氟哌啶醇抑制cuprizone誘導(dǎo)脫髓鞘小鼠鞘損修復(fù)

吳錫艷 陳 東 汪 云 李成仁 王晗知肖 嵐

（第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部組織胚胎學(xué)教研室，重慶 400038）

?

論 著

氟哌啶醇抑制cuprizone誘導(dǎo)脫髓鞘小鼠鞘損修復(fù)

吳錫艷 陳 東 汪 云 李成仁 王晗知*肖 嵐

（第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部組織胚胎學(xué)教研室，重慶 400038）

目的 觀察非典型性抗精神病藥氟哌啶醇對cuprizone誘導(dǎo)脫髓鞘小鼠髓鞘修復(fù)的影響，探討腦白質(zhì)損傷在精神分裂癥病理機(jī)制中的作用。方法 利用cuprizone喂食C57Bl/6小鼠建立脫髓鞘小鼠模型，采用快藍(lán)染色、免疫組織化學(xué)等方法檢測各組髓鞘變化，觀察氟哌啶醇對髓鞘修復(fù)的作用。結(jié)果 成功建立cuprizone誘導(dǎo)的脫髓鞘小鼠模型，0.2%cuprizone攝入6周胼胝體脫髓鞘損傷達(dá)到最大；停藥后髓鞘自發(fā)性修復(fù)，3周后幾乎恢復(fù)正常水平；在髓鞘修復(fù)同時給予氟哌啶醇，可以推遲髓鞘的自發(fā)性修復(fù)。結(jié)論 氟哌啶醇抑制髓鞘的修復(fù)再生，這可能是氟哌啶醇加重精神分裂癥患者陰性癥狀的原因之一。

少突膠質(zhì)細(xì)胞；脫髓鞘；髓鞘修復(fù)；氟哌啶醇；精神分裂癥

精神分裂癥是一組病因未明的重性精神疾病，全球發(fā)病率為0.4%～1%［1］，是最常見的精神疾病。由于精神分裂癥的病因未明，目前對精神分裂癥的一線治療主要依靠使用抗精神病藥物。典型性抗精神病藥，如氟哌啶醇（haloperidol，HAL），其藥理機(jī)制主要通過抑制多巴胺D2類受體發(fā)揮作用，能有效改善精神分裂癥的陽性癥狀，如幻覺、妄想、思維及語言的混亂等，但往往加重如情感淡漠、語言匱乏、快感缺乏等陰性癥狀以及認(rèn)知障礙［2］，導(dǎo)致患者停藥而引起病情的反復(fù)。

在對精神分裂癥的發(fā)病機(jī)制研究中，發(fā)現(xiàn)精神分裂癥的陰性癥狀/認(rèn)知障礙可能與白質(zhì)異常密切有關(guān)［3］。大腦白質(zhì)主要由少突膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生髓鞘膜包裹軸突形成，少突膠質(zhì)細(xì)胞可能參與精神分裂癥病理機(jī)制。慢性給予HAL或奧氮平的恒河猴中，均可觀察到星形膠質(zhì)細(xì)胞以及少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目的減少［4］；而我們之前的研究也發(fā)現(xiàn)，HAL可以促進(jìn)胼胝體區(qū)NG2+細(xì)胞活化增殖，即對少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞（oligodendrocyte precursor cells，OPCs）的增生有促進(jìn)作用［5-7］，提示HAL對髓鞘損傷修復(fù)的作用可能與其藥效密切相關(guān)。

本實驗旨在利用cuprizone誘導(dǎo)的特異性脫髓鞘模型，了解典型性抗精神病藥HAL對髓鞘修復(fù)的影響，并應(yīng)用Luxol快藍(lán)-過碘酸-希夫染色（LFB-PAS）組織化學(xué)、髓鞘堿性蛋白MBP免疫組織化學(xué)等不同方法檢測髓鞘修復(fù)情況，以期明確抗精神病藥對腦白質(zhì)損傷修復(fù)的影響，為少突膠質(zhì)細(xì)胞的退變可能參與精神分裂癥病理生理過程的闡明提供神經(jīng)藥理學(xué)實驗依據(jù)。

材料和方法

1 實驗動物及主要試劑

1.1 動物

6～8周齡C57Bl/6雄性小鼠，由第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。所有動物飼育于恒溫環(huán)境，12h明暗晝夜循環(huán)。飼料如常喂養(yǎng)，每周稱量體重。

