類彈性蛋白標(biāo)簽在大腸桿菌周質(zhì)空間中表達(dá)研究

李晶泉林衡丁寧左曉雪史晉萍徐永平冷春玲楊春光

（1. 大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，大連 116024；2. 大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院，大連 116622；3. 遼東學(xué)院農(nóng)學(xué)院，丹東 118003）

類彈性蛋白標(biāo)簽在大腸桿菌周質(zhì)空間中表達(dá)研究

李晶泉1林衡2丁寧2左曉雪2史晉萍2徐永平1冷春玲3楊春光2

（1. 大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，大連 116024；2. 大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院，大連 116622；3. 遼東學(xué)院農(nóng)學(xué)院，丹東 118003）

旨在研究類彈性蛋白［I］40（elastin-like polypeptide［I］40，ELP［I］40）在大腸桿菌周質(zhì)空間的表達(dá)。構(gòu)建表達(dá)載體pIG6LH/ELP［I］40及pIG6LH/ELP［I］40+Trx，分別將構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主菌E. coli BLR（DE3），IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，采用可逆相變循環(huán)（Inverse transition cycling，ITC）技術(shù)純化蛋白。測定ELP［I］40及ELP［I］40+Trx蛋白相變溫度（Tt），檢測ELP［I］40、ELP［I］40+Trx蛋白濃度及NaCl對相變溫度的影響。結(jié)果顯示，經(jīng)3輪ITC純化得到了ELP［I］40、ELP［I］40+Trx蛋白。分別測定ELP［I］40和ELP［I］40+Trx在10、25、50、75和100 μmol/L濃度下的Tt，其Tt依次為31.5℃、29℃、27℃、26℃、25℃和31.8℃、29.5℃、27.5℃、26℃、25.5℃；測定了不同濃度的NaCl對Tt影響，在ELP［I］40和ELP［I］40+Trx終濃度為25 μmol/L，NaCl濃度為0.25、0.5、0.75、1.00和1.25 mol/L時(shí)，分別使ELP［I］40的Tt由29℃降至24.5℃、22℃、19℃、15℃和11.5℃，使ELP［I］40+Trx的Tt由29.5℃降至25℃、23℃、20.2℃、15.5℃和11.8℃。在大腸桿菌周質(zhì)空間表達(dá)的ELP［I］40與胞內(nèi)表達(dá)的具有相同的理化性質(zhì)，ELP可作為在大腸桿菌周質(zhì)空間表達(dá)的蛋白質(zhì)分離純化標(biāo)簽。

類彈性蛋白標(biāo)簽；硫氧還蛋白；大腸桿菌；周質(zhì)空間；分離純化

大腸桿菌是內(nèi)膜和外膜組成的雙層膜結(jié)構(gòu)，在內(nèi)外膜之間的區(qū)域稱為周質(zhì)空間（Periplasmic Space）［1-3］，在大腸桿菌周質(zhì)空間的氧化環(huán)境有利于重組蛋白正確折疊，形成正確的二硫鍵，直接形成具有生物活性的重組蛋白，在周質(zhì)空間中蛋白質(zhì)更穩(wěn)定［4］。而胞內(nèi)表達(dá)重組蛋白多為包涵體，這種表達(dá)方式產(chǎn)量雖高，但要經(jīng)過變性-復(fù)性等復(fù)雜步驟后才能獲得活性蛋白，且只能部分蛋白獲得活性［1-5］。分泌表達(dá)是在信號肽Mel、OmpA、PelB、PheA 的引導(dǎo)下，分泌到大腸桿菌周質(zhì)空間，同時(shí)完成二硫鍵形成與肽鏈折疊，成為有活性的蛋白分子，但是這種表達(dá)方式產(chǎn)量較低，不易分離純化［5］。

類彈性蛋白（Elastin-like polypeptide，ELP）是基因工程方法合成，對溫度敏感的新型重組蛋白分離純化標(biāo)簽。由五肽重復(fù)序列單元（VPGXG）n串聯(lián)組成，其中X（除脯氨酸外的任意一種氨基酸）稱為客座殘基，n代表ELP鏈中五肽重復(fù)次數(shù)［6］。ELP具有溫度誘導(dǎo)的可逆相變性質(zhì)，并且ELP融合蛋白仍然具有這種特性［7，8］。多次可逆相變循環(huán)（Inverse transition cycling，ITC）之后，可以選擇性地分離出ELP融合蛋白。這種非色譜分離純化重組蛋白方法，具有技術(shù)簡單、成本低廉，節(jié)省時(shí)間，易于擴(kuò)大等優(yōu)點(diǎn)［9］。目前，類彈性蛋白作為蛋白質(zhì)分離純化標(biāo)簽在大腸桿菌胞內(nèi)已經(jīng)有系統(tǒng)的研究報(bào)道，但是尚未見在大腸桿菌周質(zhì)空間中表達(dá)研究報(bào)道，ELP標(biāo)簽?zāi)芊裨诜置谛盘栆龑?dǎo)下在大腸桿菌周質(zhì)空間中正確表達(dá)需要進(jìn)行研究。

