小黑楊花粉植株的獲得及遺傳轉(zhuǎn)化

牛京萍，劉 軼，由香玲

(1.林產(chǎn)工業(yè)規(guī)劃設計院，北京 100010； 2.東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040； 3.東北林業(yè)大學生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

小黑楊花粉植株的獲得及遺傳轉(zhuǎn)化

牛京萍1，劉 軼2，由香玲3

(1.林產(chǎn)工業(yè)規(guī)劃設計院，北京 100010； 2.東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040； 3.東北林業(yè)大學生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

以小黑楊花藥為外植體，進行花粉植株(即單倍體)的誘導及體系的優(yōu)化。通過染色體壓片及PCR方法進行檢測，證明已獲得了單倍體植株。同時，以pROKII為載體利用根癌農(nóng)桿菌介導法對單倍體植株進行了遺傳轉(zhuǎn)化，分子檢測結(jié)果表明，外源基因已成功整合入單倍體小黑楊中。本研究可為林木單倍體的誘導及遺傳轉(zhuǎn)化研究提供參考，也可為楊樹及林木的育種方式提供新思路。

小黑楊；花粉植株；單倍體；遺傳轉(zhuǎn)化

利用植物的花粉或花藥進行離體培養(yǎng)，可以獲得單倍體(Haploid)或雙單倍體(Double haploid)植株，又稱為花粉植株。Bourgin等[1]在1967年成功利用煙草花藥誘導獲得了單倍體植株。到目前為止，植物育種學家們已從幾百個植物品種中成功誘導了單倍體植株[2]。由于單倍體或雙單倍體植株具有基因純合的特點，是研究遺傳變異及基因組測序的理想材料。

楊樹由于具有生長迅速、適應性強、易繁殖等優(yōu)點，成為當今世界上主要的造林樹種。我國在楊樹單倍體育種方面起步較早，20世紀70年代初即進行了相關的研究，到目前為止，中國科學院北京植物研究所[3]、中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所[4]、黑龍江省林業(yè)研究所[5]、東北林業(yè)大學[6-8]、遼寧省營口市楊樹科學研究所[9]等多個單位已從十幾個楊樹品種中成功誘導獲得了單倍體。本文介紹了小黑楊單倍體的獲得過程，并以此為材料，進行轉(zhuǎn)基因的研究，經(jīng)過檢測，外源基因已成功轉(zhuǎn)入單倍體植株。本研究將為其他楊樹的單倍體基因轉(zhuǎn)化提供參考。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

小黑楊(Populussimonii×P.nigra)取自東北林業(yè)大學校園內(nèi)約30年生的小黑楊雄株，大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)購自北京全式金生物技術有限公司；農(nóng)桿菌菌株GV3101由本實驗室保存。

PCR相關試劑、DNA marker購自TaKaRa公司(中國大連)；質(zhì)粒提取和膠回收試劑盒，購自OMEGA公司(美國)；植物激素購自Sigma公司(美國)，植物表達載體pROKII質(zhì)粒，由山東師范大學張慧教授惠贈；引物合成及基因測序由哈爾濱博仕生物技術有限公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 小黑楊花粉植株的誘導 在小黑楊花芽產(chǎn)生萌動的初期，每天剪取小黑楊雄花序進行觀察，當鏡檢發(fā)現(xiàn)花粉小孢子處于單核期或單核靠邊期時，剪取雄花序作為誘導單倍體的試驗材料。具體方法為：首先將雄花序浸入70%的酒精中消毒60 s，然后用消毒的鑷子去掉芽鱗苞片，放入70%的酒精中浸泡20 s，再移入2%次氯酸鈉溶液中消毒10 min，最后用無菌水清洗4次并用無菌吸水紙吸干。將花藥撥出，接種于誘導愈傷組織的培養(yǎng)基中，置于(25±2) ℃黑暗進行培養(yǎng)。本研究以MS為基本培養(yǎng)基，蔗糖質(zhì)量分數(shù)為3%，附加不同濃度梯度的生長素(2，4-D)和激動素(KT)，其中2，4-D梯度為1、2、4、6 mg·L-1，KT梯度為0.5 mg·L-1，共4個組合。當愈傷組織長到3～5 mm時，移入分化培養(yǎng)基上進行芽的誘導，附加6-BA 0.5 mg·L-1，NAA 0.05 mg·L-1，蔗糖質(zhì)量分數(shù)為2%。當分化芽達到1.0 cm長時分離并放入生根培養(yǎng)基，附加NAA 0.1 mg·L-1，蔗糖質(zhì)量分數(shù)為2%。觀察不同的激素組合對芽的誘導率和芽形態(tài)的影響。培養(yǎng)室中溫度(25±2) ℃，光照16 h/黑暗8 h。