1.2 試劑

山羊抗MBP多克隆抗體，1：200（Santa Cruz）；驢抗山羊IgG-HRP，1：200（DAKO）；DAB試劑盒（Boster，China）顯色。

2 動物分組及模型制備

2.1 Cuprizone脫髓鞘模型建立

實驗分組：含0.2%cuprizone（w/w）飼料飼育6周，分別于6周和9周取材，每組動物6只；每個平行時間點取正常飼料飼育動物，每組動物6只（圖1A）。

2.2 氟哌啶醇對cuprizone脫髓鞘后修復(fù)的影響

藥物投放于飲水中以代替動物每日飲水。與多次注射相比，飲水能有效降低動物的應(yīng)激反應(yīng)以及神經(jīng)肌肉損害。

對照組（CTL）：正常飼料及飲水飼育8周；cuprizone+溶媒組（CPZ+Veh）：含cuprizone飼育6周后恢復(fù)正常飼料及飲水2周；cuprizone+氟哌啶醇組（CPZ+HAL）：cuprizone飼育6周后，恢復(fù)正常飼料，同時飲水中加入氟哌啶醇（2mg/kg/day），飼育2周；每組動物6只。

3 實驗方法

3.1 組織準(zhǔn)備

腹腔注射戊巴比妥鈉（10mg/kg體重）后，從左心室灌注生理鹽水沖洗血管，隨后用4%多聚甲醛（PFA）固定，至全身僵硬，小心剝?nèi)∧X組織，4%PFA后固定，4℃過夜；30%蔗糖脫水，4℃過夜。標(biāo)本用OCT包埋后冰凍切片機(jī)連續(xù)冠狀切片，片厚25μm，切片范圍從前囟點 -1.70mm至-2.46mm（根據(jù)Paxinos&Franklin著小鼠大腦圖譜）。切片放于冰凍保護(hù)液中于4oC保存。

3.2 LFB-PAS染色

將大腦切片裱在鉻釩明膠包被的載玻片上，置于60℃烤箱烤片2h。浸入1：1酒精/氯仿溶液中脫脂24 h，95%酒精脫水；置于Luxol快藍(lán)染液中染色56℃8 h（不超過16 h）；95%酒精洗滌多余染色，雙蒸水漂洗，碳酸鋰溶液分色30s，70%酒精繼續(xù)分色30s；反復(fù)雙蒸水漂洗，顯微鏡下觀察正常對照切片，直至灰質(zhì)部分與白質(zhì)清晰區(qū)分。分色完全后，切片置于雙蒸水中。置于Schiff試劑15min，切片變成淺粉紅色，自來水清洗5min，切片變?yōu)榘捣奂t色；蘇木精復(fù)染1min，自來水沖洗5min。95%酒精至100%酒精脫水，2次，每次5min，二甲苯透明，中性樹脂封片。

3.3 免疫組織化學(xué)染色

冰凍切片置于0.3%過氧化氫-甲醇中封閉15min。0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗3次，每次5min。0.3%Triton X-100及0.5% 牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉1h。滴加0.2%BSA/0.01mol/ L PBS稀釋的第一抗體，置于濕盒內(nèi)孵育4℃過夜。HRP酶標(biāo)記第二抗體2h。漂洗后DAB試劑盒（Boster，China）顯色，顯微鏡下觀察，適時終止反應(yīng)，終產(chǎn)物為棕褐色沉淀。Olympus BX51顯微鏡觀察、記錄。

免疫反應(yīng)結(jié)果通過計算機(jī)軟件Image Pro Plus進(jìn)行定量分析。

4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS11.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

正常對照組大腦冠狀切片經(jīng)LFB-PAS染色后，灰質(zhì)復(fù)染為紅色，白質(zhì)呈藍(lán)色，境界清晰，胼胝體染成深藍(lán)色，與周圍結(jié)構(gòu)區(qū)分明顯（圖1B）。對白質(zhì)束集中的胼胝體區(qū)的觀察發(fā)現(xiàn)，第6周時，整個胼胝體藍(lán)染的區(qū)域幾乎消失殆盡，表明胝體區(qū)域脫髓鞘作用達(dá)到最大；而第9周即停藥3周后，髓鞘自發(fā)性恢復(fù)接近正常水平；大腦胼胝體MBP染色的光密度值變化與LFB結(jié)果趨勢相同（圖1 B）。由此表明cuprizone誘導(dǎo)的脫髓鞘模型成功建立。