本研究擬采用硫氧還蛋白（Thioredoxin，Trx）［10］為模式蛋白［7，11，12］，對周質(zhì)空間中表達(dá)的ELP［I］40和ELP［I］40+Trx理化性質(zhì)進(jìn)行分析，并考察不同影響因子對ELP［I］40、ELP［I］40+Trx的影響，旨在研究ELP［I］40及ELP［I］40+Trx在大腸桿菌周質(zhì)空間中表達(dá)情況。

1　材料與方法

1.1材料

限制性內(nèi)切酶EcoRⅤ、HindⅢ、EcoRⅠ、XhoⅠ、NcoⅠ、T4 DNA連接酶、T4 DNA聚合酶、堿性磷酸酶（BAP）、DL2000 DNA Marker及IPTG購自TaKaRa公司；DNA KB Marker購自Invitrogen公司；限制性內(nèi)切酶Dra Ⅲ、1 kb DNA Ladder、PageRulerTMPrestained Protein Ladder購自Fermentas公司；氨芐青霉素（Amp）購自生工生物工程（上海）有限公司；TMB顯色液購自Sigma公司；ELP［I］40基因由本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)并構(gòu)建［13］，大腸桿菌周質(zhì)空間表達(dá)載體pIG6LH（圖1）由瑞士蘇黎世大學(xué)Andreas Plückthun 教授惠贈（Professor Andreas Plückthun，University of Zurich，Switzerland），該載體在目的基因上游引入編碼大腸桿菌分泌信號肽ompA序列，可使表達(dá)的目的蛋白分泌到質(zhì)周腔中，有利于表達(dá)具有二硫鍵的目的蛋白；甲醇為分析純；根據(jù)pET28（+）含有的6×his與pIG6基因序列設(shè)計(jì)PCR引物：P1 為5'-CCGATATCACCATGGGCAGCAGCCA-3'，P2為5'-CCGATATCTTAGCAGCCGGATCTCAGTG-3'；P1含有EcoRⅤ、NcoⅠ酶切位點(diǎn)，P2含有EcoRⅤ酶切位點(diǎn)，引物委托生工生物工程（上海）有限公司合成，HAP純化。

圖1　pIG6LH表達(dá)載體

1.2方法

1.2.1周質(zhì)空間表達(dá)載體pIG6LH的構(gòu)建 為了ELP［I］n初次分泌到大腸桿菌周質(zhì)空間表達(dá)后，能夠利用6×his標(biāo)簽進(jìn)行常規(guī)檢測，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了含有6×his的表達(dá)載體pIG6LH。以pET28（+）為模板，用引物P1：5'-CCGATATCACCATGGGCAGCAGCCA -3'（下劃線為EcoR V、Nco I酶切位點(diǎn)）、P2：5'-CCGATATCTTAGCAGCCGGATCTCAGTG-3'（下劃線為EcoR V酶切位點(diǎn)），進(jìn)行目的基因6×his的PCR擴(kuò)增，EcoR V單酶切PCR產(chǎn)物，得到目的基因，大小為196 bp；質(zhì)粒pIG6進(jìn)行Hind Ⅲ單酶切，使其線性化并露出3'-末端凹陷的黏性末端。利用T4 DNA聚合酶對黏性末端補(bǔ)平，EcoRⅤ單酶切由Hind Ⅲ單酶切且末端平滑化的載體片段。將目的基因與線性化載體片段進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化構(gòu)建重組質(zhì)粒，并使用EcoRⅤ、Nco I/Xho I、EcoR V/Nco I對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。

