家蠅肽聚糖識別蛋白（PGRP-SA）的克隆表達及細菌結(jié)合研究

羅嫚王宇，2胡亞修江帆王濤彭建尚小麗吳建偉

（1. 貴州醫(yī)科大學寄生蟲學教研室，貴陽 550004；2. 貴州省疾病預防控制中心，貴陽 550004）

家蠅肽聚糖識別蛋白（PGRP-SA）的克隆表達及細菌結(jié)合研究

羅嫚1王宇1，2胡亞1修江帆1王濤1彭建1尚小麗1吳建偉1

（1. 貴州醫(yī)科大學寄生蟲學教研室，貴陽 550004；2. 貴州省疾病預防控制中心，貴陽 550004）

對家蠅PGRP-SA 基因進行克隆表達以及研究其重組蛋白與細菌結(jié)合能力。從構(gòu)建的家蠅（Musca domestica）幼蟲cDNA 質(zhì)粒文庫中篩選到PGRP-SA基因，以cDNA 質(zhì)粒為模板設計引物，通過PCR 擴增，獲得PGRP-SA 基因完整編碼序列。運用生物信息學方法對該基因及其編碼蛋白進行預測和分析。構(gòu)建pET-28a（+）-PGRP-SA重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）中進行誘導表達及蛋白純化。利用半定量RT-PCR 檢測PGRP-SA在家蠅3齡幼蟲不同組織中的表達量差異。PGRP-SA重組蛋白進行微生物結(jié)合實驗。結(jié)果表明，PGRP-SA基因ORF 全長615 bp，編碼204個氨基酸，理論分子量22.8 kD，等電點9.11，具有保守的PGRP結(jié)構(gòu)域。成功構(gòu)建了pET-28a（+）-PGRP-SA重組質(zhì)粒，蛋白經(jīng)IPTG 誘導后在大腸桿菌中獲得表達，經(jīng)親和層析柱純化獲得目的蛋白，利用Western blot 檢測證明純化蛋白與預期大小相符。PGRP-SA在家蠅3齡幼蟲血淋巴、脂肪體、前腸、中腸、氣管、馬氏管都有表達，血淋巴組織中表達量最高，后腸無表達，由此說明PGRP-SA基因的表達具有一定的組織性。PGRP-SA重組蛋白能與金黃色葡萄球菌和大腸桿菌結(jié)合，與白色念珠菌不能結(jié)合。成功表達及純化家蠅PGRP-SA蛋白，證實家蠅PGRP-SA能與金黃色葡萄球菌和大腸桿菌結(jié)合。

家蠅；先天免疫；肽聚糖識別蛋白；原核表達；微生物結(jié)合實驗

先天免疫是多細胞生物抵御微生物入侵的第一道防線，機體的識別受體通過識別入侵的微生物來引發(fā)免疫反應。對于昆蟲來說，它是直接且唯一的應對微生物感染的途徑。其中，肽聚糖識別蛋白（peptidoglycan recognition proteins，PGRPs）家族是昆蟲先天免疫系統(tǒng)中重要的模式識別受體，從昆蟲到人類都高度保守，其在識別入侵病原物和激活免疫途徑的調(diào)控方面起著重要作用［1］。肽聚糖識別蛋白具有一個約為165個氨基酸的保守的肽聚糖（peptidoglycan，PGN）結(jié)合結(jié)構(gòu)域，稱為PGRP結(jié)構(gòu)域，其序列與T7溶菌酶有30％的相似性［2］。有些PGRPs能夠識別細菌所獨有的肽聚糖結(jié)構(gòu)，并且啟動抗菌肽基因的轉(zhuǎn)錄及合成［3-5］；PGRPs對肽聚糖的識別也會啟動酚氧化酶原途徑的激活，引起黑化反應。具有酰胺酶活性的PGRPs可以促進吞噬作用，還可以抑制抗菌肽合成從而減弱過度的免疫反應所帶來的損害。還有一些PGRPs可作為效應因子直接將細菌殺死［6-8］。

目前，果蠅已鑒定的PGRPs有13個。其中，PGRP-SA是果蠅第一個被鑒定為主要在血淋巴中表達的PGRP［9］，它主要與革蘭氏陽性菌肽聚糖結(jié)合，然后和PGRP-SD以及GNBP1 共同作用于Spatzle，Spatzle能激活Toll信號通路誘導抗菌肽產(chǎn)生從而消滅病原體［10］。果蠅的PGRP-LC是Imd信號通路上游一個重要的跨膜受體，主要識別革蘭氏陰性菌肽聚糖激活抗菌肽的合成［11］。另外，研究表明果蠅的PGRP-SC1a/b，LB，SB1/2，SC2具有酰胺酶活性，能對Imd途徑進行負調(diào)控，消除過多的抗菌肽，避免過度免疫反應造成的損害，其對果蠅幼蟲的發(fā)育是至關重要的［12］。