停藥后，cuprizone對髓鞘的損傷作用消失，髓鞘以自我修復(fù)為主，快藍(lán)染色可見CPZ+Veh組胼胝體區(qū)有藍(lán)染，說明髓鞘開始修復(fù)。但CPZ+HAL組與CPZ+Veh組相比，藍(lán)染較淺（圖2 A）；比較胼胝體MBP免疫組織化學(xué)染色的平均光密度值，CPZ+ HAL組的MBP染色強(qiáng)度明顯低于CPZ+Veh組，提示HAL可能影響髓鞘自發(fā)性修復(fù)（圖2 B）。

圖1　Cuprizone誘導(dǎo)脫髓鞘小鼠模型制備。A，實驗分組示意圖，箭頭所示為取材時間點；B，cuprizone誘導(dǎo)的脫髓鞘及髓鞘修復(fù)模型中Luxol快藍(lán)染色及MBP免疫組織化學(xué)染色，圖片所示均為胼胝體區(qū)；標(biāo)尺，100μmFig.1 Establishment of cuprizone-induced demyelin mouse model.A，schematic diagram displaying the experimental protocol；arrows showing sacrifiedtime point.B，Luxol fast blue and MBP immunostaining for cuprizone-induced demyelin and remyelin models in corpus callosum area；Scale bar，100μm

圖2　Hal對脫髓鞘小鼠髓鞘修復(fù)的影響。A，各組Luxol快藍(lán)染色及MBP免疫組織化學(xué)染色，圖片所示均為胼胝體區(qū)；B，MBP免疫反應(yīng)性統(tǒng)計學(xué)分析；標(biāo)尺，200μm；*，與 CTL比較，0.01＜P＜0.05；△，與 CPZ+Veh比較，0.01＜P＜0.05Fig.2 Effect of haloperidol on remyelination in cuprizone-induced demyelin mouse.A，Luxol fast blue and MBP immunostaining for mediolateral area of the corpus callosum of the mice.B，statistic analysis of MBP immunoreactivity in the corpus callosum of indicated groups；scale bar，200μm；*，0.01＜P＜0.05，compared with CTL group；△，0.01＜P＜0.05，compared with CPZ+Veh group

討 論

精神分裂癥是最常見的精神疾病，然而其病因至今不明。本研究通過觀察典型性抗精神病藥物HAL對髓鞘修復(fù)的影響，進(jìn)一步證明其對陰性癥狀/認(rèn)知障礙的副作用可能與其對白質(zhì)的影響有關(guān)。

C57BL/6小鼠在攝食中摻入cuprizone是經(jīng)典的脫髓鞘模型，可以誘導(dǎo)多個大腦腦區(qū)高度可修復(fù)的脫髓鞘病變［8］。在5～6周的cuprizone處理之后，小鼠胼胝體區(qū)脫髓鞘作用達(dá)到最大化，這個過程稱之為“急性脫髓鞘”。接下來幾周小鼠恢復(fù)正常飼料，將會出現(xiàn)自發(fā)性的完全性的髓鞘修復(fù)。相反，cuprizone處理時間延長（12周或者更久），髓鞘修復(fù)能力則明顯受限，這一過程稱為“慢性脫髓鞘”。通過掌控給予cuprizone的時間，能夠使動物在急性脫髓鞘后髓鞘重新恢復(fù)，因此這種模型尤其適合于髓鞘脫失及再生機(jī)制的研究，同時該模型還具有價格低廉，易于維持等優(yōu)點。目前文獻(xiàn)證實，髓鞘損傷的動物可以表現(xiàn)類似人類精神分裂癥的行為學(xué)表型［9］。攝入含cuprizone的大鼠在注意力轉(zhuǎn)移實驗（前額葉皮層行為學(xué)量表）中表現(xiàn)出特定的認(rèn)知障礙［10］。前額葉皮層是被認(rèn)為完成高級認(rèn)知任務(wù)的主要部分，它執(zhí)行著如計劃和問題解決等高級的認(rèn)知和功能。前額葉皮層行為學(xué)量表也被公認(rèn)為威斯康辛卡片分類測驗（WCST）的動物學(xué)模型，而已知精神分裂癥患者往往能通過WCST發(fā)現(xiàn)異常。由于胼胝體向來被看作腦白質(zhì)損傷的指示劑，在本研究中，我們通過LFB組織學(xué)染色和MBP免疫組織化學(xué)染色兩種方法確認(rèn)胼胝體髓鞘脫失變化，兩種方法結(jié)果同步顯示了實驗動物的脫髓鞘以及自發(fā)性髓鞘再生的改變，在連續(xù)給予cuprizone 6周后，動物胼胝體區(qū)髓鞘脫失明顯，恢復(fù)正常飼料3周后髓鞘幾乎恢復(fù)如常，與之前文獻(xiàn)報道相符［8］，表明cuprizone誘導(dǎo)的小鼠脫髓鞘模型成功建立。

