有機(jī)溶劑對(duì)樺褐孔菌液體深層發(fā)酵多酚和多糖的產(chǎn)生與活性的影響

沈夢(mèng)薇，全麗麗，徐向群

(浙江理工大學(xué)理學(xué)院，杭州 310018)

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有機(jī)溶劑對(duì)樺褐孔菌液體深層發(fā)酵多酚和多糖的產(chǎn)生與活性的影響

沈夢(mèng)薇，全麗麗，徐向群

(浙江理工大學(xué)理學(xué)院，杭州 310018)

在培養(yǎng)基中添加1g/L的不同有機(jī)溶劑(丙酮、甲醇、氯仿、甲苯和乙醇)，討論了有機(jī)溶劑對(duì)樺褐孔菌液體深層發(fā)酵多酚和多糖的產(chǎn)生的影響，并通過(guò)測(cè)定多酚的DPPH自由基清除率來(lái)探究有機(jī)溶劑對(duì)多酚抗氧化活性的影響。研究結(jié)果證明，添加有丙酮、甲苯與乙醇的培養(yǎng)基能顯著提高樺褐孔菌生物量，比對(duì)照組提高2.68%、2.27%和3.98%；以胞內(nèi)外多酚含量和活性為指標(biāo)，丙酮有機(jī)溶劑，胞內(nèi)、胞外乙酸乙酯層和胞外正丁醇層多酚的產(chǎn)量分別為對(duì)照組的2.5、5.3和1.7倍，相對(duì)應(yīng)的活性分別是對(duì)照組的1.3、1.3和3.0倍；以胞內(nèi)外多糖含量為指標(biāo)，有機(jī)溶劑均對(duì)胞外多糖有抑制作用，乙醇為最佳的添加劑使胞內(nèi)多糖(在95 ℃、121 ℃下提取)的增加率達(dá)到9.67%和15.20%。推測(cè)可能是有機(jī)溶劑能有效地促進(jìn)細(xì)胞膜的相容性，從而改變了細(xì)胞膜通透性，影響了細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。同時(shí)，不同有機(jī)溶劑又會(huì)對(duì)不同種類次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成產(chǎn)生不同的影響。

樺褐孔菌；多酚；有機(jī)溶劑；多糖；抗氧化活性

0　引　言

樺褐孔菌(Inonotusobliquus)是一類分布于北半球45～50°地區(qū)(我國(guó)主要集中在長(zhǎng)白山地區(qū)[1])的藥用真菌。幾個(gè)世紀(jì)以來(lái)，這類纖孔菌屬的白腐真菌素有“西伯利亞靈芝”之美稱，主要用于糖尿病、心血管疾病[2]等人類難于治愈的疾病。這歸因于此種真菌含有多種次級(jí)代謝產(chǎn)物，如多酚、多糖、三萜以及甾體等具有強(qiáng)活性的物質(zhì)。這些具有生物活性的物質(zhì)對(duì)降血糖、降血脂、肝病、抗菌治療以及抗癌治療有顯著的效果[3-4]。其中，樺褐孔菌合成的一部分酚類化合物(如小分子酚類[5]、水溶性單寧[6]、黃酮、多酚、黑色素[7]等)，都體現(xiàn)了良好的自由基清除能力[8-9]，進(jìn)而能夠減少氧化應(yīng)激導(dǎo)致的疾病。

由于天然樺褐孔菌的子實(shí)體生長(zhǎng)環(huán)境惡劣，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，產(chǎn)量小且不確定因素較多，次級(jí)代謝產(chǎn)物的獲取難上加難。近幾年，越來(lái)越多的學(xué)者[10-14]開(kāi)始研究液體深層發(fā)酵樺褐孔菌次級(jí)代謝產(chǎn)物，主要將注意力集中在培養(yǎng)基的配制。為了增加次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量以及菌絲體量，有機(jī)溶劑被證實(shí)為一種可以經(jīng)濟(jì)易得的可提高次級(jí)代謝產(chǎn)物和菌絲體量的有效添加劑[15]。當(dāng)有機(jī)溶劑加入到培養(yǎng)基并與細(xì)胞膜作用時(shí)，促進(jìn)了部分脂肪酶的產(chǎn)生，并釋放次級(jí)代謝產(chǎn)物[16]。通常選取的有機(jī)溶劑主要包括甲苯、甲醇、丙酮、乙醇等。氯仿、乙醇、甲苯等[17]已被證實(shí)對(duì)不同菌種的次級(jí)代謝產(chǎn)物有一定的促進(jìn)效果。本文在此基礎(chǔ)上探究培養(yǎng)基中有機(jī)溶劑的添加對(duì)樺褐孔菌液體深層發(fā)酵多酚、多糖產(chǎn)量及其DPPH自由基清除率的影響，篩選出最佳有機(jī)溶劑。

