基于ITS序列的南嶺黃檀分子鑒定

李奇威，杜貴鋒，譚貴良，孫 瑾，王業(yè)勝，周 林，朱 爽

(1.廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院、廣東省生物技術候選藥物研究重點實驗室，廣東 廣州 510006；2.中山市質量計量監(jiān)督檢測所，廣東 中山 528403； 3.華南農業(yè)大學林學院，廣東 廣州 510120)

基于ITS序列的南嶺黃檀分子鑒定

李奇威1，杜貴鋒1，譚貴良2，孫 瑾3，王業(yè)勝1，周 林1，朱 爽1

(1.廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院、廣東省生物技術候選藥物研究重點實驗室，廣東 廣州 510006；2.中山市質量計量監(jiān)督檢測所，廣東 中山 528403； 3.華南農業(yè)大學林學院，廣東 廣州 510120)

以南嶺黃檀(Dalbergiabalansae)為研究對象，采用改良CTAB法對南嶺黃檀邊材進行總DNA提取，利用引物對rDNA-ITS序列進行PCR擴增和序列測定，用MEGA軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析，構建南嶺黃檀及其近緣樹種的分子系統(tǒng)發(fā)育樹。結果表明：用改良CTAB法可以成功提取南嶺黃檀邊材總DNA，并在模板稀釋倍數為1×10-2～1×10-3倍時可成功PCR擴增出rDNA-ITS序列，并基于rDNA-ITS序列測定和系統(tǒng)發(fā)育樹構建的分子生物學方法，利用ITS序列對南嶺黃檀進行分子鑒定，為南嶺黃檀的種類鑒定和種間的分類地位提供分子生物學根據。

南嶺黃檀；DNA提??；ITS序列；分子鑒定

南嶺黃檀(DalbergiabalansaePrain.)為豆科黃檀屬植物，別名水相思、黃類樹，廣泛分布于浙江、福建、湖南、廣東、廣西、四川、貴州等地。南嶺黃檀冠幅大、葉量多，在中國南部城市常被用作蔽蔭樹或風景樹；其枝條生長速度快、產量高[1]，也是云南紫膠蟲生長發(fā)育和繁殖的優(yōu)良寄主植物[2]，3年生南嶺黃檀平均每棵樹每年可產紫膠10 kg，為種植戶帶來可觀的經濟收益[3]。

由于南嶺黃檀與黃檀屬內的紅木木材容易混淆，而南嶺黃檀的鑒定是依靠傳統(tǒng)的形態(tài)學方法來實現，這要求鑒定員對木材的結構特征十分熟悉，經驗要豐富，且有時難以準確識別至種的水平，從一定程度上給南嶺黃檀的鑒別帶來困難。隨著分子生物學的發(fā)展，DNA分子遺傳學技術逐漸被廣泛應用于植物、動物、細菌等物種鑒定[4]。其中DNA條形碼技術因具有條形碼片段短、易于提取、變異區(qū)兩端序列高度保守等特點[5]，可利用它進行準確的物種鑒定，彌補了傳統(tǒng)鑒定方法的不足，因此逐漸成為一種熱門的物種鑒定工具。Kress等[6]對被子植物類群進行取樣和研究，提出利用ITS和trnH-psbA的組合進行植物類群鑒定是較好的選擇。朱爽等[7]成功利用ITS序列對毛鉤藤與無柄鉤藤進行分子鑒定。然而目前尚未見關于南嶺黃檀木材DNA的提取及其近緣種屬的分子系統(tǒng)發(fā)育分析報道，本試驗通過改良CTAB法提取南嶺黃檀木材DNA，用特異引物對ITS區(qū)進行PCR擴增，并進行克隆測序，所得序列與GenBank數據庫已登記的近緣樹種ITS序列構建較完整的紅木樹種及其近緣種屬之間的系統(tǒng)發(fā)育樹，并探討其親緣關系，從而為南嶺黃檀和紅木木材及其近緣種屬的分子鑒定分析提供分子生物學理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與來源

試驗材料由廣東省中山市質量計量監(jiān)督檢測所提供，取材地為廣州華南植物園，采取的新鮮樣品立即于-20 ℃保存。華南農業(yè)大學林學院孫瑾教授通過組織切片分析等方法初步鑒定樣品為南嶺黃檀。試驗前用手術刀取其邊材部位并切成小塊狀，90%乙醇浸泡10 min，干燥后進行DNA提取。