家蠅在地球上廣泛分布，長期暴露于比果蠅生存條件更惡劣的環(huán)境中，家蠅能夠攜帶大量的致病微生物而健康的生活，具有強大的先天性免疫系統(tǒng)，是研究昆蟲與病原物互作機制的理想模型之一［13，14］。家蠅肽聚糖識別蛋白功能的研究有助于理解家蠅的先天性免疫機制。此外，家蠅PGRPs的鑒定及功能研究對了解果蠅和家蠅之間的共性和差異是有所幫助的。對家蠅的PGRP-SC研究表明，PGRP-SC的下調(diào)導致抗菌肽的高表達以及抑制家蠅幼蟲的化蛹［15］。果蠅PGRP-SC的相關研究表明PGRP-SC能延長衰老蒼蠅的壽命，未見抑制蛹化的報道。目前關于果蠅的PGRP-SA有很多報道，但家蠅肽聚糖識別蛋白SA類基因的研究鮮有報道。本研究以家蠅為研究對象，克隆得到PGRP家族的基因PGRP-SA及對其進行不同組織的表達分析，并進行蛋白的表達純化，利用重組蛋白進行微生物結(jié)合實驗，以期為進一步揭示該基因在家蠅免疫防御體系中的功能提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物和菌株 家蠅3 齡幼蟲由貴州醫(yī)科大學病原生物學實驗室飼養(yǎng)。pET-28a（+）質(zhì)粒，大腸桿菌BL21（DE3），金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，白色念珠菌均由貴州醫(yī)科大學病原生物學實驗室常規(guī)保存。

1.1.2主要試劑和儀器 總RNA 提取試劑TRIzol Reagent、rTaq 酶、T4連接酶、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、DL2000及DL10000 DNA Marker、蛋白Marker、抗His標簽抗體、羊抗兔IgG/HRP等購置于TaKaRa 公司；所用引物由上海生工生物工程公司合成。無水乙醇、甲醇、異丙醇、三氯甲烷等均為國產(chǎn)分析純試劑。PCR擴增儀（德國Eppendorf公司），凝膠成像系統(tǒng)IQuant400（美國Amersham Pharmacia公司），冷凍高速離心機（美國德國Eppendorf公司）。

1.2方法

1.2.1生物信息學分析 通過NCBI Blast（http//www.ncbi.blastX）檢測PGRP-SA基因的完整編碼序列和開放閱讀框；運用Signal P4.1（http：//www. cbs. dtu. Dk/services/SignalP/）分析信號肽位點；利用蛋白分析專家系統(tǒng)（ExPASy）分析預測PGR-SA基因編碼蛋白的理化性質(zhì)；用Smart軟件分析PGRP-SA的功能結(jié)構(gòu)域。

1.2.2總RNA提取及cDNA合成 按照TakaRa公司TRIzol說明書分別提取家蠅3齡幼蟲的不同組織（血淋巴、脂肪體、前腸、中腸、后腸、氣管、馬氏管）及整蟲的總RNA?？俁NA經(jīng)電泳檢測，并利用GeneQuant核酸定量分析儀測定A260/A280比值及濃度，以1 μg總RNA為模板按照cDNA合成試劑盒說明書合成cDNA。

1.2.3引物的設計及基因擴增 設計引物的軟件為Premier 5.0 軟件，PGRP-SA-F：5'-AAACATATG TCGAATGATTCGCAGCCATCGTC-3'（下劃線為Nde I）酶切位點；PGRP-SA-R：5'-CGCCTCGAGTCAT TTTTTATTCGACGCATT-3'（下劃線為Xho I酶切位點）。以整蟲cDNA為模板，應用上述引物進行目的基因擴增，PCR條件：94℃預變性5 min；94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 1 min，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物行1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并利用DNA凝膠回收試劑盒進行DNA回收。

1.2.4重組原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建 將回收的PCR產(chǎn)物和pET-28a（+）質(zhì)粒分別雙酶切后回收，利用T4連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞，涂布于含Kan+抗性的LB平板上篩選陽性單克隆，擴大培養(yǎng)后對陽性克隆提取重組質(zhì)粒，測序鑒定。