1.2.2 染色體倍數(shù)的細胞學檢測 染色體檢測材料為根尖。在無菌條件下，將生長旺盛的生根苗在1～3 ℃低溫下預處理24 h，剪取根尖放入卡諾固定液(酒精∶醋酸 =3∶1，v/v)中固定24 h，放入70%的酒精中保存。染色前用1 mol·L-1的HCl解離10～15 min。染色采用鐵礬-蘇木精染色法，即鐵礬媒染24 h，取出后用清水將鐵礬洗干凈，再用0.5%的蘇木精染色1～2 h后進行壓片。顯微鏡下檢查染色體條數(shù)。

1.2.3 花粉植株的遺傳轉(zhuǎn)化 利用液氮凍融法將pROKII質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞中，挑取單克隆經(jīng)菌液PCR驗證轉(zhuǎn)化子。將GV3101菌種接種到液體LB培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8，離心濃縮菌體并用滅菌水稀釋至終濃度為OD600=0.2～0.3，然后將預培養(yǎng)2 d的楊樹葉片浸泡到制備好的農(nóng)桿菌液中3～7 min，期間輕輕的搖動侵染液，取出葉片將多余的菌液用無菌濾紙吸干。將侵染過的葉片在不含抗生素的分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，(25±2) ℃下暗培養(yǎng)2 d。共培養(yǎng)后的葉片用無菌濾紙吸干多余的水分后置于含有選擇劑卡那霉素(Kanamycin)和頭孢霉素(Ceftaxime，500 mg·L-1)的MS分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直至分化出抗性芽。待2次分化的不定芽長到約1.0 cm時，將其切下，置于MS生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)。為了確定合適的Kanamycin濃度，分別觀察Kanamycin 20、30、40、50 mg·L-1對葉片分化抑制效果。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因植株及雙單倍體的PCR檢測 利用CTAB法提取篩選后的小黑楊株系葉片DNA進行PCR檢測，篩選陽性株系。為鑒定外源基因是否導入小黑楊，以pROKII質(zhì)粒的T-DNA序列設計引物進行PCR擴增，引物序列為Forward：TGTTCCGCAGAGATCCCGTGG；Reverse：GATCATGAGCGGAGAATTAAGG。為鑒定植株是否為單倍體，以楊樹Poptr；CYCD1；1基因序列設計引物進行PCR擴增，引物序列為Forward：ATGTCCTACTCTGATTGCTTATC；Reverse：TCACTCGGAATTTCCTTTGTCATC。反應條件為94 ℃預變性4 min；94 ℃ 變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)；72 ℃再延伸7 min，PCR結(jié)束后取3 μL反應產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小黑楊花粉發(fā)育觀察及花粉植株的獲得

首先利用DAPI染色法進行染色觀察，篩選合適的時期進行花藥培養(yǎng)。小黑楊花粉具有典型的花粉發(fā)育特征，可見明顯的四分體期—單核期—單核靠邊期3個時期(圖1)。花藥經(jīng)培養(yǎng)40 d左右時，部分花藥形成愈傷組織(圖2A)。研究結(jié)果表明，2，4-D 2 mg·L-1和KT 0.5 mg·L-1組合誘導愈傷組織的效率最高(表1)。愈傷組織繼代轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，以促進分化形成不定芽，并利用不定芽的葉片誘導不定芽(圖2B)。

2.2 花粉植株的遺傳轉(zhuǎn)化

Kanamycin濃度篩選試驗結(jié)果表明，當Kanamycin 30 mg·L-1時，大部分葉片初期形成假陽性芽，但后期在發(fā)育過程中逐漸死亡；而當Kanamycin 40 mg·L-1時，僅少量葉片產(chǎn)生假陽性不定芽；當Kanamycin 50 mg·L-1時，葉片不產(chǎn)生假陽性不定芽。因此以Kanamycin 40 mg·L-1作為最佳濃度。以pROKII質(zhì)粒為載體(圖3A)，進行遺傳轉(zhuǎn)化。共培養(yǎng)階段，在Kanamycin選擇壓力下，葉片培養(yǎng)十幾天后變?yōu)辄S白色，部分抗性芽呈綠色或黃綠色(圖3B)。在此次試驗中， 通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，最后共獲得轉(zhuǎn)基因株系4個。轉(zhuǎn)基因株系在含Kanamycin 40 mg·L-1的生根培養(yǎng)基中正常生根(圖3C)。PCR結(jié)果驗證，所有檢測的抗性楊樹植株中，均擴增出了大小約為1300 bp左右的片段，而以野生型楊樹為模板的反應，未擴增出條帶，說明外源基因已經(jīng)整合入轉(zhuǎn)化楊樹基因組中(圖3D)。

表1 植物生長調(diào)節(jié)劑濃度對花藥誘導 愈傷組織的影響

2.3 花粉植株的染色體數(shù)目觀察

小黑楊正常二倍體基因組的染色體數(shù)為38條，單倍體植株染色體數(shù)為19條。對4個轉(zhuǎn)基因株系進行染色體壓片觀察，結(jié)果表明，其中3個株系的體內(nèi)染色體數(shù)目多數(shù)小于或等于19條(圖4A)，一般為15～19條。因為楊樹的染色體數(shù)目比較多，導致根尖壓片時染色體的數(shù)目計數(shù)時容易產(chǎn)生誤差。以Poptr；CYCD1；1基因作為參考，進行PCR產(chǎn)物的序列分析，結(jié)果表明正常二倍體含有多處差異位點，而單倍體植株序列具有明顯的純合性(圖4B、圖4C)。以上結(jié)果說明這3個轉(zhuǎn)基因株系為單倍體。