1　試驗(yàn)

1.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1實(shí)驗(yàn)原料

用于發(fā)酵的樺褐孔菌菌種購(gòu)于徐州師范大學(xué)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

試劑：DPPH、福林酚試劑等，購(gòu)于美國(guó)sigma公司；氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、乙醇、甲醇、甲苯(均為分析純)，購(gòu)于杭州高晶精細(xì)化工有限公司。

主要儀器：UV1100紫外分光光度計(jì)(上海美普達(dá))，SW-CJ-IF超凈臺(tái) 、YX-280高壓蒸汽滅菌鍋、SPX-250L生化培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，TG16-WS高速離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司)，Scientz-ⅡD超聲波破碎儀(浙江寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)中涉及到的培養(yǎng)基有液體種子培養(yǎng)基、發(fā)酵對(duì)照培養(yǎng)基、有機(jī)溶劑培養(yǎng)基。具體配比如下：

a) 液體種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨3，酵母浸膏2，KH2PO41，MgSO41.5，CaCl20.1，pH調(diào)至6.0，用蒸餾水定容至100 mL；

b) 對(duì)照培養(yǎng)基(g/L)：玉米粉53，蛋白胨3，KH2PO41，MgSO40.2，ZnSO4·7H2O 0.01，K2HPO4·3H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05，CuSO4·5H2O 0.02，CoCl2·6H2O 0.02，MnCl2·4H2O 0.09，同上；

c) 有機(jī)溶劑培養(yǎng)基(g/L)：有機(jī)溶劑 1，其余同對(duì)照培養(yǎng)基。

1.2.2液體種子的培養(yǎng)與液體發(fā)酵

按照液體種子培養(yǎng)基配制所需培養(yǎng)液。取出低溫保存的樺褐孔菌菌種，并將之在25 ℃的恒溫箱中振蕩搖勻20 min。紫外滅菌超凈臺(tái)，將搖勻后的液體種子接種至種子培養(yǎng)基中，并將其于搖床中(溫度為25 ℃，相對(duì)濕度為80%)進(jìn)行恒溫振蕩培養(yǎng)。4 d后，待種子長(zhǎng)滿80%左右的培養(yǎng)液后取出。

按照對(duì)照培養(yǎng)基配制培養(yǎng)液并按每100 mL培養(yǎng)液的體積注入250 mL錐形瓶中。然后將其繼續(xù)放入搖床進(jìn)行培養(yǎng)。在發(fā)酵9 d時(shí)，取出所有搖瓶，進(jìn)行后續(xù)分析。實(shí)驗(yàn)3次。有機(jī)溶劑培養(yǎng)基在對(duì)照培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上分別加入不同有機(jī)溶劑，其余操作方法同對(duì)照培養(yǎng)基。

1.2.3樺褐孔菌生物量的分析

取出搖床中的搖瓶，將菌絲體連同培養(yǎng)液通過(guò)抽濾的方法將之分離。反復(fù)沖洗菌絲體直至洗出液為無(wú)色，將菌絲體放置于培養(yǎng)皿中，恒溫干燥至恒重。然后將其稱重，記錄菌絲體的重量，即樺褐孔菌生物量。

1.2.4樺褐孔菌胞內(nèi)外多酚和多糖的提取

將烘干至恒重的菌絲體研磨成粉末，然后將粉末溶于10倍體積70%的丙酮，并在冰水浴中用超聲波細(xì)胞破碎儀破壁。勻漿液再用體積比為70%的丙酮中萃取24 h，萃取3次。之后將混合物離心得上層清液。濃縮干燥上清液，即得胞內(nèi)多酚，記為IPC。

將抽濾后得到的發(fā)酵培養(yǎng)液減壓蒸餾并濃縮，同時(shí)加入4倍體積95%的乙醇。充分?jǐn)嚢韬?，靜置24 h并離心分離。將上層的溶液減壓濃縮至1/4體積，用蒸餾水將體積調(diào)至最初。分別用氯仿、乙酸乙酯各20 mL萃取3次，同時(shí)冷凍干燥乙酸乙酯層，即得乙酸乙酯層胞外多酚，記為EA-EPC。繼續(xù)將萃取后得到的液體用正丁醇萃取3次，冷凍干燥正丁醇層，即得正丁醇層胞外多酚，記為NB-EPC。

