ICU老年患者感染產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌的整合子耐藥基因研究*

劉　唯,陳　鍵

(湖南省馬王堆醫(yī)院檢驗科，長沙 410016)

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ICU老年患者感染產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌的整合子耐藥基因研究*

劉唯,陳鍵△

(湖南省馬王堆醫(yī)院檢驗科，長沙 410016)

目的了解重癥監(jiān)護病房(ICU) 老年患者感染產(chǎn)超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)肺炎克雷伯菌整合子基因的分布及耐藥率，為臨床合理使用抗菌藥物提供依據(jù)。方法采用法國生物梅里埃公司生產(chǎn)的VITEK-2微生物自動鑒定系統(tǒng),對2013年1月至2015年12月老年ICU患者的各類臨床標本進行細菌鑒定和藥敏試驗,產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌167株用PCR 分析整合子基因,并通過測序明確基因。結果肺炎克雷伯菌386株中產(chǎn)ESBLs檢出率為43.26%；整合子檢出陽性率50.89%,檢出全為Ⅰ類整合子；整合子可變區(qū)擴增出aadA2、aadA1、aada16、dfra27和arr-3基因；產(chǎn)ESBLs 整合子基因陽性株耐藥率明顯高于整合子基因陰性菌株。結論老年ICU患者感染產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌和整合子基因密切相關，在細菌的耐藥上整合子起著重要作用。

肺炎克雷伯桿菌；重癥監(jiān)護病房；產(chǎn)超廣譜β-內酰胺酶； 整合子

重癥監(jiān)護病房(ICU)老年患者由于病情危重、免疫力低，進行氣管插管、氣管切開、留置導尿管、呼吸機使用等各種侵入性操作比例高、機體保護屏障破壞容易感染肺炎克雷伯菌[1],加之ICU患者廣譜抗菌藥物使用較多,整合子作為在重組功能上的移動元件,產(chǎn)超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)肺炎克雷伯菌通過質粒在體內傳播而產(chǎn)生耐藥性的改變，使產(chǎn)ESBLs菌獲得多重耐藥性[2],導致醫(yī)院感染和其耐藥率同時上升,成為了臨床上治療感染的難題[3]。筆者從本院2013～2015年ICU老年患者中,比較整合子基因在產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌中的分布及表型存在的情況,找出在產(chǎn)ESBLs菌耐藥性整合子菌株在細菌耐藥發(fā)揮的特點,指導臨床對感染的老年ICU患者合理使用抗菌藥物。

1　資料與方法

1.1一般資料收集2013年1月至2015年12月本院ICU病房患者(年齡>65歲)臨床標本，分別為痰( 包括纖支鏡吸痰、吸痰、自咳痰等)、肺泡灌洗液、血液、尿液等標本分離所得肺炎克雷伯菌(剔除重復檢出的菌株)，同一患者的相同菌株收集標本時間在1 周內視為同一菌株，不做重復統(tǒng)計，共386株。呼吸道標本經(jīng)涂片后選取合格標本進行培養(yǎng)采用法國生物梅里埃公司生產(chǎn)的VITEK-2細菌鑒定系統(tǒng)對病原菌進行鑒定及藥敏試驗。質控菌株：肺炎克雷伯菌ATCC700603,大腸埃希菌ATCC25922。

1.2儀器與試劑M-H瓊脂和慶大霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、氨曲南、頭孢西丁、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢他啶、哌拉西林、妥布霉素、哌拉西林/他唑巴坦、美洛培南14種藥敏紙片由英國Oxoid公司生產(chǎn)的。試劑為大連寶生物工程有限公司提供的PCR擴增試劑盒。美國實時熒光定量Stepone基因擴增儀；DNA Thermal cycler,PE公司；美國海倫娜電泳儀。

1.3方法

1.3.1菌株鑒定及藥敏試驗所有樣品均接種血瓊脂和中國藍雙色平板。細菌培養(yǎng)采用法國生物梅里埃公司生產(chǎn)的API鑒定系統(tǒng)對菌株進行鑒定。用Kiady-Bauer紙片擴散法,按美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(CLSI)2012年版本的標準判讀藥敏結果[4]。對產(chǎn)ESBLs菌株采用CLSI推薦的方法做初篩和確證檢測試驗。

1.3.2產(chǎn)ESBLs的整合子基因的PCR擴增及測序肺炎克雷伯菌用煮沸法提取整合子DNA，使用在PCR反應體系，擴增整合子基因，相關引物見表1。上海生工生物技術有限公司提供這些引物，擴增后產(chǎn)物送上海生工生物技術有限公司進行雙向測序。對測序結果在DNA star 軟件進行序列校正、結果拼接，通過在GenBank 數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，分析整合子可變區(qū)的基因序列的結果。

表1　　用于鑒定整合子類型設計的引物序列(5′-3′)

1.4統(tǒng)計學處理所有菌株的藥敏結果均采用Whonet 5.6軟件和SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結　　果

