不同活性污泥中菌群多樣性及差異分析

閆來洪，張振沖，郗麗君，梁文龍

(中國石油大學(xué)(華東)化學(xué)工程學(xué)院，山東 青島 266580)

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不同活性污泥中菌群多樣性及差異分析

閆來洪，張振沖，郗麗君，梁文龍

(中國石油大學(xué)(華東)化學(xué)工程學(xué)院，山東 青島 266580)

采用Illumina MiSeq第二代深度高通量測序方法測定了5種不同活性污泥中的菌群多樣性，通過稀釋度曲線、豐度分布曲線、活性污泥中菌群組成分析、微生物群落的聚類樹與條形圖組合分析、主坐標(biāo)分析(PCoA)等對5種不同活性污泥中的菌群差異進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，不同活性污泥中的優(yōu)勢細(xì)菌相似，但某些細(xì)菌的含量存在較大差異，如:正常污泥中浮霉?fàn)罹繋缀跏桥菽械?倍，而正常污泥中放線菌含量不足泡沫中的一半；泡沫中WCHB1-60和Candidate division TM7的含量分別比正常污泥多1.3倍和3.2倍，而泡沫中硝化螺旋菌的含量僅僅是正常污泥中的1/5。表明，活性污泥中的菌群組成與環(huán)境相似度呈正相關(guān)，且細(xì)菌含量與活性污泥的狀態(tài)密切相關(guān)。

活性污泥；高通量測序；菌群多樣性；差異

活性污泥是一個(gè)獨(dú)特的人工微生物生態(tài)系統(tǒng)，具有高的生物多樣性(超過700屬)及生物量濃度(2～10g·L-1)[1-2]。高度多樣化的細(xì)菌群落形成以菌膠團(tuán)為骨架的活性污泥絮體，有效保證了穩(wěn)定、良好的廢水生物處理性能[3-5]。

由于技術(shù)方法的限制，目前多數(shù)研究報(bào)道未能全面比較分析不同狀態(tài)活性污泥中的細(xì)菌群落變化及其是否存在區(qū)域差異[6-7]。而利用高通量測序技術(shù)及先進(jìn)的數(shù)據(jù)分析方法可以較全面地分析活性污泥及泡沫中微生物[8-9]。作者采用IlluminaMiSeq第二代深度高通量測序方法對來自污水處理廠和實(shí)驗(yàn)室人工模擬裝置中不同狀態(tài)的活性污泥的微生物組成進(jìn)行詳細(xì)的測定解析，同時(shí)分析了不同活性污泥的物種差異及其與區(qū)域特異性間的聯(lián)系，擬為維持實(shí)際生產(chǎn)中活性污泥的良好狀態(tài)提供理論指導(dǎo)。

1　實(shí)驗(yàn)

1.1材料

1#、2#、4#、5#活性污泥樣品分別來自青島泥布灣污水處理廠(1#、2#、4#樣品)和鐮灣河水質(zhì)凈化廠(5#樣品)，3#活性污泥樣品來自實(shí)驗(yàn)室人工模擬裝置。樣品經(jīng)處理后移至-70 ℃低溫冰箱中長期保存。

泥布灣污水處理廠采用倒置A2/O工藝，主要處理生活污水；鐮灣河水質(zhì)凈化廠采用百樂克工藝，主要處理生活用水。兩污水處理廠污水經(jīng)處理后均可達(dá)到《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定的一級B類排放標(biāo)準(zhǔn)。

實(shí)驗(yàn)室人工模擬裝置采用最基本的活性污泥法，由均質(zhì)池、曝氣池、二沉池及回流裝置組成。曝氣池與二沉池采用相同的圓柱形有機(jī)玻璃管(直徑10cm、高40cm、容積3.14L)。實(shí)驗(yàn)室人工模擬裝置進(jìn)水為人工配水，其配方為：葡萄糖220mg·L-1、蛋白胨200mg·L-1、氯化銨58mg·L-1、磷酸氫二鉀19mg·L-1、氯化鈣4mg·L-1、硫酸鎂2mg·L-1。