1.2.5重組蛋白的誘導表達、純化及Western blot 鑒定 將鑒定正確的pET-28a（+）-PGRP-SA 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)至E.coli BL21/ DE3感受態(tài)細胞中，涂布于含Kan+抗性的LB平板上篩選陽性單克隆，然后接種于含卡那霉素的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，放入37℃搖床培養(yǎng)，搖至OD600約為0.6 時，加入IPTG 至終濃度為0.4 mmol/L，繼續(xù)37℃搖5 h，進行15％SDS-PAGE電泳分析表達情況。對陽性克隆進行大量的誘導表達，超聲裂解后離心收集沉淀，用強變性劑尿素進行蛋白沉淀的溶解及透析復性，根據(jù)Ni-IDA Agarose說明書進行蛋白純化，進行15％ SDS-PAGE電泳分析，將蛋白于-80℃保存?zhèn)溆?。利用兔來源的抗His標簽的抗體為一抗，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG 抗體為二抗，Western blot 鑒定純化的PGRP-SA重組蛋白。

1.2.6PGRP-SA在不同組織的半定量RT-PCR分析 以家蠅RPSl8基因為內(nèi)參，其引物為RPS18-F：5'-ATGTCGCTCGTTATCCCAGAAAAG-3'，RPS18-R：5'-TTACTTCTTCTTGGATACACCGACA-3'。以家蠅3齡幼蟲不同組織cDNA為模板，應用RTPCR分別擴增PGRP-SA基因及RPSl8基因。PCR條件為：94℃預變性5 min；94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 45 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物行1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.7PGRP-SA重組蛋白與微生物的結(jié)合實驗 將進行微生物結(jié)合實驗的目的菌株（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌）進行過夜培養(yǎng)，第2天以6 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min收集菌體，用1 mL TBS 緩沖液懸起，洗滌兩次，棄上清，分別加入1 mL重組蛋白PGRP-SA，室溫條件（25℃）下?lián)u床孵育1 h；6 000 r/min離心5 min后棄上清，用1 mL TBS緩沖液洗滌沉淀，重復3次。離心后收集最后的菌體沉淀和洗滌液。處理樣品后利用Western blot方法檢測結(jié)合實驗的效果［16］。使用抗His 標簽的抗體為一抗，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG 抗體為二抗。

2　結(jié)果

2.1家蠅PGRP-SA基因的生物信息學分析

該cDNA序列ORF 長為615 bp（登錄號：XM_005186981），編碼204個氨基酸（圖1）。預測家蠅PGRP-SA蛋白的理論分子量為22 821.1 Da，等電點為9.11，屬于堿性蛋白質(zhì)。預測在溶液中性質(zhì)穩(wěn)定。運用Signal P結(jié)果顯示該編碼蛋白存在信號肽序列，位于 1-24位氨基酸之間，因此判定該編碼蛋白為分泌型蛋白。運用Smart 軟件分析PGRP-SA的功能結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)了它的功能結(jié)構(gòu)域PGRP結(jié)構(gòu)域位于第35-第177位氨基酸，推測此蛋白可能具有能與肽聚糖結(jié)合并在信號通路中發(fā)揮作用的功能。

2.2原核重組質(zhì)粒的鑒定

將切除信號肽后的目的基因PCR擴增，分別將PGRP-SA 的PCR 產(chǎn)物和pET-28a（+）雙酶切回收后，通過T4 連接酶連接并轉(zhuǎn)入表達宿主菌。對陽性克隆提取重組質(zhì)粒雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖2）顯示約500 bp處有一目的條帶，大小與目的基因基本相符，測序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1　PGRP-SA基因開放閱讀框cDNA序列及對應編碼的氨基酸序列

圖2　pET-28a（+）-PGRP-SA重組質(zhì)粒 PCR 鑒定

圖3　PGRP-SA重組蛋白的誘導表達

2.3蛋白表達、純化及鑒定

將構(gòu)建好的pET-28a（+）-PGRP-SA轉(zhuǎn)化到表達宿主菌中經(jīng)0.4 mmol/L的IPTG誘導表達，進行15％ SDS-PAGE 電泳。結(jié)果（圖3第4、6泳道）所示，約在 24 kD左右出現(xiàn)蛋白表達條帶，純化后的重組蛋白為單一條帶（第7泳道），表明目的蛋白純化成功。對純化蛋白做Western blot 驗證，結(jié)果顯示目的條帶單一且清晰（第8泳道），說明目的蛋白表達正確。

2.4家蠅3齡幼蟲不同組織PGRP-SA基因的表達分析

以家蠅3齡幼蟲不同組織（血淋巴、脂肪體、前腸、中腸、后腸、氣管、馬氏管）cDNA為模板，進行RT-PCR擴增，結(jié)果（圖4）顯示內(nèi)參基因RPS18呈一致性表達，且表達量較為穩(wěn)定。PGRPSA在血淋巴、脂肪體、前腸、中腸、氣管、馬氏管都有表達，血淋巴中表達量最高，后腸組織無表達。