將之前提取胞內(nèi)多酚后剩余的固體部分溶于5倍蒸餾水于95 ℃加熱2 h后，冷卻離心得上清液，重復(fù)操作，合并清液。繼續(xù)在殘?jiān)屑尤胝麴s水后于121℃加熱1.5 h，重復(fù)上述操作。在兩種不同清液中加入4倍95%的乙醇，充分?jǐn)嚢璩恋?，靜置過(guò)夜，離心并冷凍干燥得胞內(nèi)粗多糖并儲(chǔ)存?zhèn)溆?，分別記為IPS1(95℃)、IPS2(121 ℃)。

為了除去摻雜于多糖沉淀中的小分子物質(zhì)和還原糖，在提取過(guò)程中離心得到的殘?jiān)屑尤胄碌?5%的無(wú)水乙醇。離心(10 min，轉(zhuǎn)速為6500 r/min)并冷凍干燥得到干燥的胞外粗多糖，記為EPS。

1.2.5樺褐孔菌胞內(nèi)外多酚、多糖和還原糖的測(cè)定

樺褐孔菌胞內(nèi)外多酚含量的測(cè)定采用福林—酚法(Folin-Ciocalteu reagent method[18])。以沒(méi)食子酸濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將提取的胞內(nèi)外多酚樣品溶解，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)定并計(jì)算胞內(nèi)外多酚的含量。

胞內(nèi)外多糖含量采用苯酚硫酸法。以葡萄糖濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[19]。配制0.1 mg/mL的多糖溶液(采用干燥得到的粗多糖)，按照上述方法檢測(cè)并計(jì)算胞內(nèi)外多糖的含量。

還原糖的測(cè)定采用3,5-二硝基水楊酸法(DNS法)。以葡萄糖含量(mg/mL)為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將一定體積的抽濾發(fā)酵液稀釋到適當(dāng)濃度，按上述方法，測(cè)定并計(jì)算還原糖含量[20]。

1.2.6DPPH自由基清除率的測(cè)定

參考Yang等[21]的方法檢測(cè)胞內(nèi)外多酚的DPPH清除率并適當(dāng)改進(jìn)。配制0.4mM/L的DPPH甲醇溶液，并取0.8 mL的DPPH的甲醇溶液于試管中，同時(shí)加入2.4 mL有機(jī)溶劑培養(yǎng)基發(fā)酵所得胞內(nèi)外多酚樣品 (濃度為10 mg(GAE)/L)，振蕩搖勻并于暗處?kù)o置。30 min后于波長(zhǎng)為517 nm處測(cè)AX值。與此同時(shí)，空白對(duì)照組加入等量的DPPH的甲醇溶液，并在相同的波長(zhǎng)下測(cè)定其A0值。樣品對(duì)照組用甲醇替代DPPH，其余加入物質(zhì)的量與之前相同，并在相同條件下測(cè)定其AX0值。 DPPH清除率的計(jì)算公式如下：

式中：A0為空白DPPH清除率，AX為樣品DPPH清除率，AX0為對(duì)照DPPH清除率。

2　結(jié)果與討論

2.1樺褐孔菌生物量

有機(jī)溶劑通常被作為一種很好的溶劑促使物質(zhì)之間的相容。這些溶劑能夠重組細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)也有可能直接影響次級(jí)代謝產(chǎn)物所需要的酶的合成[22]。表1顯示了有機(jī)溶劑對(duì)生物量的變化。

表1　有機(jī)溶劑對(duì)樺褐孔菌生物量的影響(P<0.05)

注：生物量的顯著性差異用小寫字母標(biāo)注相同的字母代表無(wú)顯著性差異(P<0.05)。

由表1生物量的差異可知，丙酮、甲苯和乙醇的效果顯著，分別在對(duì)照組的基礎(chǔ)上提高了2.68%、2.27%和3.98%(P<0.05)。這三種有機(jī)溶劑能增強(qiáng)細(xì)胞膜通透性，促使培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)快速被細(xì)胞所利用，達(dá)到菌絲體生長(zhǎng)的效果。

2.2樺褐孔菌胞內(nèi)外多酚的產(chǎn)量

胞外多酚用兩種不同萃取劑萃取，分別為乙酸乙酯和正丁醇。正丁醇中含有極性較強(qiáng)的多酚組分，乙酸乙酯層中含有極性較弱的多酚組分。測(cè)定不同萃取劑提取的多酚的含量，具體結(jié)果如圖1。

圖1　有機(jī)溶劑對(duì)樺褐孔菌胞內(nèi)外多酚產(chǎn)量的影響注：胞內(nèi)外多酚的顯著性差異分別用*和大小寫字母標(biāo)注，相同的字母代表無(wú)顯著性差異(P<0.05)。