1.2儀器

超凈工作臺(tái)，全自動(dòng)滅菌鍋，超純水儀，哈希水質(zhì)檢測儀，蠕動(dòng)泵驅(qū)動(dòng)器，高速離心機(jī)，擴(kuò)增儀，水平電泳槽，凝膠成像系統(tǒng)，低溫冰箱，漩渦混合器，島津紫外分光光度計(jì)，ABIGeneAmp?9700型PCR儀。

1.3方法

1.3.1樣品采集

從泥布灣污水處理廠采集曝氣池中的正?；钚晕勰?1#)、上浮的污泥泡沫(2#)及二沉池中的回流上浮污泥(4#)；從實(shí)驗(yàn)室人工模擬裝置中采集好氧池中的正?；钚晕勰?3#)；從鐮灣河水質(zhì)凈化廠采集正常的活性污泥(5#)。每種類型的污泥樣品分別在3個(gè)不同的采樣點(diǎn)同時(shí)采集，混合后進(jìn)行總DNA的提取。

1.3.2總DNA的提取

將混合污泥樣品放入50 mL離心管中于6 000 r·min-1高速離心10 min，去上層清液，用基因組提取試劑盒(E.Z.N.A.TM Soil DNA Kit，Omega公司)提取總DNA后取5 μL用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。剩余污泥于-70 ℃冷凍備用。每種樣品做3個(gè)平行，電泳檢測后混合。

1.3.3PCR擴(kuò)增

按指定測序區(qū)域，合成帶有barcode的特異引物。5種污泥樣品均在正式實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行，每種樣品做3個(gè)重復(fù)，將同一樣品的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl緩沖液洗脫，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.4熒光定量

根據(jù)電泳初步定量結(jié)果，用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)檢測PCR產(chǎn)物，再按照每種樣品的測序量要求進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。

1.3.5MiSeq測序

MiSeq文庫構(gòu)建：(1)連接“Y”字形接頭；(2)使用磁珠篩選去除接頭自連片段；(3)利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫模板的富集；(4)氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。

MiSeq測序：(1)DNA片段的一端與引物堿基互補(bǔ)，固定在芯片上；另一端隨機(jī)與附近的另外一個(gè)引物互補(bǔ)，也被固定住，形成“橋”；(2)PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生DNA簇；(3)DNA擴(kuò)增子線性化成為單鏈；(4)加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP，每次循環(huán)只合成一個(gè)堿基；(5)用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)聚合上的核苷酸種類；(6)將“熒光基團(tuán)”和“終止基團(tuán)”化學(xué)切割，恢復(fù)3′端粘性，繼續(xù)聚合第二個(gè)核苷酸；(7)統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號結(jié)果，獲得模板DNA片段的序列。

1.3.6生物信息分析

MiSeq測序得到的PE reads首先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，同時(shí)對序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾，區(qū)分樣本后進(jìn)行OTU聚類分析和物種分類學(xué)分析?；贠TU聚類分析結(jié)果，對OTU進(jìn)行多樣性指數(shù)分析及測序深度的檢測；基于分類學(xué)分析結(jié)果，在各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果與討論

2.1MiSeq測序結(jié)果

5種樣品的高通量測序結(jié)果如表1所示，5種樣品所含操作分類單元及所含序列數(shù)目見圖1。

由圖1可知，1#樣品中含細(xì)菌種類969個(gè)，2#樣品中含1 027個(gè)，3#樣品中含435個(gè)，4#樣品中含1 066個(gè)，5#樣品中含829個(gè)；1#、2#、4#樣品來自同一污水處理廠，有相同種類833個(gè)；1#、5#樣品是同一性質(zhì)的污泥，有相同種類635個(gè)；1#、2#、4#、5#樣品全部來自實(shí)際運(yùn)行工藝中，共有相同種類566個(gè)；1#、2#、3#、4#、5#樣品共有相同種類248個(gè)。1#～5#樣品特有的微生物種類分別是5個(gè)、1個(gè)、46個(gè)、20個(gè)、85個(gè)。

表15種樣品的高通量測序結(jié)果

Tab.1High throughput sequencing results of five samples

樣品序列數(shù)堿基數(shù)/bp平均長度/bp1#4737018741233395.642#4733918733986395.743#4114216260732395.234#4892119349945395.535#4294416987670395.58