1.2.2pIG6LH/ELP［I］40的構(gòu)建 使用限制性內(nèi)切酶Nco I和Xho I雙酶切質(zhì)粒pAK400LH/ELP ［I］40［13］，凝膠回收酶切產(chǎn)物（目的基因ELP ［I］40，大小為701 bp），將回收產(chǎn)物與周質(zhì)空間表達(dá)載體pIG6LH相連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E. coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，用LB/Amp（100 μg/mL）平板篩選陽性克隆，挑單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證、NcoⅠ/ XhoⅠ雙酶切驗(yàn)證，篩選陽性克隆送往南京金斯瑞生物科技有限公司測序。構(gòu)建成功的表達(dá)載體命名為pIG6LH/ELP［I］40。

1.2.3pIG6LH/ELP［I］40+Trx的構(gòu)建 根據(jù)GenBank中Trx基因序列，設(shè)計(jì)在其兩端引入EcoR I、Hind III酶切識別位點(diǎn)，合成Trx基因序列，由生工生物工程（上海）有限公司合成質(zhì)粒pUC57/Trx。EcoR I/Hind III雙酶切質(zhì)粒pUC57/Trx與載體pIG6LH/ELP［I］40，將酶切后的目的基因Trx與pIG6LH/ELP［I］40載體骨架連接，構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pIG6LH/ELP［I］40+Trx，送至南京金斯瑞生物科技有限公司測序鑒定。

1.2.4ELP［I］40和ELP［I］40+Trx小量表達(dá)與Western blot檢測 提取1.2.2和1.2.3構(gòu)建正確的表達(dá)質(zhì)粒pIG6LH/ELP［I］40、pIG6LH/ELP［I］40+ Trx，并轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主菌E. coli BLR（DE3），在LB/Amp（100 μg/mL）平板上篩選轉(zhuǎn)化子。挑取生長狀態(tài)良好的單克隆，接種于LB/Amp（100 μg/mL）培養(yǎng)液中，37℃振蕩過夜培養(yǎng)，次日按1∶100的比例轉(zhuǎn)接于5 mL新鮮LB/Amp（100 μg/mL）中，37℃振蕩培養(yǎng)至細(xì)菌密度達(dá)到OD600=0.6-0.8加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，25℃誘導(dǎo)3 h后，以1 OD為單位離心收集菌體樣品。SDS裂解液裂解菌體，進(jìn)行Western blot檢測表達(dá)情況。

1.2.5ELP［I］40、ELP［I］40+Trx大量表達(dá)、純化與SDS-PAGE電泳分析 將表達(dá)體系擴(kuò)大到500 mL，按1.2.4的方法進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，3 600 r/min離心6 min收集菌體，置冰浴中超聲波裂解細(xì)胞，離心收集上清；加入DNase（DNA酶）使終濃度為50 μg/mL，冰浴20 min，10 000 r/min、離心15 min，棄沉淀，將上清移入新管；向上清液中添加NaCl至終濃度為 2 mol/L，37℃水浴、20 min，10 000 r/min、離心15 min，棄上清，然后加入20 mL預(yù)冷的PBS重懸沉淀，冰浴20 min，10 000 r/min、離心15 min，棄沉淀，將上清移入新管（為一輪ITC，此步驟重復(fù)3次）；經(jīng)過3輪ITC純化得到ELP［I］40、ELP［I］40+Trx純化蛋白，取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.6ELP［I］40和ELP［I］40+Trx蛋白定量與相變溫度測定 干燥稱量法定量ELP［I］40、ELP［I］40+ Trx存儲液。先將ELP［I］40、ELP［I］40+Trx母液各取1 mL分別于1.5 mL離心管中，將上述母液121℃溫度下高壓蒸汽滅菌20 min并于60℃干燥箱干燥稱量至重量不再變化為止，計(jì)算出樣品凈重。用PBS將ELP［I］40、ELP［I］40+Trx存儲母液稀釋成25 μmol/L濃度，按每孔100 μL接種于96孔板中，以1℃為梯度用酶標(biāo)儀（Multiskan GO）測定從16℃-39℃蛋白溶液在350 nm處的吸光度值，升溫速率為1℃/5 min。當(dāng)某個(gè)溫度下OD350是最大吸光值一半時(shí)，該溫度為Tt［7］。

1.2.7ELP［I］40、ELP［I］40+Trx蛋白濃度對相變溫度的影響 ELP 融合蛋白表達(dá)濃度一般較低，利用ITC 技術(shù)純化ELP及ELP融合蛋白的實(shí)際應(yīng)用中，ELP濃度與Tt的關(guān)系非常重要，本研究測定了ELP［I］40和ELP［I］40+Trx濃度對Tt的影響。分別將ELP［I］40、ELP［I］40+Trx存儲母液配制成濃度依次為10、25、50、75和100 μmol/L，按照1.2.6的測定方法測定0℃-45℃每個(gè)蛋白濃度下的Tt。

