牛血清白蛋白-5-磺基水楊酸體系的熒光共振能量轉(zhuǎn)移研究

張　娟，劉建平，朱彥姝

(寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004)

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牛血清白蛋白-5-磺基水楊酸體系的熒光共振能量轉(zhuǎn)移研究

張娟，劉建平，朱彥姝

(寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004)

采用熒光發(fā)射光譜和紫外吸收光譜研究了牛血清白蛋白(BSA)-5-磺基水楊酸(SSA)體系的熒光共振能量轉(zhuǎn)移。結(jié)果表明，SSA可以猝滅BSA的熒光且使BSA熒光發(fā)射峰藍(lán)移，但峰形未改變；隨SSA濃度的增大，BSA紫外吸收光譜的最大吸收峰紅移且強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)；根據(jù)F?rster非輻射能量轉(zhuǎn)移原理計(jì)算得到BSA-SSA體系中供體(BSA)與受體分子(SSA)間距離為2.42 nm。

牛血清白蛋白(BSA)；5-磺基水楊酸(SSA)；熒光猝滅；能量轉(zhuǎn)移

5-磺基水楊酸(SSA)是水楊酸(salicylicacid,SA)衍生物，屬于芳香族含氧酸，具有內(nèi)源性熒光[1]。與SA及其它衍生物相比，SSA具有較好的水溶性，因而在水體研究[2]、工業(yè)[3]、醫(yī)藥[4]等眾多領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。血清白蛋白是有機(jī)體循環(huán)系統(tǒng)中大量存在的一種可溶性蛋白，其重要生理功能之一是與體內(nèi)外不同配體(血漿中的脂肪酸、藥物、生物活性小分子和金屬離子等[5-6])發(fā)生可逆性鍵合，這種鍵合將影響配體在體內(nèi)的吸收、分配、代謝、排泄等[7-8]。因此，有關(guān)蛋白與配體相互作用的研究十分重要，受到廣泛關(guān)注[9-10]，但有關(guān)牛血清白蛋白(BSA)與SSA相互作用的研究卻少見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，作者研究了BSA-SSA體系的熒光發(fā)射光譜和紫外吸收光譜，并利用F?rster非輻射能量轉(zhuǎn)移原理計(jì)算了BSA與SSA之間距離，擬為相關(guān)研究提供參考。

1　實(shí)驗(yàn)

1.1試劑與儀器

SSA，美國(guó)Fluka公司，以二次蒸餾水配制成原溶液，使用時(shí)適當(dāng)稀釋；BSA(全組分)，美國(guó)Sigma公司，直接溶解于二次蒸餾水中配成原溶液；三羥甲基氨基甲烷(Tris，含量≥99%)，上?；瘜W(xué)試劑公司分裝廠，配制成pH=7.4的Tris-HCl緩沖溶液；NaCl(分析純)，上?；瘜W(xué)試劑公司，以二次蒸餾水配制成濃度為0.5mol·L-1的NaCl溶液。所有原溶液均于0～4 ℃暗處儲(chǔ)存。

F-4600型熒光光譜儀(配置150W氙燈和恒溫水浴槽)、U-3310型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本日立公司。

1.2方法

1.2.1BSA-SSA體系的配制

取一定量的BSA和SSA溶液、2.0mLTris-HCl緩沖溶液、2.0mLNaCl溶液置于10mL比色管中，用二次蒸餾水稀釋至10mL，攪拌均勻，即得BSA-SSA體系。

1.2.2BSA-SSA體系的光譜測(cè)定

熒光發(fā)射光譜于恒溫294 K測(cè)定，激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為2.5 nm，掃描速度 1 200 nm·min-1；紫外吸收光譜于室溫測(cè)定，狹縫寬度2 nm。

2　結(jié)果與討論

2.1BSA-SSA體系的熒光發(fā)射光譜

熒光猝滅是指熒光量子產(chǎn)率降低(即熒光強(qiáng)度減弱)。不同的分子間相互作用均可導(dǎo)致熒光猝滅，包括分子重排、能量轉(zhuǎn)移、基態(tài)復(fù)合物形成、碰撞猝滅等[11]。

固定BSA濃度、改變SSA濃度，研究SSA對(duì)BSA熒光發(fā)射光譜的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

cBSA=8.96×10-6 mol·L-1　a～e，cSSA(×10-6 mol·L-1)：0、0.41、0.83、1.24、1.65

由圖1可知，當(dāng)λex=280 nm時(shí)，BSA在338 nm處有強(qiáng)熒光峰，主要由色氨酸殘基引起；隨SSA濃度的增大，BSA位于338 nm處的熒光峰強(qiáng)度逐漸減弱，401 nm處的熒光峰強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。表明SSA對(duì)BSA的熒光具有猝滅作用。另外，隨SSA濃度的增大，BSA熒光發(fā)射峰發(fā)生藍(lán)移，表明熒光猝滅可能是由BSA與SSA形成復(fù)合物引起的[12]。

2.2BSA-SSA體系的紫外吸收光譜

固定BSA濃度、改變SSA濃度，研究SSA對(duì)BSA紫外吸收光譜的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

cBSA=9.07×10-6 mol·L-1　a～e，cSSA(×10-5 mol·L-1)：0、2.06、4.12、6.18、8.24

由圖2可知，隨SSA濃度的增大，BSA位于278.5 nm處的最大吸收峰發(fā)生紅移，且吸收峰強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。表明BSA與SSA形成了復(fù)合物[13]。