HAL是典型性抗精神病藥，對精神分裂癥陽性癥狀的改善效果顯著，但是卻無法改善甚至反而加重陰性癥狀［11］。目前，已有文獻(xiàn)證實，精神分裂癥陰性癥狀與白質(zhì)異常改變明顯相關(guān)［12，13］，而精神分裂癥陰性癥狀/認(rèn)知障礙往往與白質(zhì)病理改變密切關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果從另一個方面證明了HAL對白質(zhì)損傷的作用可能在于通過阻止髓鞘修復(fù)再生能力。這一結(jié)果為HAL與精神分裂癥陰性癥狀之間的關(guān)系提供了進(jìn)一步的證據(jù)，意味著少突膠質(zhì)細(xì)胞在精神分裂癥發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用，而HAL可能是通過改變少突膠質(zhì)細(xì)胞功能而影響精神分裂癥陰性癥狀。HAL作為抗精神病藥，廣泛用于拮抗紋狀體的多巴胺D2受體家族，減輕大腦邊緣葉和黑質(zhì)通路的多巴胺能神經(jīng)遞質(zhì)作用。但是，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)多巴胺受體同樣表達(dá)于非神經(jīng)細(xì)胞。不成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞表達(dá)D3受體，而成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞特異表達(dá)D2受體［14］，D2/D3受體均屬于D2受體家族［15］，這意味著多巴胺可能與少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育有關(guān)。D3R激動劑Quipirole可以促進(jìn)OPCs細(xì)胞分化成為較為成熟的A2B5+細(xì)胞［14］，而HAL可能通過阻斷D3R從而抑制了少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞的分化形成髓鞘的能力［16］。因此，HAL對髓鞘修復(fù)的抑制效應(yīng)也許通過D3R途徑完成。我們前期實驗發(fā)現(xiàn)典型性抗精神病藥HAL可活化正常成年小鼠腦內(nèi)OPCs［5，6］。同時我們還發(fā)現(xiàn)，另一類非典型性抗精神病藥喹硫平（quetiapine，QUE）可以促進(jìn)OPCs發(fā)育和分化，并且預(yù)先QUE處理的脫髓鞘模型小鼠可以明顯減少髓鞘損傷［17，18］。因此可以認(rèn)為非典型性抗精神病藥QUE對脫髓鞘損傷有預(yù)防作用，而QUE被認(rèn)為對精神分裂癥認(rèn)知障礙有非常顯著的治療療效［19］。以上研究提示抗精神病藥在脫髓鞘修復(fù)中扮演了一定的角色，這可能是其發(fā)揮抗精神病作用的藥理學(xué)機(jī)制之一，并且不同種類抗精神病藥物，通過作用的不同受體，對少突膠質(zhì)細(xì)胞/髓鞘效果不盡相同。

由此可見，白質(zhì)的改變可能是抗精神病藥的作用靶點之一，而HAL對髓鞘再生的抑制作用，可能是HAL加重精神分裂癥患者陰性癥狀/認(rèn)知障礙的原因。本研究同時也為少突膠質(zhì)細(xì)胞的退變可能參與了精神分裂癥病理生理過程的闡明提供了神經(jīng)藥理學(xué)實驗依據(jù)。

［1］Millier A，Schmidt U，Angermeyer MC，et al.Humanistic burden in schizophrenia:a literature review.J Psychiat Res，2014，54:85-93.

［2］Murphy BP，Chung YC，Park TW，et al.Pharmacological treatment of primary negative symptoms in schizophrenia:a systematic review.Schizophr Res，2006，88（1-3）:5-25.

［3］Bijanki KR，Hodis B，Magnotta VA，et al.Effects of age on white matter integrity and negative symptoms in schizophrenia.Schizophr Res，2015，161（1）:29-35.

［4］Konopaske GT，Dorph-Petersen KA，Sweet RA，et al.Effect of chronic antipsychotic exposure on astrocyte and oligodendrocyte numbers in macaque monkeys.Biol Psychiatry，2008，63（8）:759-765.

［5］Niu J，Mei F，Li N，et al.Haloperidol promotes proliferation but inhibits differentiation in rat oligodendrocyte progenitor cell cultures.Biochem Cell Biol，2010，88（4）:611-620.