圖4　家蠅不同組織PGRP-SA基因的擴增結(jié)果

2.5PGRP-SA重組蛋白與微生物的結(jié)合實驗

PGRP-SA蛋白分別與金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌進行結(jié)合實驗，分別收集細菌沉淀及最后一次洗滌液，利用Western blot檢測實驗結(jié)果。如圖5第2、4泳道所示約在24 kD大小有蛋白目的條帶，且第3、5泳道顯示最后一次洗滌液都沒有目的蛋白，蛋白與第1泳道的PGRP-SA蛋白位置相一致。說明PGRP-SA能與金黃色葡萄球菌、大腸桿菌結(jié)合。第6泳道顯示PGRP-SA不能與真菌白色念珠菌結(jié)合。

3　討論

當細菌、病毒等病原體入侵昆蟲時，昆蟲首先靠自身的模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）來識別病原體相關分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs），從而激活相關先天免疫通路消除病原物［17］。在昆蟲先天免疫系統(tǒng)中，模式識別受體主要有PGRPs、β-葡聚糖識別蛋白（β-glucan recognitionprotein，β-GRP）和革蘭氏陰性菌結(jié)合蛋白（Gram-negative binding protein，GNBP）［18］。但其中最主要的模式識別受體是PGRPs，它通過識別病原生物表面的病原相關分子模式如肽聚糖，從而啟動先天免疫反應，激活Toll途徑、JAK-STAT途徑、IMD等途徑來產(chǎn)生抗菌肽對病原物進行清除。PGRPs是國內(nèi)外學者研究昆蟲免疫調(diào)控關鍵因子的熱點之一。

圖5　PGRP-SA蛋白微生物結(jié)合實驗

PGRPs是于1996年由Yoshida 等［19］首次在家蠶體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，對革蘭氏陽性菌的肽聚糖結(jié)構(gòu)有較高的結(jié)合能力，并且能導致黑化反應。對PGRPs識別肽聚糖的機制研究發(fā)現(xiàn)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的識別機制并不完全相同，革蘭氏陽性菌的肽聚糖是直接暴露在細胞壁的外層，PGRPs 直接與其結(jié)合；但革蘭氏陰性菌的肽聚糖則被細胞壁外層膜包被，PGRPs 如何識別革蘭氏陰性菌肽聚糖的機制還不完全清楚，目前有兩種假設，一種是革蘭氏陰性菌的部分肽聚糖發(fā)生了脫離，PGRPs 通過識別脫離的肽聚糖來激活免疫反應［20］。另外一種是吞噬細胞對革蘭氏陰性菌進行吞噬的時候，肽聚糖被暴露出來從而被果蠅PGRP所識別［21］。這兩種觀點還需要更多的實驗驗證。在關于PGRPs殺菌活性機制研究中，發(fā)現(xiàn)哺乳動物的肽聚糖識別蛋白沒有酰胺酶活性也能使細菌死亡，原因是在革蘭氏陽性菌分裂時哺乳動物PGRP能進入細菌細胞壁終止胞內(nèi)肽聚糖的合成［22］。果蠅PGRP的殺菌機制是利用其特異的酰胺酶活性殺死細菌。說明肽聚糖識別蛋白的殺菌機制存在物種間的差異，是否所有昆蟲的PGRPs殺菌機制都相似也是未知的。

革蘭氏陽性菌的肽聚糖主要被PGRP-SA或PGRP-SD識別從而激活Toll信號通路，啟動抗菌肽的合成。孫強［23］運用RT-PCR技術對亞洲玉米螟PGRP-SA基因在不同組織表達進行研究，結(jié)果顯示PGRP-SA的主要表達部位為中腸、表皮、脂肪體，并且對玉米螟4齡幼蟲進行革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌感染，發(fā)現(xiàn)PGRP-SA表達上調(diào)，革蘭氏陽性菌誘導后PGRP-SA上調(diào)量高于革蘭氏陰性菌。Zheng［24］對小菜蛾PGRP-SA研究發(fā)現(xiàn)PGRP-SA主要在血淋巴和脂肪體表達，與本研究結(jié)果相同。說明家蠅PGRP-SA基因的表達具有一定的組織性，顯示該基因可能在對病原生物表面的病原體相關分子模式的相互識別和作用并啟動家蠅先天性免疫應答進而抵御微生物發(fā)揮關鍵作用。對果蠅肽聚糖識別蛋白的研究發(fā)現(xiàn)果蠅PGRP-SA能夠激活Toll途徑，果蠅PGRP-SA（Cys80Tyr）的突變會導致其激活Toll途徑的活性失效。PGRP-SA能與Lys型肽聚糖和DAP型肽聚糖發(fā)生結(jié)合，但Toll途徑優(yōu)先被Lys型肽聚糖激活，對DAP型反應較弱［25］。Lys型肽聚糖即主要存在于革蘭氏陽性菌中。本研究表明家蠅PGRP-SA能與革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌、革蘭氏陰性菌大腸桿菌結(jié)合，推測PGRP-SA可能是家蠅先天免疫系統(tǒng)中應對細菌感染的一個重要因子。為下一步研究家蠅PGRP-SA參與激活Toll信號通路及抗菌肽的合成奠定了基礎。與果蠅同屬雙翅目的家蠅是否與果蠅具有相似的免疫識別機制呢？