2.1菌株來源分布檢測出產(chǎn)ESBLs為 167 株(檢出率為43.26%)。肺炎克雷伯菌386株的標本來源中痰標本占51.5%,從肺泡灌洗液中檢出產(chǎn)ESBL肺炎克雷伯菌為最高(55.43%)，見表2。

表2　　ICU老年患者檢出肺炎克雷伯菌的標本來源分布

2.2整合子基因的檢測結果在設計引物下擴增167株肺炎克雷伯菌的DNA，有85株整合子陽性菌被檢出，陽性率為50.89%,在檢出整合子中全都是Ⅰ類,并未檢出含有整合子Ⅱ類或者整合子Ⅲ類。見圖1。

注:1～7為檢測株；陽性對照為肺炎克雷伯菌ATCC700603；陰性對照為大腸埃希菌ATCC25922。

2.3整合子陽性菌株可變區(qū)擴增的產(chǎn)物測序結果由整合子肺炎克雷伯菌擴增產(chǎn)物測序結果表明，Ⅰ類整合子擴增的可變區(qū)大小約為285 bp。與BLAST比對分析，Ⅰ類整合子可變區(qū)編碼aadA2、aadA1、aada16耐藥基因(介導氨基糖苷類抗菌藥耐藥)，二氫葉酸還原酶(dfra27)基因(對磺胺類抗菌藥的耐藥),以及對利福平耐藥的ADP-核糖基轉移酶1類整合子(arr-3)。

2.4整合子陽性和整合子陰性肺炎克雷伯菌對抗菌藥物耐藥率比較整合子陽性肺炎克雷伯菌對除阿米卡星以外的其他13種抗菌藥物的耐藥率明顯高于整合子陰性肺炎克雷伯菌(P<0.05)；但在整合子陽性肺炎克雷伯菌耐藥率統(tǒng)計中,有阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、美洛培南耐藥率小于3%。見表3。

表3　　整合子陽性和整合子陰性肺炎克雷伯菌對抗菌藥物耐藥率比較

注：與整合子陰性肺炎克雷伯菌耐藥率比較，*P<0.05。

3　討　論

肺炎克雷伯菌在老年ICU患者感染的病原菌中排在第2位，且由于其質粒作用產(chǎn)生ESBLs,利用產(chǎn)物在細菌不同種之間進行傳播擴散,加重老年ICU患者感染細菌的耐藥性[5]。

對本院老年ICU患者感染肺炎克雷伯菌標本來源分布的情況進行分析，分離肺炎克雷伯菌最多的分別是痰、肺泡灌洗液和尿液,表明肺炎克雷伯菌通過老年人呼吸道和泌尿道更容易感染,這與文獻[6]報道相似。其原因是肺炎克雷伯菌作為上呼吸道的定植菌，在各種因素如氣管插管破壞口咽部正常定植的菌群后侵入造成逆向移行和易位感染，在患者未出現(xiàn)明顯的感染征象時，做好肺炎克雷伯菌感染監(jiān)測的同時加強醫(yī)務人員手衛(wèi)生依從性的教育，才能減少醫(yī)院交叉感染的產(chǎn)生。

由于老年ICU患者因病情重,大劑量、長時間使用廣譜及超廣譜抗菌藥物，引起宿主體內菌群的生態(tài)平衡失調,使得體內該菌產(chǎn)ESBLs不斷增加。本院老年ICU患者感染肺炎克雷伯菌中有43.26%產(chǎn)ESBLs,尤其從肺泡灌洗液中分離出產(chǎn)ESBLs最高為55.31%,與有關報道不同[7],這樣對于感染的控制和有效治療造成較大困難,只有及時開展病原學檢查,參照藥敏結果選用抗菌藥物,才能減少醫(yī)院感染的產(chǎn)生。

在不斷深入的細菌耐藥研究中，越來越多重視整合子介導的耐藥性,整合子有特異性的識別位點捕獲游離的耐藥基盒,在自身染色體或者質粒上同一方向整合[8],整合子再通過轉座子或接合性質粒介導耐藥基因水平傳播和轉移而導致耐藥。肺炎克雷伯菌存在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合子,本研究中85株肺炎克雷伯菌整合子陽性菌來自于167株產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌,檢出結果均為Ⅰ類整合子,并未發(fā)現(xiàn)Ⅱ﹑Ⅲ類整合子,這結果與文獻[9]報道的肺炎克雷伯菌中Ⅰ類整合子的多重耐藥基因的結果基本一致。說明老年ICU患者感染產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌中有Ⅰ類整合子,這樣容易形成多重耐藥菌株,導致老年ICU患者感染的整合子陽性菌對13種藥物耐藥率與整合子陰性菌的耐藥率相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。通過本研究整合子陽性菌株可變區(qū)擴增的產(chǎn)物測序結果與BLAST比對發(fā)現(xiàn)，Ⅰ類整合子可變區(qū)編碼aadA2、aadA1、 aada16、 dfra27和arr-3耐藥基因,說明這些整合子陽性的菌株不僅對三代頭孢在內的β-內酰胺類抗菌藥物出現(xiàn)耐藥，對氨基糖苷類和喹諾酮類抗菌藥物也會出現(xiàn)耐藥，其原因是在播散過程中整合子的產(chǎn)ESBLs菌株存在有β-內酰胺類抗菌藥物所起到的篩選效應[10],其他耐藥基因黏附在其整合子上形成接合性質粒在篩選ESBLs基因中發(fā)生作用，促進某些ESBLs編碼基因位于整合子內部，形成高耐藥基因,促進ESBLs的傳播。