1.2 試劑

電泳染料使用EB替代品SYBR Green I(北京百泰克生物技術有限公司)，DL2000 DNA Marker(TIANGEN生化科技有限公司)，DNA凝膠回收試劑盒(上海碧云天Beyotime公司)，rTaq酶、pMD18-T-Vecter載體、EscherichiacoliJM109感受態(tài)細胞(大連寶生物工程有限公司TaKaRa)，瓊脂糖(西班牙BIOWEST)，氨芐青霉素(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)，其余試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 改良CTAB法提取總DNA 稱取南嶺黃檀木材樣品1 g，置預冷的研缽中，加液氮研磨成粉末。將粉末移至50 mL離心管，加65 ℃預熱的CTAB裂解液5 mL[7]，充分混勻；65 ℃水浴2 h，12000 r·min-1離心10 min，取上清液，用等體積的Tris飽和酚、酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1)和氯仿-異戊醇(24∶1)各抽提1次，12000 r·min-1離心10 min，取上清液，先加入2倍體積的無水乙醇，再加入3 mol·L-1NaAc，使溶液中NaAc最終質量濃度為0.3 mol·L-1，-20 ℃沉淀2 h，12000 r·min-1離心10 min，棄上清，用1 mL 70%冷的乙醇洗滌2～3次，干燥后用無菌1×TE緩沖液20 μL溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 ITS序列PCR擴增 應用植物rDNA-ITS序列的通用擴增引物(上海生工生物工程公司合成)[8-9]ITS4(5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′)和ITS5(5′GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3′)對南嶺黃檀總DNA進行rDNA-ITS序列擴增。PCR采用20 μL反應體系：10×PCR Buffer 2.0 μL，dNTP Mix(2.5 mM)0.8 μL，上下游引物各0.4 μL，rTaq酶(5 U·μL-1)0.1 μL，其余體積以無菌超純水補足。擴增參數見文獻[7]。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用SYBR Green I染色，120V電泳30 min，最后用Tannon-4100全自動數碼凝膠圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)觀察、拍照。

1.3.3 PCR產物純化、連接和轉化 PCR擴增產物采用DNA 凝膠回收試劑盒進行回收與純化。純化產物連接到pMD18-T-Vecter載體，連接產物轉化到E.coliJM109感受態(tài)細胞，進行氨芐青霉素選擇和藍白斑的篩選[7]。

1.3.4 序列測定 隨機挑取3個單克隆菌落在液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜后，將菌液送至華大基因科技股份有限公司進行測序。測序得到的序列去除引物端后，通過與GenBank中已有的豆科植物ITS區(qū)序列進行比對，得到與測序序列相似的ITS序列。

1.3.5 序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構建 根據測序得到的南嶺黃檀rDNA-ITS序列在GenBank數據庫中比對的結果，確定19個黃檀屬物種、5個紫檀屬物種和2個決明屬物種的ITS序列，將其與本試驗所得序列一起導入MEGA(Version 6.06)軟件進行多重比對(Clustal W功能)，空位處作缺失狀態(tài)。比對后的序列用最大簡約法(Maximum Parsimony)構建系統(tǒng)進化樹，使用自舉檢驗法(boot-strap text)做1000次可信度分析。

2 結果與討論

2.1 DNA提取結果

本試驗所用的CTAB中含有2% PVP，PVP可絡合酚，減少酚對DNA的降解。取1×TE溶解的南嶺黃檀總DNA樣品3 μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)記錄結果見圖1。由圖1可以看出，總DNA樣品主帶清晰，有小于2000 bp的彌散條帶，這是由于邊材中細胞的DNA有所降解。

2.2 南嶺黃檀ITS 序列PCR擴增結果

以提取的總DNA為模板，將模板濃度稀釋成1、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4倍后進行PCR擴增。擴增結果見圖2，由圖2可知模板濃度在10-2、10-3倍時條帶較亮；而1×10-1倍、1×10-4倍時條帶較暗，前者是由于模板溶液中仍有較多PCR抑制物，如殘留的酚、多糖等[10]；后者是由于模板濃度太低導致擴增后的產量不高。因此進行南嶺黃檀rDNA-ITS序列PCR擴增的較佳模板濃度范圍在1×10-2～1×10-3倍，在此模板濃度下，可以減少提取的南嶺黃檀總DNA中多糖、酚等抑制物對PCR的不利影響。

2.3 ITS序列分析

將3個單克隆菌液送至廣州華大基因公司測序，測序成功率為100%，測序結果在GenBank上進行比對，與數據庫中的南嶺黃檀ITS序列(AB828612)有99%相似度。試驗所得ITS序列與表1中所列的ITS序列用MEGA軟件進行比對后，用最大簡約法(MP)構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，對自舉支持率低于50%的分支進行切斷。結果顯示，通過對27個物種ITS序列的簡約性分析，發(fā)育樹的枝長為269，一致性指數為0.563319，保留指數為0.723757，所有位點復合指數和簡約性信息位點分別為0.454702與0.407706。其中所有黃檀屬物種(20個)聚為一支，所有紫檀屬物種(5個)聚為一支，決明屬物種(2個)聚為一支。在黃檀屬中，南美黃檀(D.foliolosa)和巴西黑黃檀(D.nigra)聚為一個小分支，自舉支持率為53%；莓葉黃檀(D.arbutifolia)和兩粵黃檀(D.benthamii)聚為一小支，支持率為99%。本試驗所得序列與南嶺黃檀相聚(支持率為94%)后再與紫花黃檀(D.assamica)聚為一小支(支持率分別為94%和96%)。進一步在NCBI上進行比對，樣品與南嶺黃檀(AB828612)的相似度為98.7%，與紫花黃檀的相似度為96.2%，說明南嶺黃檀種內變異少，南嶺黃檀與紫花黃檀之間的親緣關系較近。由于黃檀屬、紫檀屬分別屬于蝶形花亞科、蝶形花科，而決明屬則屬于蘇木亞科，因此在圖3的發(fā)育樹中，黃檀屬和紫檀屬聚為一支后再與決明屬聚類，說明ITS序列可以區(qū)分3個近緣屬及其屬內種間的關系。其中15個物種(黃檀屬9個、紫檀屬5個、決明屬1個)為GB/T 18261—2000紅木[11]所規(guī)定的紅木物種，因此ITS序列也可以為紅木木材種類的分子生物學鑒定提供生物學理論依據。