3 結(jié)論與討論

利用楊樹的花藥培養(yǎng)，可獲得單倍體植株。本研究以小黑楊花藥為材料，進行單倍體植株的誘導。結(jié)果表明，當植物生長調(diào)節(jié)劑為2，4-D 2 mg·L-1和KT 0.5 mg·L-1組合時，誘導愈傷組織的效率最高；隨后通過分化培養(yǎng)基進行誘導不定芽，可獲得持續(xù)旺盛生長的叢生不定芽。利用染色體壓片法及PCR方法，證實已獲得單倍體小黑楊。Kan試驗表明，Kan 40 mg·L-1作為單倍體小黑楊遺傳轉(zhuǎn)化時最佳篩選濃度。進行單倍體小黑楊的遺傳轉(zhuǎn)化，并利用PCR方法證實外源基因已經(jīng)整合于小黑楊基因組中。

楊樹單倍體育種具有非常重要的科研意義。首先，楊樹花粉在形成時，會發(fā)生聯(lián)會并產(chǎn)生同源重組，花粉植株培養(yǎng)可有利于篩選突變體和新的品種[10-11]。楊樹為雌雄異株，導致楊樹單株的基因雜合性非常高，其對基因組測序或者基因表達等大規(guī)模測序的拼接處理造成非常嚴重的干擾，而楊樹的單倍體材料的使用則能有效解決以上問題。楊樹單倍體植株在培養(yǎng)過程有自然加倍的現(xiàn)象，形成雙單倍體，其同樣具有重要的研究價值。對于單倍體，以往采用染色體壓片技術進行檢測。近年來，隨著流式細胞儀的使用推廣，很多研究者已利用流式細胞儀技術區(qū)分單倍體與雙單倍體植株，而且此方法簡單迅速，可在短時間內(nèi)批量檢測花粉植株[12-14]。但是，對于雙單倍體的檢測，以上方式則無法區(qū)分。隨著分子標記和測序技術的發(fā)展，雙單倍體的區(qū)分已成為現(xiàn)實。Deutsch等[15]從黑楊等楊樹品種誘導產(chǎn)生了花粉植株，并建立了用SSR標記鑒定雜合體與花粉植株的方法。由于楊樹為雌雄異株，基因組具有高度雜合性，這也為單倍體的區(qū)分提供了依據(jù)。在擬南芥的研究中，插入突變體庫為擬南芥的基因功能研究提供極大便利，然而對于楊樹來說，如果想獲得純合的插入突變位點，通常需要后代的雜交或回交才能完成，由于楊樹生長周期長，極大延長了試驗周期，而利用單倍體楊樹轉(zhuǎn)基因方法可大大縮短試驗周期。

本研究將為楊樹的插入突變體庫建立及基因組測序研究提供優(yōu)秀的材料，并為其他林木的單倍體誘導及遺傳轉(zhuǎn)化提供了方法上的參考；此外，本研究也將為楊樹和其他樹種的育種方式提供新的思路。

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Induction and Genetic Transformation of Pollen Haploid Plants ofPopulussimonii×P.nigra

NIU Jingping1，LIU Yi2，YOU Xiangling3

(1.StateForestryPlanningandDesignInstituteofForestProductsIndustry，Beijing100010，China；2.StateKeyLaboratoryofTreeGeneticsandBreeding，NortheastForestryUniversity，Harbin150040，Heilongjiang，China；3.CollegeofLifeScience，NortheastForestUniversity，Harbin150040，Heilongjiang，China)

In this study，the anther ofPopulussimonii×P.nigrawas used to induce pollen plant (haploid plant)，and the improved method for haploid plant induction was performed.The squashing method for chromosome preparation and PCR method were used，and the results confirmed that the haploid plant was obtained.The haploid plant was transformed with pROKII usingAgrobacteriumtumefaciens-mediated method，and the result showed the exogenous gene was successfully introduced into genome of haploid plant.The present study will contribute to research of haploid induction and transformation，and breeding of poplar and other trees.

Populussimonii×P.nigra；pollen plant；haploid plant；genetic transformation

10.13428/j.cnki.fjlk.2016.04.003

2015-12-26

東北林業(yè)大學中央高校課題(2572015EA03)

牛京萍(1964—)，女，河北藁城人，林產(chǎn)工業(yè)規(guī)劃設計院高級工程師，從事林業(yè)環(huán)境保護與生態(tài)建設研究。E-mail：niujp9218@sina.com。

由香玲(1971—)，女，山東海陽人，東北林業(yè)大學生命科學學院教授。E-mail：yxiangling@yahoo.com。

S792.119；S722.3+5

A

1002-7351(2016)04-0013-04