1.2.8NaCl對ELP［I］40、ELP［I］40+Trx相變溫度的影響 本研究所構(gòu)建的ELP［I］n表達(dá)的蛋白，經(jīng)過Tt測定，已經(jīng)證實(shí)比現(xiàn)有的同分子量的ELP標(biāo)簽的Tt低，是蛋白分離純化標(biāo)簽的首選，但是考慮到某些親水性目的蛋白“融合ΔTt效應(yīng)”，測定了在ITC純化ELP融合蛋白時(shí)常用的鹽離子NaCl 與Tt的關(guān)系。配制2 mol/L的NaCl母液. 用PBS 將ELP［I］40、ELP［I］40+Trx儲存母液稀釋為25 μmol/L，并配成濃度為0.25、0.5、0.75、1.00 和1.25 mol/L的NaCl。按照1.2.6的測定方法測定0℃-45℃范圍不同濃度的NaCl對終濃度分別為25 μmol/L的ELP［I］40、ELP［I］40+Trx的Tt影響。

2　結(jié)果

2.1pIG6LH表達(dá)載體的構(gòu)建

重組質(zhì)粒pIG6LH用限制性內(nèi)切酶EcoRⅤ單酶切，初步鑒定陽性克??；Nco I/Xho I雙酶切，對照重組質(zhì)粒pIG6LH圖譜，切出140 bp基因片段的為修飾正確的載體，第二步鑒定陽性克??；EcoRⅤ/ Nco I雙酶切，根據(jù)pIG6LH圖譜，切出180 bp左右大小的為修飾方向不正確的載體，切出5 kb左右大小的為修飾方向正確的載體，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳（圖2）分析，圖2中泳道1最后鑒定為陽性，并送公司測序鑒定。

圖2　EcoR V/Nco I雙酶切pIG6LH載體

2.2pIG6LH/ELP［I］40、pIG6LH/ELP［I］40+Trx的構(gòu)建

Nco I/Xho I雙酶切鑒定pIG6LH/ELP［I］40，目的基因?yàn)?01 bp（圖3）；EcoRⅠ/Hind Ⅲ雙酶切鑒定pIG6LH/ELP［I］40+Trx，目的基因?yàn)?17 bp（圖4），經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分析表明，均有預(yù)計(jì)大小的特異性條帶，分別選一陽性克隆進(jìn)行測序鑒定，結(jié)果證實(shí)周質(zhì)空間表達(dá)載體pIG6LH/ELP［I］40、pIG6LH/ELP［I］40+Trx開放閱讀框完全正確，載體構(gòu)建成功。

圖3　NcoⅠ/XhoⅠ雙酶切pIG6LH/ELP［I］40

圖4　EcoRⅠ/HindⅢ雙酶切pIG6LH/ELP［I］40+Trx

2.3Western blot檢測ELP［I］40的表達(dá)

將含表達(dá)載體pIG6LH/ELP［I］40和pIG6LH/ ELP［I］40+Trx的BLR（DE3）菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后分別在37℃和25℃表達(dá)，Western blot檢測結(jié)果（圖5）表明，重組蛋白ELP［I］40和ELP［I］40+Trx均成功分泌到周質(zhì)空間，分別表達(dá)約為20.36 和34.77 kD的特異蛋白條帶。但是在37℃誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，有部分蛋白沒有過膜現(xiàn)象，殘留信號肽，如圖5-A和5-B中的第2泳道中有兩條特異條帶，表明有部分重組蛋白未能穿過細(xì)胞膜到達(dá)質(zhì)周腔，有信號肽殘留。由結(jié)果可以看出檢測到的蛋白分子量比實(shí)際分子量偏大，符合ELP的相關(guān)報(bào)道［14，15］。

2.4SDS-PAGE分析ELP［I］40、ELP［I］40+Trx表達(dá)與純化

選擇25℃進(jìn)行ELP［I］40、ELP［I］40+Trx大量表達(dá)，超聲破碎后，通過控制溫度利用ITC技術(shù)純化蛋白，經(jīng)3輪ITC循環(huán)純化ELP［I］40（20.36 kD）、ELP［I］40+Trx（34.77 kD）。SDS-PAGE分析（圖6）表明，經(jīng)3輪ITC純化得到了ELP［I］40、ELP［I］40+Trx純蛋白；Gel DocTMEZ imager凝膠成像系統(tǒng)分析表明，蛋白純度高達(dá)90％。說明ELP ［I］40作為純化標(biāo)簽在大腸桿菌周質(zhì)空間成功應(yīng)用。