2.3BSA-SSA體系的熒光共振能量轉(zhuǎn)移

熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)可分為輻射能量轉(zhuǎn)移和非輻射能量轉(zhuǎn)移，供體分子熒光發(fā)射光譜發(fā)生畸變時(shí)發(fā)生輻射能量轉(zhuǎn)移。由2.1可知，SSA可有效猝滅BSA的熒光，說(shuō)明BSA-SSA體系存在能量轉(zhuǎn)移。當(dāng)加入SSA時(shí)，BSA熒光發(fā)射光譜并未發(fā)生畸變，可認(rèn)為BSA-SSA體系的熒光共振能量轉(zhuǎn)移屬于非輻射能量轉(zhuǎn)移。根據(jù)F?rster非輻射能量轉(zhuǎn)移原理[14]，發(fā)生能量轉(zhuǎn)移必須滿足以下條件：(1)供體可發(fā)射熒光；(2)供體分子的熒光發(fā)射光譜與受體分子的紫外吸收光譜有足夠的重疊；(3)供體與受體足夠接近，最大距離不超過(guò)7 nm。

非輻射能量轉(zhuǎn)移效率(E)、供體和受體之間距離(r)與臨界能量轉(zhuǎn)移(E=50%)距離(R0)的關(guān)系[14]如下：

(1)

(2)

(3)

式中：F、F0分別為有無(wú)猝滅劑時(shí)供體的熒光強(qiáng)度；K2為偶極空間取向因子，取供體和受體各向隨機(jī)分布的平均值2/3；n為介質(zhì)折射系數(shù)，一般取水和有機(jī)物折射指數(shù)的平均值1.336；φ為供體熒光量子產(chǎn)率，對(duì)于BSA為0.13[15]；J為供體熒光發(fā)射光譜與受體紫外吸收光譜的重疊積分(圖3)；F(λ)為供體在波長(zhǎng)為λ處的熒光強(qiáng)度；ε(λ)為受體在波長(zhǎng)λ處的摩爾吸光系數(shù)。

cBSA=8.96×10-6 mol·L-1　cSSA=5.16×10-5 mol·L-1

根據(jù)式(1)～(3)，可計(jì)算得到以下參數(shù)：J=7.67×10-16cm3·L·mol-1，R0=1.52 nm，E=0.0573，r=2.42 nm。BSA的內(nèi)源性熒光主要由色氨酸殘基引起。BSA分子含有2個(gè)色氨酸殘基，Trp-212殘基位于子域ⅡA，而Trp-134殘基位于子域ⅠB。Trp-134殘基不易與水溶性配體接近，因此SSA僅與Trp-212殘基相互作用，其相互作用距離為2.42 nm。供體和受體之間距離r<7 nm且0.5R0

3　結(jié)論

采用熒光發(fā)射光譜和紫外吸收光譜研究了牛血清白蛋白(BSA)-5-磺基水楊酸(SSA)體系的熒光共振能量轉(zhuǎn)移。結(jié)果表明，SSA可以猝滅BSA的熒光且使BSA熒光發(fā)射峰藍(lán)移，但峰形未改變；隨SSA濃度的增大，BSA紫外吸收光譜的最大吸收峰紅移且強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)；根據(jù)F?rster非輻射能量轉(zhuǎn)移原理計(jì)算得到BSA-SSA體系中供體與受體分子間距離為2.42 nm。

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Fluorescence Resonance Energy Transfer of Bovine Serum Albumin-5-Sulfosalicyclic Acid System

ZHANG Juan,LIU Jian-ping,ZHU Yan-shu

(SchoolofBasicMedicalSciences,NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China)

Fluorescenceresonanceenergytransferofbovineserumalbumin(BSA)-5-sulfosalicyclicacid(SSA)systemwasstudiedbyfluorescenceemissionandUVabsorptionspectra.Resultsshowedthat,thefluorescenceemissionspectrumofBSAwasquenchedbyadditionofSSAsolutionandthefluorescenceemissionpeakofBSAemergedablueshift,butthepeakshapeofBSAfluorescencespectrumwasunchanged.ThemaximumUVabsorptionpeakofBSAemergedaredshiftanditsabsorbanceintensityincreasedobviouslywiththeincreasingofSSAconcentration.AccordingtoF?rstertheoryofnon-radiationenergytransfer,thedistancebetweenthedonor(BSA)andtheacceptor(SSA)inBSA-SSAsystemwascalculatedas2.42nm.

bovineserumalbumin(BSA);5-sulfosalicyclicacid(SSA);fluorescencequenching;energytransfer

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.08.010

寧夏衛(wèi)生計(jì)生委(寧夏衛(wèi)生廳)科研項(xiàng)目(2012051)

2016-03-24

張娟(1976-)，女，寧夏銀川人，副教授，研究方向：電化學(xué)及光化學(xué)，E-mail:zhangjuano13@126.com。

O 657.39

A

1672-5425(2016)08-0042-03

張娟，劉建平，朱彥姝.牛血清白蛋白-5-磺基水楊酸體系的熒光共振能量轉(zhuǎn)移研究[J].化學(xué)與生物工程，2016，33(8)：42-44.