圖1　操作分類單元維恩圖[10]

2.2物種豐度及群落結(jié)構(gòu)分析

2.2.1稀釋度曲線(圖2)

圖2　5種樣品的稀釋度曲線

稀釋度曲線[11]是從樣品中隨機(jī)抽取一定數(shù)量的個(gè)體，用來說明測序數(shù)量是否合理，也可比較測序數(shù)量不同的樣品的物種豐度，反映每種樣品物種豐度與取樣深度的關(guān)系。

從圖2可以看出，1#、2#、4#樣品具有非常相似的變化趨勢與幅度，5#樣品與1#、2#、4#樣品差異較大，但相比2#、4#樣品，5#樣品與1#樣品更接近，3#樣品與其它樣品差異最大。說明同一污水處理廠不同樣品(1#、2#、4#)的物種豐度最接近，不同污水處理廠相同狀態(tài)(1#、5#樣品皆為正常污泥)樣品次之，實(shí)驗(yàn)室人工模擬裝置中樣品(3#)的物種豐度與實(shí)際污水處理廠中樣品的物種豐度差異最大。

2.2.2豐度分布曲線

豐度分布曲線[12]是分析菌群多樣性的一種方法，既可用來解釋物種豐度也可解釋物種均勻度。5種樣品的OTU等級豐度分布曲線如圖3所示。

圖3　5種樣品的OTU等級豐度分布曲線

從圖3可以看出，1#、2#、4#、5#樣品的斜率較小且非常接近，又以1#、2#樣品斜率最接近，3#樣品斜率最大。說明1#、2#樣品因取自同一位置所以均勻度最相似且最好，1#、2#、4#、5#樣品因取自實(shí)際污水處理廠不同位置所以均勻度較相似，3#樣品因取自實(shí)驗(yàn)室人工模擬裝置所以均勻度最差。此外，豐度分布曲線在橫軸上的寬度再次印證了5種樣品的相對豐度及其相互關(guān)系。

2.2.3活性污泥中菌群組成分析

圖4反映了5種活性污泥樣品在屬的層次上包含的微生物種類及各物種的相對含量。

從圖4可知，5種活性污泥樣品所含微生物屬的種類基本一致，但其相對含量差異較大。對所含主要微生物屬進(jìn)行分析和歸類發(fā)現(xiàn)，1#、2#、4#、5#樣品主要物種為叢毛單胞菌、腐敗螺旋菌和光合細(xì)菌；3#樣品與其它樣品明顯不同，含有大量的叢毛單胞菌和嗜酸菌，而光合細(xì)菌的含量卻非常少；相比于其它樣品，2#樣品中存在大量的未培養(yǎng)的Candidate division TM7、下水道桿菌、水單胞菌、鹽單胞菌、分枝桿菌、斯科曼氏菌。

表2是正常污泥與泡沫中微生物主要組成。

從表2可知，2種樣品中的微生物組成差異主要表現(xiàn)在：對于高豐度微生物而言，正常污泥中浮霉?fàn)罹?Planctomycetes)的含量幾乎是泡沫中的2倍，而正常污泥中放線菌(Actinobacteria)的含量不足泡沫中的一半；對于低豐度微生物而言，泡沫中WCHB1-60、Candidate division TM7的含量高達(dá)3.72%、2.31%，分別比正常污泥多1.3倍、3.2倍，而泡沫中硝化螺旋菌(Nitrospirae)的含量只有0.26%，僅為正常污泥樣品中的1/5，該菌是亞硝酸鹽氧化菌中的一個(gè)主要譜系，在廢水生物處理中具有重要作用。

