H102對轉(zhuǎn)基因AD小鼠腦內(nèi)NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的影響*

王 超，袁小涌，孫鳳仙，蔣 方，徐淑梅

H102對轉(zhuǎn)基因AD小鼠腦內(nèi)NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的影響*

王 超，袁小涌，孫鳳仙，蔣 方，徐淑梅△

（天津醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室，天津300070）

目的:研究β片層阻斷肽H102對轉(zhuǎn)基因AD小鼠腦內(nèi)NF-κB通路相關(guān)蛋白活性及表達的影響。方法: 將30只8周齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠隨機分為模型組和給藥組，另選15只同周齡同背景的C57BL/6J小鼠設(shè)為對照組（n=15）。給藥組每日經(jīng)鼻腔給予H102溶液5μl（5.8mg/kg），對照組和模型組每日給予等量空白輔料溶液。給藥16周后，采用Morris水迷宮檢測小鼠的空間參考記憶變化，采用免疫組織化學(xué)方法和免疫印跡技術(shù)測定小鼠腦組織內(nèi)β樣淀粉樣蛋白（Aβ1-42）、核因子-κB（NF-κB）、核因子-κB抑制蛋白（IκB）、IκB蛋白激酶（IKK）及其磷酸化蛋白（p-NF-κB、p-IκB、p-IKK）以及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）和活化型半胱天冬酶-3（cleaved Caspase 3）蛋白的表達。結(jié)果:①Morris水迷宮測試:模型組小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力較對照組顯著降低，給藥組較模型組顯著提高（P＜0.05）。②免疫組化及免疫印跡檢測結(jié)果:模型組小鼠腦組織內(nèi)Aβ1-42、p-IKK、p-NF-κB、p-IκB、核內(nèi)NF-κB及iNOS和cleaved Caspase 3蛋白的表達較對照組顯著增高，給藥組蛋白表達較模型組顯著降低（P＜0.05）。結(jié)論:H102可抑制APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制細胞凋亡和炎癥反應(yīng)，明顯改善轉(zhuǎn)基因AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

阿爾茨海默病；小鼠，轉(zhuǎn)基因 ；H102；NF-κB信號通路；

【DOI】10.13459/j.cnki.cjap.2016.03.001

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's Disease，AD）是一種神經(jīng)退行性疾病，其病因及發(fā)病機制尚未完全闡明。目前，β樣淀粉樣蛋白（amyloid beta-protein，Aβ）級聯(lián)假說被廣泛接受為AD發(fā)病機制的核心［1］。大量的研究表明Aβ的神經(jīng)毒性在AD的發(fā)病中起到關(guān)鍵性作用。而Aβ的神經(jīng)毒性與其β折疊所導(dǎo)致的聚集和沉積有關(guān)，因此抑制Aβ的聚集成為治療AD的一個重要途徑。β片層阻斷肽是一類專門針對Aβ設(shè)計并合成的多肽，能夠抑制Aβ錯誤折疊和聚集，阻斷其神經(jīng)毒性，是一類新型的治療老年癡呆的候選藥物［2，3］。本課題組前期研究已經(jīng)證實經(jīng)鼻腔給于H102一個月可明顯減少模型小鼠腦內(nèi)Aβ的表達和聚集，抑制神經(jīng)細胞凋亡，改善其學(xué)習(xí)記憶能力［4］。

核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）作為廣泛存在的核轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控多種基因的表達，在機體免疫、炎癥和細胞增殖及凋亡中起著重要的調(diào)節(jié)作用。大量的研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB的激活與Aβ的神經(jīng)毒性作用相關(guān)，提示NF-κB在神經(jīng)退行性疾病中也起著重要作用。此外，經(jīng)尸檢也發(fā)現(xiàn)AD患者腦內(nèi)退行性變神經(jīng)元中NF-κB活性增強［5］。NF-κB的激活涉及IκB的磷酸化，而后者有賴于IKK的調(diào)控，IKK/IκB/NF-κB是一個有機聯(lián)系的系統(tǒng)。激活的NF-κB通過對相關(guān)基因和蛋白的調(diào)控，影響著細胞的凋亡和應(yīng)激。本研究旨在觀察AD病理情況下NF-κB活性的變化并探究β片層阻斷肽H102對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)NF-κB通路相關(guān)蛋白活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