本研究從家蠅幼蟲cDNA 文庫中篩選到并成功克隆了家蠅PGRP-SA基因，全長615 bp，編碼204個氨基酸，構(gòu)建pET-28a（+）-PGRP-SA 重組質(zhì)粒并在大腸桿菌中成功表達，利用親和層析法純化了PGRP-SA蛋白，繼而用Western blot 驗證目的蛋白表達正確。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)PGRP-SA在家蠅血淋巴、脂肪體、前腸、中腸、氣管、馬氏管均有表達，血淋巴組織中表達量最高。細菌結(jié)合實驗表明PGRPSA能與金黃色葡萄球菌和大腸桿菌結(jié)合。

4　結(jié)論

本研究成功構(gòu)建pET-28a（+）-PGRP-SA重組原核表達載體并表達出PGRP-SA蛋白，獲得純化蛋白。發(fā)現(xiàn)PGRP-SA在家蠅血淋巴中表達量最高，血淋巴是家蠅主要的免疫組織之一。證實了家蠅PGRP-SA能與金黃色葡萄球菌和大腸桿菌結(jié)合。

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（責任編輯 李楠）

Cloning，Expression and Bacterial Binding of Peptidoglycan Recognition Proteins-SA Gene from Musca domestica

LUO Man1WANG Yu1，2HU Ya1XIU Jiang-fan1WANG Tao1PENG Jian1SHANG Xiao-li1WU Jian-wei1
（1. Department of Parasitology，Guizhou Medical University，Guiyang 550004；2. Guizhou Provincial Center for Disease Control and Prevention，Guiyang 550004）

This work is to clone and express the Musca domestica peptidoglycan recognition proteins-SA（PGRP-SA）gene and research the microbial binding activity of it. The PGRP-SA gene was isolated from M. domestica larvae cDNA library，then primers were designed using cDNA plasmid as the template，and the complete encoding sequence of PGRP-SA was acquired by PCR. The bioinformatics methods were employed to predict and analyze the gene and its encoded proteins. The recombinant plasmid pET-28a（+）-PGRP-SA was expressed in Escherichia coli for induced expression and protein purification. RT-PCR was used to test the varied transcription levels of PGRP-SA gene in different tissues. The microbial binding activity of PGRP-SA protein was studied by the microorganism binding assay. The results indicated that the ORF full-length of PGRP-SA gene was 615 bp，encoding 204 amino acids. The molecular weight was 22.8 kD and pI 9.11 and had the conserved PGRP domain. After the recombinant plasmid pET-28a（+）-PGRP-SA was successfully constructed，it was expressed in E. coli by IPTG. SDS-PAGE and Western blot analysis showed that the functional protein purified by Ni2+affinity chromatography was in consistent as the predicted in size. PGRP-SA was expressed in three instars hemolymph，fat body，foregut，midgut，trachea，malpighian tube excepthindgut，the highest in the hemolymph，indicating that the expression of PGRP-SA was tissue-specific. Recombinant PGRP-SA protein bound to Staphylococcus aureus and E. coli，but not Monilia albica. Conclusively，the M. domestica PGRP-SA protein was successfully expressed and purified，and also it was confirmed that PGRP-SA protein from M. domestica bound to S. aureus and E. coli.

Musca domestica；innate immunity；peptidoglycan recognition proteins；prokaryotic expression；microorganism binding assay

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.022

2016-03-08

國家自然科學基金項目（81360254），貴州省農(nóng)業(yè)攻關項目（NY［2014］3054）

羅嫚，女，碩士研究生，研究方向：醫(yī)學昆蟲免疫及應用；E-mail：214722912@qq.com

吳建偉，男，博士生導師，研究方向：醫(yī)學昆蟲免疫及應用；E-mail：wjw@gmc.edu.cn