圖45種樣品的微生物菌群分布圖

Fig.4Microbial community distribution barplot of five samples

表2正常污泥與泡沫中微生物主要組成

Tab.2　Main components of microbacteria in normal sludge and foaming sludge

據(jù)報(bào)道，放線菌中的某些種屬與泡沫的形成密切相關(guān)，如本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：(1)分枝桿菌，能在體內(nèi)合成大量的分枝菌酸，因而細(xì)胞壁中含有大量的分枝菌酸，細(xì)胞壁中所含的長鏈枝狀的分枝菌酸導(dǎo)致細(xì)胞表面的疏水性(CSH)，而CSH 正是泡沫形成的選擇性浮選的必要條件[13]，因而分枝桿菌是泡沫形成的重要原因之一。(2)斯科曼氏菌，原屬于諾卡氏菌，可產(chǎn)生與分枝桿菌不同的分枝菌酸，是造成泡沫的另一主要微生物[14]。(3)戈登氏菌，在泡沫中含量為0.24%，1#樣品中含量為0.021%，5#樣品中含量為0.024%，可以推斷戈登氏菌在泡沫中大量增殖，表明戈登氏菌是重要的發(fā)泡微生物，與泡沫的形成有重要關(guān)系[15]。

2.2.4微生物群落聚類樹與條形圖組合分析

5種樣品的微生物群落聚類樹與條形圖如圖5所示。

圖5中左邊是5種樣品基于群落組成的層次聚類分析[16](bray-curtis算法)，右邊是5種樣品的微生物群落條形圖[17]。通過聚類樹可以看出，不同地區(qū)不同工藝的樣品微生物差異最大，同一地區(qū)不同狀態(tài)的樣品微生物差異次之，同一狀態(tài)不同類型的樣品微生物差異最小。通過5種樣品的條形圖可以看出每種菌屬的相對含量。聚類樹與條形圖組合分析定量而直觀地反映了5種樣品的相似性及菌屬含量差異性。

圖5　5種樣品的微生物群落的聚類樹與條形圖

2.2.5主坐標(biāo)分析

主坐標(biāo)分析(principal coordinate analysis，PCoA)，可用來研究群落組成的相似性或差異性，與PCA[18]類似。通過降維找出影響5種樣品群落組成差異的潛在主成分，樣品間距離通過各樣品序列間的進(jìn)化信息計(jì)算得出，從而可以確定5種不同活性污泥樣品間的多樣性差異，如圖6所示。

圖6　5種樣品的主坐標(biāo)分析

從圖6可知，1#、2#、4#樣品聚在了一起，而3#、5#樣品與它們相距較遠(yuǎn)。表明5種活性污泥樣品群落處于同一地點(diǎn)相同處理工藝中的差異很小，處于不同地點(diǎn)不同處理工藝中的差異很大，因此區(qū)域特征及處理工藝對活性污泥中微生物群落有著重要影響。

2.3討論

據(jù)報(bào)道，環(huán)境條件(主要是污泥停留時(shí)間和無機(jī)氮等)對微生物的影響主要體現(xiàn)在相對含量上，而微生物間的相互作用則對微生物的群落組成與結(jié)構(gòu)起主導(dǎo)作用[19]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在屬的水平上一些稀有微生物只存在于某一個(gè)水廠或?qū)嶒?yàn)室人工模擬裝置中，如泥布灣污水處理廠中特有微生物有(括號中為正常污泥中微生物含量)AKYG587(0.063%)、Actinobacteria unclassified(0.17%)、Armatimonadales unclassified(0.17%)、CL500-3(0.063%)等；鐮灣河水質(zhì)凈化廠中特有微生物有Alcaligenaceae uncultured(0.11%)、Burkholderiales unclassified(0.096%)、Byssovorax(0.016%)等；實(shí)驗(yàn)室人工模擬裝置中特有微生物有Achromobacter(0.093%)、Aquitalea(0.054%)等。說明除環(huán)境條件影響微生物相對含量外，不同地方活性污泥中微生物組成并不相同，即不同狀態(tài)的活性污泥中微生物群落具有區(qū)域性分布特點(diǎn)。