8周齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠30只，同周齡同背景的C57BL/6J小鼠15只，雄性，體重（15.0± 1.6）g，SPF級，購自北京華阜康生物公司，飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學(xué)動物中心。β片層阻斷肽H102由上海吉爾生化有限公司合成，高效液相色譜法純化，經(jīng)質(zhì)譜儀（MS）分析鑒定純度＞95%，DAB顯色試劑盒、即用型SABC免疫組化試劑盒購于武漢博士德生物公司。核蛋白提取試劑盒購于Thermo Fisher Scientific公司，p-IKKβ（Ser180）、IKK、p-NF-κB（Ser536）、NF-κB、p-IκB（Ser32）、IκB及iNOS和cleaved caspase-3抗體均購自CST公司，Aβ1-42抗體購自BioLegend公司，β-actin抗體購自北京中杉金橋生物公司，H3抗體購于北京博奧森生物公司。

1.2 動物分組及給藥方法

采用隨機數(shù)字表法將APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠分為模型組和給藥組（n=15）。并設(shè)同周齡同背景C57BL/6J小鼠15只為對照組。給藥組每日經(jīng)鼻腔給予H102溶液（5.8mg/kg）5μl，對照組和模型組每日經(jīng)鼻腔給予空白輔料溶液（0.5%殼聚糖、0.1% BSA）5μl，每日同樣時間段給藥1次。

1.3 Morris水迷宮測試

連續(xù)給藥16周后，進行Morris水迷宮測試。（1）定位航行實驗:在水迷宮第三象限中央放置平臺，將小鼠從第一象限放入水中，記錄小鼠尋找并爬上平臺所需時間即逃避潛伏期，每天相同時段游泳訓(xùn)練2次，每次90 s，歷時5 d。（2）空間探索實驗:于水迷宮實驗的第6天撤去平臺，在相同時段將小鼠放入水中，讓其尋找記憶中的平臺，游泳1次，歷時90 s。記錄小鼠在原平臺所在象限停留時間（residence time in the third quadrant，RTQ）、跨越隱匿平臺的次數(shù)及游泳朝向角等指標，測試小鼠的記憶能力。

1.4 腦組織樣本的制備

Morris水迷宮測試結(jié)束后，用10%水合氯醛（4 ml/kg）對小鼠進行腹腔麻醉，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）灌注至肝肺透明。于冰上解剖，一半腦組織放入4%多聚甲醛溶液內(nèi)固定，一半腦組織分離海馬與皮質(zhì)放入液氮中備用。

1.5 免疫組織化學(xué)染色

甲醛固定后的腦組織制成海馬、皮質(zhì)相關(guān)區(qū)域冠狀切片，切片脫蠟后用3%H2O2室溫孵育15min，并用枸櫞酸緩沖液微波沸騰抗原修復(fù)。5%BSA室溫封閉15 min。之后滴加按一定比例稀釋的一抗（p-IKK 1∶400、p-NF-κB 1∶200、p-IκB 1∶200、iNOS 1∶200和cleaved Caspase 3 1∶800）工作液，4℃過夜。滴加適量生物素標記二抗工作液室溫避光孵育15 min，再用辣根酶標記物工作液室溫避光孵育15 min，DAB顯色劑顯色，鏡下控制染色時間，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。陰性對照組用PBS代替一抗進行免疫組化染色，其余步驟同上。在倒置顯微成像系統(tǒng)下觀察并拍攝切片相同層次海馬及皮質(zhì)，用IPP 6.0軟件對圖片累積光密度進行分析。

1.6 Western blot分析

于液氮中取出分離的海馬和皮質(zhì)組織，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度后調(diào)定各組蛋白為等濃度，加適量上樣緩沖液，煮沸變性3min。8%～20%分離膠電泳分離蛋白后濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上，膜用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入稀釋的一抗（Aβ1-421∶250、p-IKK 1∶1 000、IKK 1∶1 000、p-NF-κB 1∶500、NF-κB 1∶500、p-IκB 1∶1 000、IκB 1∶1 000及iNOS 1∶1 000 和cleaved Caspase 3 1∶500），4℃搖床過夜，加入稀釋的二抗（1∶5 000），室溫下孵育2 h，然后化學(xué)發(fā)光法曝光，用Quantity One軟件分析所得條帶的灰度值。使用試劑盒提取核蛋白，其余步驟同上，測定各組核內(nèi)NF-κB蛋白的含量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件處理數(shù)據(jù)，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析法。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮測試結(jié)果

2.1.1 逃避潛伏期 第2天起給藥組小鼠較模型組顯著縮短（P＜0.05）；與對照組相比，模型組逃避潛伏期始終高于對照組（P＜0.05）。除第1天和第4天外，給藥組與對照組無顯著性差異（圖1）。

Tab.1 Comparison of average escape latency in navigation testamong three groups ofmice（±s，n=15）

