番茄細菌性葉斑病菌RPA檢測技術

魏梅生,　田　茜,　趙文軍,　李桂芬,　孔　君

(中國檢驗檢疫科學研究院植物檢疫研究所,北京　100029)

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番茄細菌性葉斑病菌RPA檢測技術

魏梅生,田茜,趙文軍*,李桂芬,孔君

(中國檢驗檢疫科學研究院植物檢疫研究所,北京100029)

番茄細菌性葉斑病菌(Pseudomonas syringaepv. tomato,Pst)是我國進境植物檢疫性有害生物,可隨種子進行遠距離傳播。快速簡便的檢測對于防止該病害的擴散傳播具有重要意義。依據番茄細菌性葉斑病菌的hrpZPst基因序列,設計并篩選出特異性擴增引物,建立了番茄細菌性葉斑病菌的重組酶聚合酶等溫擴增(RPA)檢測方法。該方法可從10種不同的植物病原細菌中特異性地檢測到3個參試番茄細菌性葉斑病菌株。對病菌DNA的檢測靈敏度為75fg/μL,與PCR凝膠電泳相當。該方法擴增核酸時間短、效率高、對設備的要求低,適合于基層簡易實驗室的快速檢測。本文為該病原菌的檢測提供了新方法。

番茄細菌性葉斑病菌;重組酶聚合酶擴增;RPA;等溫擴增;檢測

番茄細菌性葉斑病菌(Pseudomonassyringaepv.tomato, Pst)是我國進境植物檢疫性有害生物,主要危害番茄的葉、莖、花、葉柄和果實。病菌在種子、病殘體、土壤和雜草上越冬,可隨種子進行遠距離傳播。自1933 年在美國首次報道以來,該病在美國、英國、俄羅斯、加拿大、法國、南非、澳大利亞等26個國家和中國的吉林、遼寧、黑龍江、河北、天津、甘肅、新疆、福建、廣西、臺灣等地有發(fā)生報道[1-7],且有逐年上升的趨勢,對我國的番茄生產構成嚴重的威脅。

經典的細菌鑒定方法，如利用菌體形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀、生理生化反應等對植物細菌病害進行診斷，經驗性強,而且費時費力。以分子生物學為基礎的PCR、實時熒光PCR和免疫PCR 等技術已廣泛用于植物病原細菌的檢測[8],但該類技術對儀器設備和人員要求比較高,適合于實驗室的檢測,對于設備不足的基層實驗室,難以應用。20世紀90年代初出現了等溫核酸體外擴增(isothermal amplification)技術的報道[9]。等溫核酸體外擴增技術是在恒定溫度下,通過一些特殊的蛋白(酶)使DNA 雙鏈解螺旋,并促使特異性DNA 片段擴增,以達到核酸體外擴增的效果。因等溫核酸體外擴增不需要高溫變性、退火和延伸的環(huán)節(jié),核酸擴增變得更加便捷,也擺脫了對核酸擴增儀的依賴。

等溫核酸體外擴增技術有多種形式,包括鏈置換擴增(strand displacement amplification, SDA) 、轉錄介導擴增(transcription-mediated amplification, TMA)、環(huán)介導擴增(loop-mediated amplification, LAMP)、滾環(huán)擴增(rolling-circle amplification, RCA)和依賴解旋酶擴增(helicase-dependent amplification, HDA)等[10-11]。目前最接近常溫的核酸擴增技術是重組酶聚合酶擴增(recombinase polymerase amplification, RPA),RPA技術是一種在常溫下可以使核酸快速擴增的方法。在25～42℃范圍內的等溫條件下,重組酶可與引物DNA緊密結合, 形成酶和引物的聚合體,當引物在模板DNA 上搜索到與之完全互補的序列時,在單鏈DNA結合蛋白(single-stranded DNA binding protein, SSB)的作用下,使模板DNA 解鏈,并在DNA 聚合酶的作用下,形成新的DNA 互補鏈。與普通PCR的產物一樣,RPA擴增出來的是單一的產物[12]。