3　結(jié)論

采用Illumina MiSeq測序方法，從5種活性污泥樣品中共分離了細(xì)菌門36個(gè)、綱78個(gè)、目140個(gè)、科248個(gè)。

泥布灣污水處理廠正?；钚晕勰鄻悠分兄饕?個(gè)類群(含量>5%)，其中變形菌門與擬桿菌門所占比例最大，分別為33.9%、16.01%；其次是綠菌、綠彎菌、浮霉?fàn)罹?，分別為12.88%、8.97%和9.28%。好氧池上浮的污泥泡沫中主要包含6個(gè)類群(含量>5%)，其中變形菌門與擬桿菌門所占比例最大，分別為32.44%和20.64%；其次是放線菌、綠菌、綠彎菌、浮霉?fàn)罹?，分別為10.44%、8.5%、6.19%、5.05%；其中放線菌中的分枝桿菌、斯科曼氏菌和戈登氏菌含量均高于正常污泥，它們?yōu)橹饕呐菽a(chǎn)生菌。二沉池中的回流上浮污泥中主要包含5個(gè)類群(含量>5%)，其中變形菌門與擬桿菌門所占比例最大，分別為38.13%、20.67%；其次是綠菌、綠彎菌、浮霉?fàn)罹?，分別為10.6%、7.52%、6.15%。

實(shí)驗(yàn)室人工模擬裝置污泥樣品中主要包含2個(gè)類群(含量>5%)，其中變形菌門與擬桿菌門所占比例最大，分別為70.36%、17.15%。

鐮灣河水質(zhì)凈化廠正常污泥中主要包含5個(gè)類群(含量>5%)，其中變形菌門與擬桿菌門所占比例最大，分別為33.69%、18.54%；其次是綠菌、綠彎菌、酸桿菌，分別為12.66%、12.23%、5.54%。

稀釋度曲線、豐度分布曲線、活性污泥中菌群組成分析、微生物群落的聚類樹與條形圖組合分析、主坐標(biāo)分析結(jié)果表明，同一水廠同一位置不同狀態(tài)污泥樣品中的微生物群落結(jié)構(gòu)最相似，同一水廠不同位置次之，不同水廠樣品差異最大。因此，微生物群落組成與環(huán)境相似度呈正相關(guān)且微生物種群相對含量變化與活性污泥的狀態(tài)密切相關(guān)。人工模擬裝置樣品與其它樣品對比結(jié)果表明，小型模擬裝置難以模擬實(shí)際污水的處理過程。

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Bacteria Community Diversity and Differences in Different Types of Activated Sludge

YAN Lai-hong,ZHANG Zhen-chong,XI Li-jun,LIANG Wen-long

(CollegeofChemicalEngineering,ChinaUniversityofPetroleum,Qingdao266580,China)

Thebacteriacommunitydiversityoffivetypesofactivatedsludgewasdetectedbyusingasecondgenerationhighthroughputdeepsequencingtechnology(IlluminaMiSeq).Throughtherarefactioncurves,theabundancedistributioncurves,analysisofbacteriacommunitycomponents,clusteringtreecombinedbarplotanalysisofbacteriacommunityandprincipalcoordinateanalysis(PCoA),thedifferencesinfivetypesofactivatedsludgewereanalyzed.Resultsindicatedthat,dominantbacteriaindifferentactivatedsludgeweresimilartoeachother,butthecontentofsomebacteriahadsignificantdifference.Forexample,thecontentofPlanctomycetesinnormalsludgewasalmostdoubleofthatinfoam,whilethecontentofActinomycetesinnormalsludgewaslessthanhalfofthatinfoam;thecontentofWCHB1-60andCandidatedivisionTM7infoamwas1.3times,3.2timesmorethanthatinnormalsludge,respectively,whilethecontentofNitrospiraeinfoamwasone-fifthofthatinnormalsludge.Bacteriacommunitycompositionwaspositivelycorrelatedwithenvironmentalsimilarity,andthecontentsofbacteriawerecloselyrelatedtothestateoftheactivatedsludge.

activatedsludge;highthroughputsequencing;bacteriacommunitydiversity;difference

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.08.014

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31400005)，山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(ZR2013CL028)，中央高校專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(R1304006A)

2016-04-07

閆來洪(1952-)，男，山東東營人，副教授，主要從事水污染治理及環(huán)境影響評價(jià)，E-mail：yanlh918@126.com。

X 172

A

1672-5425(2016)08-0057-06

閆來洪，張振沖，郗麗君，等.不同活性污泥中菌群多樣性及差異分析[J].化學(xué)與生物工程，2016，33(8)：57-62.