2.1.2 空間探索結(jié)果 模型組RTQ少于對照組（P ＜0.05），給藥組較模型組延長（P＜0.05）。模型組跨越隱匿平臺次數(shù)少于對照組，給藥組較模型組跨越次數(shù)增加，但仍少于對照組（P＜0.05）。模型組入水朝向角大于對照組（P＜0.05），給藥組較模型組減?。≒＜0.05，表1）。

Tab.1 Comparison of RTQ，numberof cross-hidden platform and the orientation angle in space exploration experiment among three groups ofmice（±s，n =15）

Tab.1 Comparison of RTQ，numberof cross-hidden platform and the orientation angle in space exploration experiment among three groups ofmice（±s，n =15）

RTQ:Residence time in the third quadrant*P＜0.05 vs control；#P＜0.05 vs model

（°）Control　25.33±6.91　3.20±1.61　32.52±23.71 Model　17.67±4.46*0.45±0.69*　65.97±36.53*Treatment　23.63±6.62#1.57±0.85*#38.91±25.36 Group　RTQ（s）　Number　Orientation angle #

Tab.2 NF-κB relevant proteins level（IOD）inmice brain（×104，±s，n=15）

Tab.2 NF-κB relevant proteins level（IOD）inmice brain（×104，±s，n=15）

**P＜0.01 vs control；#P＜0.05，##P＜0.01 vs model

Group　p-p-IκB Cortex Control　6.28±2.73　5.45±1.99　1.13±0.30　1.46±0.49　4.74±1.46　5.90±2.77 Model　27.30±4.60**　15.91±2.51**　7.10±1.03**　8.44±2.38*　15.20±3.14*　15.86±3.37*Treatment　10.76±3.69#　9.01±1.10#　1.43±0.67##　2.17±0.55#　4.21±0.90##　5.72±1.60 p-NF-κB IKK Hippocampus Cortex Hippocampus Cortex Hippocampus # NF-κB:Nuclear factor-kappa B*P＜0.05，**P＜0.01 vs control；#P＜0.05，##P＜0.01 vs model Tab.3 iNOSand cleaved caspase-3 proteins level（IOD）inmice brain（×104，±s，n=15）Group Cleaved Caspase 3 Cortex Control　4.95±1.43　5.40±1.93　0.70±0.16　0.93±0.20 Model　23.70±4.05**　24.20±4.85**　3.24±0.24**　5.33±0.47**Treatment　6.59±1.08##　12.79±2.41#　1.10±0.18##　1.50±0.44 iNOS Hippocampus Cortex Hippocampus ##

2.2 免疫組織化學(xué)法測定Aβ1-42及NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達

2.2.1 p-IKK、p-NF-κB及p-IκB的免疫組化檢測p-IKK、p-IκB和p-NF-κB蛋白存在于細胞胞漿和胞核，對照組海馬及大腦皮層陽性表達水平較低；模型組陽性表達水平顯著高于對照組，給藥組陽性表達水平較模型組降低（P＜0.05，圖2，表2，圖2見彩圖頁Ⅰ）。

2.2.2 iNOS和cleaved Caspase 3的免疫組化檢測iNOS和cleaved Caspase 3主要存在于胞漿，結(jié)果顯示對照組腦內(nèi)神經(jīng)細胞胞漿著色較淺，iNOS和cleaved Caspase 3蛋白的陽性表達水平較低；模型組腦內(nèi)陽性表達水平顯著高于對照組 ，給藥組陽性表達水平較模型組降低（P＜0.05，圖3，表3，圖3，見彩圖頁Ⅱ）。

2.3 Western blot測定Aβ1-42及NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達

2.3.1 Aβ1-42蛋白表達 結(jié)果顯示，對照組小鼠的Aβ1-42的表達量較少；與對照組比較，模型組小鼠Aβ1-42的表達量顯著增多（P＜0.01）；與模型組相比，給藥組明顯降低了AD小鼠腦內(nèi)Aβ1-42表達（P＜0.01）；給藥組與正常組相比較無顯著性差異（圖4，見彩圖頁Ⅱ）。

2.3.2 p-IKK、p-NF-κB、p-IκB及核內(nèi)NF-κB的相對表達 與對照組相比，模型組小鼠腦內(nèi)IKK、NF-κB 和IκB蛋白的磷酸化水平均高于對照組（P＜0.01），給藥組低于模型組（P＜0.05）。核內(nèi)NF-κB的含量，模型組顯著高于對照組（P＜0.01），給藥組低于模型組（P＜0.05，表4）。

2.3.3 iNOS和cleaved Caspase 3蛋白表達 與對照組相比，模型組小鼠腦內(nèi)iNOS和cleaved Caspase 3蛋白表達均高于對照組，給藥組低于模型組（P＜0.05，表5）。

Tab.4 Relative expression of NF-κB relevant proteins in hippocampus and cortex（±s，n=15）

Tab.4 Relative expression of NF-κB relevant proteins in hippocampus and cortex（±s，n=15）

**P＜0.01 vs control；##P＜0.01 vs model

?