綜上所述，應加強對產(chǎn)ESBLs的細菌整合子基因檢測和耐碳青霉烯類抗菌藥物細菌的專項監(jiān)測，微生物室及時把監(jiān)測結果反饋至臨床，這樣有利于臨床加強醫(yī)務人員的手衛(wèi)生管理,做好環(huán)境衛(wèi)生及物品消毒，采取消毒隔離措施,避免耐藥菌的交叉?zhèn)鞑?延緩細菌耐藥性的出現(xiàn)。

[1]王惠姣，徐嬌君，陳小平，等．ICU患者感染多藥耐藥肺炎克雷伯菌的耐藥性分析[J]．中華醫(yī)院感染學雜志，2016，26(6)：1235-1237．

[2]王元元，張昭勇，呂軍．下呼吸道感染肺炎克雷伯菌耐藥性及產(chǎn)ESBLs株危險因素分析[J]．湖北醫(yī)藥學院學報，2014，33(3)：248-252．

[3]郝家硯，程邦寧．產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌的整合子介導耐藥的研究[J]．國外醫(yī)藥抗生素分冊，2014，35(1)：16-18．

[4]Clinical and Laboratory Standards Institute．Performance standards for antimicrobial susceptibility testing:twenty-second informational supplement：M100-S22[S]．Wayne，PA，USA：CLSI,2012.

[5]盧賽飛，張建禮．415株肺炎克雷伯菌的臨床分布及耐藥性分析[J]．國際檢驗醫(yī)學雜志，2014，35(22)：3076-3077．

[6]張愛勤，孫紅艷．住院患者肺炎克雷伯菌感染及其耐藥性監(jiān)測[J]．中國消毒學雜志，2014，31(6)：642-643．

[7]胡志軍，潘曉龍，周東升，等．肺炎克雷伯菌感染的臨床分布及耐藥性監(jiān)測[J]．中華醫(yī)院感染學雜志，2014，24(12)：2865-2867．

[8]Cambray G,Guerout AM,Mazel D.Integrons[J].Annu Rev Genet，2010,44:141-166.

[9]Roy Chowdhury P,Ingold A,Vanegas N,et al.Dissemination of multiple drug resistance genes by class 1 integrons in Klebsiella pneumoniae isolates from four countries:a comparative study[J].Antimicrob Agents Chemother,2011,55(7):3140-3149.

[10]王玉紅，鄧敏，閔曉春．產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌臨床分布特征及耐藥性分析[J]．中華醫(yī)院感染學雜志，2014，24(21)：5213-5214．

Study on integron drug resistance gene of ESBLs-prodcing Klebsiella pneumonia infection in ICU elderly patients*

LIUWei，CHENJian△

(DepartmentofClinicalLaboratory,HunanProvincialMawanduiHospital,Changsha,Hunan410016China)

ObjectiveTo understand the gene distribution and drug resistance rate of integron gene of extended spectrum β- lactamases(ESBLs) producing Klebsiella pneumonia infection in ICU elderly patients in order to provide the basis for rational use of antimicrobial agents.MethodsThe BioMerieux VITEK-2 Automated Microbes Identification System was adopted to conduct the bacteria identification and drug susceptibility test on various clinical specimens of ICU elderly patients in our hospital from January 2013 to December 2015.The integron gene in 167 strains of ESBLs-producing Klebsiella pneumoniae was analyzed by PCR,and the gene was identified by sequencing.ResultsAmong 386 strains of Klebsiella pneumoniae,the detection rate of ESBLs-producing strains was 43.26%;the positive rate of integron was 50.89%,the detected integron was class Ⅰ integron;aadA2,aadA1,aada16,dfra27 and arr-3 genes were amplified from integron variable region;the drug resistance rate of ESBLs-producing integron gene positive strains was significantly higher than that of integron gene negative strains.Conclusionthe ICU elderly patients with ESBLs-producing Klebsiella pneumoniae infection is closely related to the integron gene and integron plays an important role in bacterial drug resistance.

Klebsiella pneumoniae;ICU;ESBLs producing;integron

湖南省科技計劃項目(2013FJ3115)。

劉唯，女，主管技師，主要從事微生物檢驗及細菌耐藥性研究。△

，E-mail：chenjian9240@126.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.16.004

A

1673-4130(2016)16-2214-03

2016-04-03

2016-06-07)