由圖1可知這5種有機(jī)溶劑中丙酮對(duì)樺褐孔菌胞內(nèi)外多酚含量的促進(jìn)作用最強(qiáng)。乙酸乙酯層、正丁醇層以及胞內(nèi)分別達(dá)到了139.33 mg/L、88.85 mg/L、7.84 mg/g，是對(duì)照組的5.3、1.7、2.5倍。其中，正丁醇層的多酚含量少于乙酸乙酯層，說(shuō)明丙酮能促進(jìn)脂溶性的多酚的釋放。此外，丙酮與甲醇均能較強(qiáng)地促進(jìn)胞內(nèi)多酚的含量，兩者分別達(dá)到了7.84 mg/g、7.77 mg/g，兩者無(wú)顯著性差異。添加有甲醇的培養(yǎng)基發(fā)酵所得的胞外多酚含量并不高，而胞內(nèi)多酚含量相較于其他培養(yǎng)基促進(jìn)作用明顯，這可能是因?yàn)榧状寄艽龠M(jìn)脂溶性的多酚，但并不能很好地將多酚釋放到培養(yǎng)液中，從而使多酚在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行堆積，使胞內(nèi)的多酚含量大大增加，該結(jié)果具有顯著性差異(P<0.05)。

2.3樺褐孔菌發(fā)酵液還原糖量與胞內(nèi)外多糖量

按照上述方法測(cè)定發(fā)酵培養(yǎng)液中還原糖量與胞內(nèi)外多糖量，具體結(jié)果如圖2、圖3。

圖2　有機(jī)溶劑對(duì)樺褐孔菌發(fā)酵液中還原糖量的影響注：還原糖含量的顯著性差異用小寫字母標(biāo)注，相同的字母代表無(wú)顯著性差異(P<0.05)。

圖3　有機(jī)溶劑對(duì)樺褐孔胞內(nèi)外多糖產(chǎn)量的影響注：胞內(nèi)外多糖的顯著性差異用*和大小寫字母標(biāo)注，相同的字母代表無(wú)顯著性差異(P<0.05)。

圖2、圖3顯示的是添加體積分?jǐn)?shù)為0.1%的有機(jī)溶劑(甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、甲苯)對(duì)于樺褐孔菌培養(yǎng)液中還原糖量和胞內(nèi)外多糖量的影響。從圖2可看出5種有機(jī)溶劑使培養(yǎng)液中剩余還原糖量增加。此外，5種有機(jī)溶劑抑制了EPS的產(chǎn)量，尤其是氯仿和丙酮抑制效果最明顯，EPS的產(chǎn)量分別僅為對(duì)照組的76.70%和75.34%。與對(duì)EPS的影響相反，氯仿和乙醇對(duì)IPS1有很大的促進(jìn)作用，增長(zhǎng)率為16.86%和9.67% (p<0.05)；對(duì)IPS2的增長(zhǎng)率為17.22%和15.20%(p<0.05)。

以上采取的幾種溶劑中氯仿和甲苯對(duì)樺褐孔菌細(xì)胞的毒性大于甲醇、乙醇和丙酮，導(dǎo)致EPS量減少。另一方面，為了抵制外來(lái)物質(zhì)對(duì)自身的傷害，細(xì)胞會(huì)分泌更多的次級(jí)代謝產(chǎn)物作為防護(hù)機(jī)制。

2.4樺褐孔菌胞內(nèi)外多酚的抗氧化活性

多酚由于其具有清除各種活性氧化自由基的特性而被廣泛應(yīng)用于抗衰老保健品或者護(hù)膚品中。通過(guò)檢測(cè)多酚的DPPH自由基清除率，鑒定出有機(jī)溶劑對(duì)多酚抗氧化活性的強(qiáng)弱的影響。具體結(jié)果如下圖4：

圖4　有機(jī)溶劑對(duì)樺褐孔菌胞內(nèi)外多酚DPPH自由基清除率的影響注：胞內(nèi)外多酚DPPH自由基清除率的顯著性差異用*和大小寫字母標(biāo)注，相同的字母代表無(wú)顯著性差異(P<0.05)。