圖5　Western blot檢測ELP［I］40的表達(dá)

圖6　SDS-PAGE分析ELP［I］40及ELP［I］40+Trx的表達(dá)與純化

2.5ELP［I］40、ELP［I］40+Trx蛋白定量與相變溫度測定

干燥稱量法定量ELP［I］40、ELP［I］40+Trx母液濃度。用PBS將ELP［I］40、ELP［I］40+Trx儲存母液稀釋成25 μmol/L濃度，按每孔100 μL接種于96孔板中，以1℃為梯度用酶標(biāo)儀測定從16℃-39℃蛋白溶液在350 nm處的吸光度值，升溫速率為1℃/5 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖7）表明ELP［I］40的Tt為29℃，ELP［I］40+Trx的Tt為29.5℃ 。

圖7　ELP［I］40和ELP［I］40+Trx（濃度均為25 μmol/L）相變溫度測定

2.6ELP［I］40、ELP［I］40+Trx蛋白濃度對相變溫度的影響

本研究分別測定ELP［I］40、ELP［I］40+Trx 在10、25、50、75和100 μmol/L濃度下的Tt，結(jié)果表明，ELP［I］40的Tt依次為31.5℃、29℃、27℃、26℃和25℃，ELP［I］40+Trx的Tt依次為31.8℃、29.5℃、27.5℃、26℃和25.5℃。如圖8所示，蛋白濃度為10 μmol/L時(shí)ELP［I］40、ELP［I］40+Trx的Tt分別為31.5℃、31.8℃，將蛋白濃度升高為100 μmol/L時(shí)，Tt分別低至25℃、25.5℃。ELP及ELP融合蛋白濃度與Tt呈反比關(guān)系，即隨著蛋白濃度增加，Tt降低，利于ELP及其融合蛋白的分離純化工作。蛋白濃度對ELP［I］40和ELP［I］40+Trx的Tt的影響具有相似的趨勢。

2.7NaCl對ELP［I］40、ELP［I］40+Trx相變溫度的影響

測定結(jié)果（圖9）顯示，隨著NaCl濃度增高，Tt明顯降低，ELP及其融合蛋白具有相似性質(zhì)［7，8］。其中在ELP［I］40、ELP［I］40+Trx終濃度為25 μmol/L的條件下，1.25 mol/L的NaCl使Tt分別降至11.5℃、11.8℃。在利用ITC技術(shù)純化ELP融合蛋白的實(shí)際應(yīng)用中，一般需要添加1-3 mol/L的NaCl才能使Tt降至37℃左右［16-18］，而本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的ELP［I］40在不添加任何鹽離子的情況下，就能達(dá)到理想的Tt。

圖8　ELP［I］40及ELP［I］40+Trx蛋白濃度對相變溫度的影響

圖9　NaCl對ELP［I］40、ELP［I］40+Trx相變溫度的影響

3　討論

ELP作為重組蛋白分離純化標(biāo)簽在大腸桿菌周質(zhì)空間成功應(yīng)用。Trx作為模式蛋白與ELP［I］40融合構(gòu)建了ELP［I］40+Trx融合蛋白，優(yōu)化了表達(dá)溫度。Western blot檢測結(jié)果（圖4）表明，當(dāng)表達(dá)溫度為37℃，目的蛋白不能完全跨膜表達(dá)，當(dāng)表達(dá)溫度為25℃時(shí)，目的蛋白完全跨膜分泌表達(dá)，并成功分泌大腸桿菌周質(zhì)空間表達(dá)。利用ITC技術(shù)純化，得到ELP［I］40、ELP［I］40+Trx純蛋白，結(jié)果顯示蛋白純度高達(dá)90％。當(dāng)ELP［I］40、ELP［I］40+Trx母液濃度為25 μmol/L，測定ELP［I］40的Tt為29℃，ELP［I］40+Trx的Tt為29.5℃。ELP 融合蛋白表達(dá)濃度一般不高，利用ITC技術(shù)純化ELP及ELP融合蛋白的實(shí)際應(yīng)用中，ELP濃度與Tt的關(guān)系非常重要。本實(shí)驗(yàn)考察了ELP［I］40、ELP［I］40+Trx蛋白濃度對Tt的影響，測定ELP［I］40、ELP［I］40+Trx在不同蛋白濃度下的Tt，結(jié)果表明隨著蛋白濃度的升高，Tt降低；考慮到某些親水性目的蛋白“融合ΔTt效應(yīng)”，本研究考察了不同濃度的NaCl對ELP［I］40、ELP［I］40+Trx的Tt影響，測定結(jié)果表明，隨著NaCl濃度增高，Tt明顯降低。ELP及其融合蛋白對鹽離子敏感，可以通過添加鹽離子來提高分離純化效率。不同種類鹽離子對ELP的Tt影響遵循霍夫邁斯特離子序［19］（Hofmeister series），即陰離子SO42-＞ HPO42-＞ CH3COO-＞ Cl-＞Br-＞ NO3-＞ClO4-＞ SCN-，陽離子NH4+＞K+＞Na+＞Mg2+＞Ca2+＞Mn2+＞Cu2+。