［6］Wang H，Xu H，Niu J，et al.Haloperidol activates quiescent oligodendroglia precursor cells in the adult mouse brain.Schizophr Res，2010，119（1-3）:164-174.

［7］李彩紅，江霞，喻志源，等.ROCK特異性抑制劑Y27632對缺氧后少突膠質(zhì)前體細(xì)胞分化的影響.中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2014，23（3）:211-216.

［8］Zendedel A，Beyer C，Kipp M.Cuprizone-induced demyelination as a tool to study remyelination and axonal protection.J Mol Neurosci:MN，2013，51（2）:567-572.

［9］Xu H，Yang HJ，McConomy B，et al.Behavioral and neurobiological changes in C57BL/6 mouse exposed to cuprizone:effects of antipsychotics.Front Behav Neurosci，2010，4（Article 8）:1-10.

［10］Gregg JR，Herring NR，Naydenov AV，et al.Downregulation of oligodendrocyte transcripts is associated with impaired prefrontal cortex function in rats.Schizophr Res，2009，113（2-3）:277-287.

［11］Murphy BP，Chung YC，Park TW，et al.Pharmacological treatment of primary negative symptoms in schizophrenia:a systematic review.Schizophr Res，2006，88（1-3）:5-25.

［12］Sigmundsson T，Suckling J，Maier M，et al.Structural abnormalities in frontal，temporal，and limbic regions and interconnecting white matter tracts in schizophrenic patients with prominent negative symptoms.Am J Psychiatry，2001，158（2）：234-243.

［13］Zetzsche T，Preuss UW，F(xiàn)rodl T，et al.White matter alterations in schizophrenic patients with pronounced negative symptomatology and with positive family history for schizophrenia.Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci，2008，258（5）：278-284.

［14］ BongarzoneER，HowardSG，SchonmannV，et al.Identification of the dopamine D3 receptor in oligodendrocyte precursors：potential role in regulating differentiation and myelin formation.J Neurosci，1998，18（14）：5344-5353.

［15］Missale C，Nash SR，Robinson SW，et al.Dopamine receptors：from structure to function.Physiol Rev，1998，78（1）：189-225.

［16］Islam MS，Tatsumi K，Okuda H，et al.Olig2-expressing progenitor cells preferentially differentiate into oligodendrocytesincuprizone-induceddemyelinatedlesions.Neurochem Int，2009，54（3-4）：192-198.

［17］Xiao L，Xu H，Zhang Y，et al.Quetiapine facilitates oligodendrocyte development and prevents mice from myelin breakdown and behavioral changes.Mol Psychiatry，008，13（7）：697-708.

［18］Zhang Y，Xu H，Jiang W，et al.Quetiapine alleviates the cuprizone-induced white matter pathology in the brain of C57BL/6 mouse.Schizophr Res，2008，106（2-3）：182-191.

［19］Robles O，Zabala A，Bombin I，et al.Cognitive efficacy of quetiapine and olanzapine in early-onset first-episode psychosis.Schizophr Bull，2011，37（2）：405-415.

Haloperidol inhibits the remyelination of cuprizone-induced demyelination in mice

Wu Xiyan，Chen Dong，Wang Yun，Li Chengren，Wang Hanzhi*，Xiao Lan
（Department of Histology and Embryology，Third Military Medical University，Chongqing 400038，China）

Objective To clarify the role of white matter dysfunction in the pathophysiology of schizophrenia through examination of the effect of the antipsychotic haloperidol on remeyeliantion in the mouse model of cuprizone-induced demyelination.Methods The C57Bl/6 mouse model of demyelination was established by using a diet supplemented with 0.2%cuprizone.Luxol fast blue staining and MBP immunostaining were used to detect demyelination and remyelination in the model mice treated with or without haloperidol.Results The loss of myelin was more pronounced in mice fed with 0.2%cuprizone for 6 weeks.Spontaneous remyelination was observed in the subsequent 3 weeks after cuprizone withdrawal，while haloperidol delayed the progress of the spontaneous remyelination. Conclusion Haloperidol inhibits the remyelination of the white matter lesion，which may be one of the mechanisms underlying the effect of haloperidol exacerbating negative symptoms of schizophrenia.

oligodendrocyte；remyelination；haloperidol；schizophrenia

R749.3

A

10.16705/j.cnki.1004-1850.

2016-02-18 〔修回日期〕2016-03-31

國家自然基金（青年基金）資助項目（31000482）

吳錫艷，女（1979年），漢族，碩士

（To whom correspondence should be addressed）：wang.hanzhi@foxmail.com