如圖4所示，有機(jī)溶劑對(duì)樺褐孔菌胞內(nèi)多酚的DPPH自由基清除率有顯著地提高。其中，添加丙酮后胞內(nèi)多酚達(dá)到85.97%，是空白3.0倍。氯仿次之，清除率達(dá)78.25%，甲醇、乙醇、甲苯分別為75.48%、73.71%、70.64%。因此，有機(jī)溶劑能促進(jìn)胞內(nèi)多酚中強(qiáng)活性的組分的合成。然而有機(jī)溶劑對(duì)樺褐孔菌胞外多酚的效果不如胞內(nèi)，對(duì)于胞外乙酸乙酯層多酚來(lái)說(shuō)，甲醇與甲苯的效果最佳，分別達(dá)到63.17%和60.04%。這兩種有機(jī)溶劑對(duì)正丁醇層的作用要弱于乙酸乙酯層多酚的多酚，分別達(dá)到了57.97%和53.43%，說(shuō)明甲醇與甲苯能較好地促進(jìn)極性較小的多酚組分的合成。其余3種有機(jī)溶劑正丁醇層多酚的清除率要強(qiáng)于乙酸乙酯層的多酚，其中乙醇達(dá)到正丁醇多酚的最大值(68.06%)，因此，乙醇、氯仿、丙酮能促進(jìn)胞外更多極性大的多酚組分的合成(P<0.05)。

3　結(jié)　論

樺褐孔菌次級(jí)代謝產(chǎn)物(多酚、多糖)對(duì)多種疾病有較好的治療效果。但是由于其天然資源有限，液體深層發(fā)酵有著良好的前景。有機(jī)溶劑作為一種促進(jìn)劑，能夠增加細(xì)胞膜通透性，探究其對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生有一定的意義。本研究5種有機(jī)溶劑中丙酮、甲苯與乙醇能促進(jìn)樺褐孔菌生物量，其中乙醇最佳；有機(jī)溶劑對(duì)胞內(nèi)外多酚的促進(jìn)效果要強(qiáng)于多糖，其中，丙酮、甲醇能顯著提高胞內(nèi)外多酚的產(chǎn)量，然而強(qiáng)烈抑制了胞內(nèi)外多糖的產(chǎn)量；5種有機(jī)溶劑均能提高胞內(nèi)外多酚的DPPH自由基清除率，尤其是對(duì)胞內(nèi)多酚，丙酮效果最佳。綜上所述，以樺褐孔菌胞內(nèi)外多酚產(chǎn)量及活性為指標(biāo)，篩選出丙酮為最佳有機(jī)溶劑；以胞內(nèi)外多糖產(chǎn)量為指標(biāo)，乙醇為最佳有機(jī)溶劑。該結(jié)果為提高樺褐孔菌次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量及活性篩選了最佳有機(jī)溶劑，也為藥物和保健品領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)提供廣闊的前景，同時(shí)也為后續(xù)多酚與多糖合成途徑提供了有力的依據(jù)。

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(責(zé)任編輯： 許惠兒)

Effect of Organic Solvents on Production and Activity of Polyphenol and Polysaccharides fromInonotusObliquusby Submerged Fermentation

SHENMengwei,QUANLili,XUXiangqun

(School of Science, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China)

1 g/L organic solvents (acetone, methanol, chloroform, toluene, ethanol) were added in the medium, and the effects of organic solvents on production of polyphenol and polysaccharides were discussed. Meanwhile, the effect of organic solvents on the antioxidant activity of polyphenol was studied through determining DPPH radical-scavenging activity of polyphenol. The experimental results show that the medium where acetone, toluene and ethanol are added can significantly improve biomass ofInonotusobliquus, and the growth rates are 2.68%、2.27% and 3.98%, compared with the control group. When polyphenol content in and outside the cells and activity serve as the indexes, and acetone serves as the optimal organic solvent, polyphenol output at ethyl acetate layer and normal butanol layer is 2.5 times, 5.3 times and 1.7 times more than the control group, respectively; corresponding activity is 1.3 times, 1.3 times and 3.0 times higher than the control group, respectively. When polysaccharide content in and outside cells serves as the index, all organic solvents have organic solvent on exopolysaccharides. When ethyl alcohol is used as the optimal organic solvent, growth rate of intercellular polysaccharide (extracted under 95℃ and 121℃) reaches 9.67% and 15.20%, compared with control group. The reason may be that organic solvents can effectively promote cell consistency, then changes membrane permeability and influences absorption of cells on nutrient substances in the medium. Meanwhile, different organic solvents will generate different effects on synthesis of various secondary metabolites.

Inonotusobliquus; polyphenol; organic solvents; polysaccharides; antioxidant activity

10.3969/j.issn.1673-3851.2016.01.015

2015-01-13

浙江省科技廳公益技術(shù)項(xiàng)目(2012C20375)

沈夢(mèng)薇(1990-)，女，浙江舟山人，碩士研究生，主要從事生物化學(xué)方面的研究。

徐向群，E-mail：xuxiangqun@zstu.edu.cn

Q936

A

1673- 3851 (2016) 01- 0093- 06 引用頁(yè)碼： 010701