4　結(jié)論

ELP作為大腸桿菌周質(zhì)空間重組蛋白純化標(biāo)簽初步應(yīng)用，為重組蛋白的分離純化工作提供了簡便、快速、高效的方法。pIG6LH/ELP［I］40在大腸桿菌周質(zhì)空間成功表達(dá)，解決了蛋白分泌到周質(zhì)空間一般表達(dá)量低，純化效率低等問題，與傳統(tǒng)純化方法相比，具有效率高、成本低、時(shí)間短、不需要復(fù)雜儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)還極大地提高了目的蛋白的純度。

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（責(zé)任編輯 李楠）

The Expression of Elastin-like Polypeptide Tag in Periplasmic Space of Escherichia coli

LI Jing-quan1LIN Heng2DING Ning2ZUO Xiao-xue2SHI Jin-ping2XU Yong-ping1LENG Chun-ling3
YANG Chun-guang2
（1. School of Life Science and Biotechnology，Dalian University of Technology，Dalian 116024；2. Medical College，Dalian University，Dalian 116622；3. Agriculture College of Eastern Liaoning University，Dandong 118003）

This work aims to investigate the expression of elastin-like polypeptide［I］40（ELP［I］40）in the periplasmic space of Escherichia coli. The expression vectors of pIG6LH/ELP［I］40and pIG6LH/ELP［I］40+Trx were constructed and transfected into E. coli BLR （DE3）and induced to express by IPTG. Recombinant ELP fusion protein were purified by inverse transition cycling（ITC）. Inverse temperature transition（Tt）of ELP［I］40and ELP［I］40+Trx protein were measured. The effects of the concentrations of ELP［I］40and ELP ［I］40+Trx proteins and NaCl on phase-transition temperature were investigated. ELP［I］40and ELP［I］40+Trx protein were purified by 3 round ITC. When the protein concentration of ELP［I］40and ELP［I］40+Trx were 10 μmol/L，25 μmol/L，50 μmol/L，75 μmol/L，and 100 μmol/L，the Ttwere 31.5℃，29℃，27℃，26℃，25℃ and 31.8℃，29.5℃，27.5℃，26℃，25.5℃ respectively. When the final concentrations of ELP［I］40and ELP［I］40+Trx were 25 mmol/L respectively and the NaCl concentration was 0.25 mol/L，0.5 mol/L，0.75 mol/L，1.00 mol/L，and 1.25 mol/L respectively，the Ttof ELP［I］40decreased from 29℃ to 24.5℃，22℃，19℃，15℃，and 11.5℃respectively and the Ttof ELP［I］40+Trx from 29.5℃ to 25℃，23℃，20.2℃，15.5℃，and 11.8℃ respectively. The ELP［I］40in the periplasmic space of E. coli possessed the same physicochemical properties as the intracellular one，and the ELP could be used as an isolation and purification tag of expressed proteins in E. coli's periplasmic space.

elastin-like polypeptide tag；thioredoxin；Escherichia coli；periplasmic space；purification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.031

2015-12-31

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31370937），大連大學(xué)博士啟動基金項(xiàng)目（L2010015），大連大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（2013110）

李晶泉，女，博士研究生，研究方向：生物化工；E-mail：lijq@takara.com.cn

冷春玲，女，學(xué)士，教授，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：chunlingleng@163.com楊春光，男，博士，講師，研究方向：蛋白質(zhì)工程；E-mail：yangchunguang@dlu.edu.cn