Tab.5 Relative expression of iNOS and cleaved Caspase 3 protein in hippocampus and cortex（±s，n=15）

Tab.5 Relative expression of iNOS and cleaved Caspase 3 protein in hippocampus and cortex（±s，n=15）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control；#P＜0.05，##P＜0.01 vs model

?

Fig.4 Expressions of Aβ1-42 inmice brain after 16weeks（±s，n=15）

3 討論

AD是一個連續(xù)的疾病過程，其重要的病理學(xué)特征是Aβ沉積于腦內(nèi)所形成的老年斑（senile plaque，SP）。眾多證據(jù)表明Aβ聚集在AD的發(fā)病機制中起著關(guān)鍵性的作用，而Aβ二級結(jié)構(gòu)中β折疊的形成是聚集所必需的［6］。β片層阻斷肽H102可與Aβ1-42的疏水氨基酸結(jié)合形成復(fù)合物，抑制Aβ內(nèi)部β折疊的形成和β折疊間的相互結(jié)合，減少Aβ的聚集和沉積，從而抑制其下游的病理過程［2］。本實驗中，我們采用在模型小鼠尚未發(fā)生AD時，便開始給予H102進行早期干預(yù)。結(jié)果顯示，給藥組的學(xué)習(xí)記憶能力明顯高于模型組 ，且Aβ1-42水平顯著低于模型組，說明H102達到了預(yù)期的治療效果。

體外研究顯示，Aβ能激活培養(yǎng)神經(jīng)元中的NF-κB，促進炎癥因子的表達，從而發(fā)揮其神經(jīng)毒性作用［7］。另有研究證明，BACE1基因上含有NF-κB的結(jié)合位點，激活的NF-κB可使BACE1的表達增多，從而使 Aβ的沉積增多［8-10］。以上研究結(jié)果提示 ，NF-κB的過度激活在AD的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要作用。NF-κB是一種廣泛存在于真核細胞內(nèi)具有功能多向性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其激活機制是一個復(fù)雜的過程。雖然其機制尚未完全闡明，但研究最多的是依賴于IKK磷酸化的信號通路。即細胞處于靜息狀態(tài)時，NF-κB位于胞漿中，與NF-κB抑制蛋白IκB結(jié)合呈非活性狀態(tài)。當細胞受到外界信號刺激時，在IκB蛋白激酶IKK的作用下，IκB蛋白發(fā)生磷酸化，通過依賴于泛素/蛋白酶的途徑被降解，從而解除了IκB對NF-κB的抑制作用，NF-κB與IκB分離并移位進入細胞核，與靶基因的κB序列結(jié)合啟動多種基因的轉(zhuǎn)錄［11，12］。本實驗結(jié)果顯示，AD模型小鼠腦內(nèi)IKK活性顯著高于對照組，NF-κB被過度激活。給藥組p-IKK含量降低，NF-κB活性顯著低于模型組，提示H102可能具有減少NF-κB的過度激活的作用。

激活的NF-κB可促進iNOS、TNF-α和IL-1β等多種因子的表達，從而促進細胞的炎癥和凋亡。iNOS 是NOS的一種，能以L-精氨酸為底物，催化合成一氧化氮（NO）和瓜氨酸。生理性NO作為一種第二信使，在生命活動中發(fā)揮著重要生物學(xué)效應(yīng)。但激活的iNOS能夠催化合成大量的NO。致病性高水平的NO一方面能與含F(xiàn)e-S基團的線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ/Ⅱ以及DNA合成酶和連接酶等結(jié)合，破壞其活性；另一方面，能夠與氧負離子反應(yīng)，形成毒性較強的強氧化劑過氧亞硝基陰離子（ONOO-），從而促進蛋白質(zhì)和DNA氧化損傷、炎癥反應(yīng)和細胞凋亡。本實驗結(jié)果顯示AD轉(zhuǎn)基因模型小鼠腦內(nèi)iNOS的表達增多，反映在AD病理狀態(tài)下小鼠腦內(nèi)炎性反映較為明顯。給藥組iNOS的表達減少，提示H102可能具有降低iNOS合成的作用，從而減少NO的合成，降低腦內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)對神經(jīng)元的損害。