表1 從GenBank 獲取ITS 序列物種名稱及其編號

表1(續(xù))

3 結論

1)以南嶺黃檀邊材為試驗對象，采用改良CTAB法提取總DNA，可提取出較完整的DNA，并以提取的DNA為模板對rDNA-ITS序列進行多梯度PCR擴增，PCR結果表明模板稀釋倍數在1×10-2～1×10-3倍時可擴增出條帶清晰的ITS序列。

2)通過對GB/T 18261—2000紅木[11]涉及的3個近緣屬物種的ITS序列分析，表明ITS序列可以區(qū)分近緣屬和屬內種間的差異，為紅木木材種類的分子生物學鑒定提供生物學理論依據。

[1]黃光亮，黃杰毅.南嶺黃檀具有丘陵區(qū)造林所需特性[J].湖南林業(yè)科技，1982(2)：21-22.

[2]陳又清，王紹云.不同寄主植物對云南紫膠蟲自然種群的影響[J].應用生態(tài)學報，2007，18(4)：761-765.

[3]林永珍，葉思群.南嶺黃檀的栽培技術與效益分析[J].廣東林業(yè)科技，2013，29(1)：79-82.

[4]焦立超，殷亞方，孫清鵬，等.基于DNA的木材識別新技術發(fā)展與應用[J].木材工業(yè)，2012，26(1)：27-30.

[5]張蓉，殷亞方，徐魁梧，等.DNA技術在木材來源鑒定中的應用[J].木材工業(yè)，2015，29(3)：31-34.

[6]Kress WJ，Erickson DL.A two-locus global DNA barcode for land plants：the coding rbcL gene complements the non-coding trnH-psbA spacer region[J].PLoS One，2007(2)：508.

[7]朱爽，周林，黃楷鴻，等.毛鉤藤和無柄果鉤藤的ITS 序列分析研究[J].中草藥，2010，41(10)：1696-1700.

[8]Innis M A，Gelf and D H，Sninsky J J，et al.PCR Protocols：a Guide to Methods and Applications[M].San Diego：Academic Press，Inc.C A，1990.

[9]Chou S J，Yen J H，Fang C L，et al.Authentication of medicinal herbs using PCR-amplified ITS2 with spectific primers[J].Planta Med，2007(73)：1421-1426.

[10]Rachmayanti Y，Leinemann L，Gailing O，et al.DNA from processed and unprocessed wood：factors influencing the isolation success[J].Forensic science international.Genetics，2009，3(3)：185-92.

[11]中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.GB/T 18261—2000 紅木[S].北京：中國標準出版社，2001.

Molecular Identification ofDalbergiabalansaePrain.Based on ITS Sequence

LI Qiwei1，DU Guifeng1，TAN Guiliang2，SUN Jin3，WANG Yesheng1，ZHOU Lin1，ZHU Shuang1

(1.GuangdongProvinceKeyLaboratoryforBiotechnologyDrugCandidates，SchoolofBiosciencesandBiopharmaceutics，GuangdongPharmaceuticalUniversity，Guangzhou510006，Guangdong，China；2.ZhongshanSupervisionTestingInstituteofQuality&Metrology，Zhongshan528403，Guangdong，China；3.CollegeofForestry，SouthChinaAgriculturalUniversity，Guangzhou510120，Guangdong，China)

Total DNA was extracted fromDalbergiabalansaeby modified CTAB method and rDNA-ITS regions were amplified with universally conserved primers.The relationships betweenD.balansaeand its related species were characterized by phylogentic analyses using MEGA by Maximum Parsimony method.The results showed that total DNA could be successfully extracted from sapwood by modified CTAB method and rDNA-ITS region could be amplified successfully when template dilution factor was 1×10-2～1×10-3fold.Based on rDNA-ITS sequence and phylogenetic tree analysis，the molecular identification could be performed onD.balansaeand provide molecular evidence for taxonomy ofD.balansae.

Dalbergiabalansae；DNA extraction；ITS region；molecular identification

10.13428/j.cnki.fjlk.2016.04.018

2016-01-02；

2016-03-02

中山市科技計劃項目(2013A3FC0249)

李奇威(1993—)，男，廣東廣州人，廣東藥科大學在讀碩士研究生，從事分子生物學研究。E-mail：332134284@qq.com。

朱爽，男，廣東藥科大學副教授，從事分子生物學研究。E-mail：15683727@qq.com。

S792.28；Q75

A

1002-7351(2016)04-0085-04