶活性方面都與對(duì)照菌株JN-CM相差不多，在蛋白酶和葡聚糖酶活性上甚至超過(guò)了JN-CM菌株，表現(xiàn)出了較高的活性。而UV-G菌株在酶的活性上都要略低于對(duì)照菌株，但是從數(shù)值上看，兩者差距很小。

圖4　各菌株與侵染相關(guān)酶的活性比較

3　結(jié)果與討論

由于在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，農(nóng)民往往會(huì)將盾殼霉與農(nóng)藥或化肥混合施用以降低使用成本，因此，考察盾殼霉對(duì)多種常用農(nóng)藥和化肥的耐受性，并篩選相應(yīng)的抗性菌株，對(duì)盾殼霉的推廣應(yīng)用具有現(xiàn)實(shí)意義。研究表明，除草劑草甘膦，殺蟲(chóng)劑吡蟲(chóng)啉以及磷肥對(duì)盾殼霉菌株JN-CM的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)有顯著影響。對(duì)菌株JN-CM進(jìn)行紫外誘變，篩選得到3株具有穩(wěn)定抗逆性的突變菌株。UV-G、UV-I和UV-P三種菌株都具有良好的菌絲生長(zhǎng)情況，突變并沒(méi)有造成明顯影響，同時(shí)在孢子萌發(fā)方面，雖然突變菌株在前期萌發(fā)上低于對(duì)照J(rèn)N-CM菌株，但是在到達(dá)36 h后已經(jīng)處在同一水平，萌發(fā)率均在95%以上。UV-G菌株幾種侵染相關(guān)酶的活性要略低于對(duì)照，但是在數(shù)值上相差不多，仍然具有良好的活性。UV-I和UV-P菌株則具有更好的酶活性，分別在蛋白酶和葡聚糖酶活性方面要高于JN-CM菌株。

篩選得到的抗性突變株，可和上述試驗(yàn)中采用的農(nóng)藥及化肥混合施用，從而增加對(duì)菌核病的防效，并減少勞動(dòng)成本，具有良好的應(yīng)用前景。

[1]Bolangd GJ，Hall R．Index of plant hosts of Sclerotinia sclerotiorum[J]．Canadian Journal of Plant Pathology，1994，16(2)：93-108.

[2]Godoy G，Steadman JR，Dickman MB，etal．Use of mutants to demonstrate the role of oxalic acid in pathogenicity of Sclerotinia sclerotiorum on Phaseolus vulgaris [J]．Physiological & Molecular Plant Pathology，1990，37(3): 179-191．

[3]王道本．核盤(pán)菌論叢[M]．北京：北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1986.

[4]Campbell WA．A new species ofConiothyriumparasitc on sclerotia[J]．Mycologia，1947，39(2): 90-195．

[5]Huang HC，Hoes JA．Penetration and infection of Sclerotinia sclerotiorum byConiothyriumminitans. Can[J]．Canadian Journal of Botany，2011，54(5-6): 406-410．

[6]繆華軍，李國(guó)慶．盾殼霉抗殺菌劑vinclozolin的誘變及突變體的生防潛力[J]．中國(guó)生物防治，2006，22(1): 73-77．

[7]Giczey G，Kerenyi Z，F(xiàn)ulop L，etal．Expression of cmg1，an exo-beta-1，3-glucanase gene fromConiothyriumminitans，increases during sclerotial parasitism[J]．Applied and environmental microbiology，2001，67(2): 865-71.

[8]楊龍．生防菌盾殼霉防治油菜菌核病的生態(tài)學(xué)基礎(chǔ)及其應(yīng)用研究[D]．華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009．

[9]周光明，王光，王嬡等．紫外誘變育種在瘤胃厭氧真菌中的應(yīng)用效果研究[J]．中國(guó)草食動(dòng)物科學(xué)，2013，33(4): 33-35．

[10]王慶云，韓巨才．盾殼霉寄生核盤(pán)菌過(guò)程中葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶及電導(dǎo)率的變化[J]．山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，26(1): 22-23．

[11]夏森玉，雷楗勇，金堅(jiān)等．生防菌盾殼霉抗藥性突變菌株的選育[J]．工業(yè)微生物，2013，43(5): 57-62.

[12]劉旭艷．生防真菌盾殼霉抗殺菌劑菌核凈的誘變及其抗性機(jī)制分析[D]．武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009．

Breeding of stress resistance mutants about bio-control fungiConiothyriumminitans

JIN Qiang1， DUAN Zuo-ying2， XIA Sen-yu3， SHEN Zhi-song3， LI Hua-zhong2， JIN Jian1

1. School of Pharmaceutical Sciences，Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China; 2. Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education,School of Biotechnology, Wuxi, Jiangsu 214122, China； 3. Wuxi Jiannong Biological technology co., LTD, Wuxi, Jiangsu 214122, China

Tolerance of wild-typeConiothyriumminitansstrain JN-CM were determined to selected pesticides and fertilizer. The results indicated that glyphosate, imidacloprid and phosphate fertilizer had significant inhibitory effects on the strain. Then the mutant stain with a certain degree of tolerance of glyphosate, imidacloprid and phosphate fertilizer were successfully screened through ultraviolet mutagenesis and named as glyphosate (UV-G), imidacloprid (UV-I) and phosphate fertilizer (UV-P), respectively. Three mutant strains had good genetic stability. Mutants had no significant differences between ability of growth and infection-associated enzyme activity if compared with those of wild-type strain，which showed their good application prospects.

Coniothyriumminitans; mutant strain; ultraviolet mutagenesis

10.3969/j.issn.1001-6678.2016.04.002

2015江蘇省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(現(xiàn)代農(nóng)業(yè))重點(diǎn)項(xiàng)目(BE2015309)。

金強(qiáng)(1991～)，男，碩士研究生。E-mail：jinqiang19@126.com。

金堅(jiān)，男，教授，博士生導(dǎo)師。Tel：0510-85918219，E-mail：jinjian31@126.com。