神經(jīng)元凋亡是AD發(fā)病過程中的重要環(huán)節(jié)之一。盡管有很多觸發(fā)凋亡的途徑，但最終絕大多數(shù)會通過天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白激酶家族（Caspases）級聯(lián)反應(yīng)。Caspase 3是Caspases級聯(lián)反應(yīng)中下游最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶，在各種程序啟動的凋亡程序中起最后樞紐的作用。NF-κB促進轉(zhuǎn)錄表達的TNF-α、IL-1β等因子能夠通過與膜上受體結(jié)合，誘導(dǎo)cleaved Caspase 3的表達上調(diào)。且本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，在AD模型小鼠腦內(nèi)TNF-α和IL-1β表達顯著增多，給藥組TNF-α和IL-1β表達顯著降低［13］。本實驗中也發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠腦內(nèi)活化的Caspase 3表達較高，給藥組小鼠腦內(nèi)活化Caspase 3蛋白表達下調(diào)，提示H102可能具有抑制Caspase 3過度活化的作用，進而發(fā)揮抗凋亡作用。研究表明，NF-κB一方面可通過誘導(dǎo)Bcl-2、IAPs等抗凋亡基因的表達，發(fā)揮其抗凋亡作用；另一方面，又可通過上調(diào)促凋亡基因如Caspases 11、Bax等基因的表達和與其他信號通路的相互作用 ，促進細胞凋亡［11］。結(jié)合本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在AD病理情況下，伴隨NF-κB活性的上調(diào)，小鼠腦內(nèi)抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2，Bcll表達顯著減少，而促凋亡相關(guān)蛋白Bad，Bax表達顯著增多，且TNF-α、IL-1β等細胞因子和iNOS表達也顯著增多［2，13］。這表明NF-κB在AD病理情況下，很可能主要起促炎促凋亡的作用。

綜上所述，H102能有效地減少AD模型小鼠腦內(nèi)Aβ的表達，減少β折疊的形成，提高AD模型鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，可能與其抑制NF-κB信號通路的激活，促使iNOS和活化的Caspase 3的表達下調(diào)有關(guān)。但由于NF-κB功能的多向性，其在AD的病理過程中所處的具體位置及作用，還有待進一步研究。

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The effects of H102 on NF-κB signal pathway in brain of transgenic AD mice

WANG Chao，YUAN Xiao-yong，SUN Feng-xian，JIANG Fang，XU Shu-mei△
（Departmentof Physiology，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China）

【ABSTRACT】Objective:To investigate the effects ofβ-sheetbreaker peptide H102 on NF-κB signal pathway in brain of APP/PS1 double transgenicmice.Methods:Thirty 8-week-old APP/PS1 double transgenicmicewere randomly divided intomodelgroup and treatmentgroup. A group of C57BL/6Jmicewith the same age and backgroundwere served as controls（n=15）.H102 5μl（5.8mg/kg）was infused by intranasal administration tomice in H102 treatmentgroup，and equal volume of blank solution of H102（chitosan，BSA）was given tomice in control group andmodelgroup.After 16 weeks，the ability of spatial referencememorywas tested by MorrisWaterMaze.Then immunohistochemistry tests and Western blot techniquewere used to detect the contentof amyloid beta peptide 1-42（Aβ1-42），nuclear factor-kappa B（NF-κB），inhibitor of NF-κB（IκB），IκB kinase（IKK），the corresponding phosphorylated proteins（p-NF-κB、p-IκB、p-IKK），inducible nitric oxide synthase（iNOS）and cleaved Caspase 3 proteins inmice brain.Results:①The ability of learning andmemorywas significantly lowered in model group than that in controlgroup.And theability of learning andmemorywassignificantly improved in treatmentgroup than that inmodel group（P＜0.05）.②The contentsof Aβ1-42，p-IKK，p-NF-κB，p-IκB，intranuclearNF-κB，iNOSand cleaved Caspase 3 inmousebrainwere significantly increased inmodel group than those of control group，and these protein expressionswere significantly lowered in treatmentgroup than those inmodelgroup（P＜0.05）.Conclusion:H102 can inhibitNF-κB signalpathway in brain of APP/PS1 double transgenicmice，reduce the levels of inflammation and apoptosis in nerve cells，and improve the ability of learning andmemory in transgenic ADmice.

Alzheimer disease； mice； transgenic； H102； NF-κB signal pathway

R338.8

A

1000-6834（2016）03-193-05

國家科技重大專項基金資助（2009ZX09103-029）；天津市科技支撐重點項目基金資助（09ZCKFSH00100）

2016-01-08

2016-02-11

Tel:13012268139；E-mail:xushm@tijmu.edu.cn