英國TwistDx公司較早開展RPA擴增技術研究,美國植物病害診斷試劑公司Agdia公司采用TwistDx的RPA技術,建立了AmplifyRPTMDNA 擴增平臺,用于柑橘黃龍病(CandidatusLiberibacter asiaticus)的檢測。但目前國內尚未見到RPA技術在植物細菌病害檢測和應用研究方面的相關報道。本研究建立了番茄細菌性葉斑病菌RPA檢測方法,以期為基層簡易實驗室提供一種方便適用的快速檢測方法。

1　材料與方法

1.1供試菌株

供試菌株來自于美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)、英國國家植物病原細菌保藏中心(National Collection of Plant Pathogenic Bacteria,NCPPB)和中國檢驗檢疫科學研究院植物檢疫研究所。

這些細菌分別是番茄細菌性葉斑病菌(Pseudomonassyringaepv.tomato)菌株ATCC BAA-871、 NCPPB 1106、 LX-11(本所收藏);十字花科黑斑病菌(Pseudomonassyringaepv.maculicola)菌株ATCC 51322;獼猴桃潰瘍病菌(Pseudomonassyringaepv.actinidiae)菌株NCPPB 3738;黃瓜細菌性角斑病菌(Pseudomonassyringaepv.lachrymans)菌株NCPPB 540;核果樹潰瘍病菌(Pseudomonassyringaepv.morsprunorum)菌株ATCC 13395;桃樹潰瘍病菌(Pseudomonassyringaepv.persicae)菌株NCPPB 2254;番茄細菌性髓部壞死病菌(Pseudomonascorrugata)菌株ATCC 29736;菜豆暈疫病菌(Pseudomonassavastanoipv.phaseolicola)菌株LMG 5473(本所收藏);辣椒斑點病菌(Xanthomonasaxonopodispv.vesicatoria)菌株NCPPB 701;番茄潰瘍病菌(Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis)菌株ATCC 7429。

1.2主要試劑和設備

細菌基因組DNA提取試劑盒(溶液型)、PCR產物回收試劑盒(離心柱型)(北京百泰克生物技術有限公司);TwistAmp Basic 試劑盒(TwistDx);ExTaqDNA聚合酶、DL2000 DNA marker (TaKaRa);dNTPs (Promega); Veriti 96孔梯度PCR儀 (AB Applied Biosystems); ND-1000 分光光度計(NanoDrop); H2O3-PRO金屬浴[金銀杏生物科技(北京)有限公司]。

1.3細菌培養(yǎng)及DNA制備

將細菌菌株在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(酵母膏1 g,牛肉浸膏3 g,蛋白胨5 g,葡萄糖10 g,瓊脂15 g,雙蒸水1 000 mL,調節(jié)pH 至7.2,高壓滅菌121℃,15 min)平板上畫線,于28℃ 培養(yǎng)2～3 d,獲得純培養(yǎng)物,按照細菌基因組DNA提取試劑盒(溶液型)說明書,分別提取供試細菌的DNA,用作RPA和PCR反應的模板。

1.4引物設計

參照番茄細菌性葉斑病菌hrpZPst基因序列(GenBank: AY999001.1)和文獻[13]-[15],結合RPA引物設計的特點,采用NCBI的Primer-BLAST在線軟件共設計8條引物(表1)。

表1　測試用引物Table 1　Primers used in this assay

1.5RPA反應

取2 μL番茄細菌性葉斑病菌DNA作為模板,DEPC處理過的超純水11.2 μL、10 μmol/L的正向引物2.4 μL、10 μmol/L的反向引物2.4 μL、干粉溶解緩沖液(rehydration buffer) 29.5 μL,加280 mmol/L醋酸鎂2.5 μL啟動反應,總體積為50 μL,混勻后38℃ 孵育40 min。同時以滅菌超純水代替細菌DNA作為空白對照,并用TwistAmp Basic試劑盒中提供的引物和模板DNA作為陽性對照來監(jiān)控擴增反應是否正常。擴增產物用回收試劑盒純化。

1.6常規(guī)PCR

取2 μL的細菌模板DNA,加10×PCR buffer(含Mg2+) 2.5 μL、DEPC處理過的超純水17.2 μL、10 μmol/L的正向引物1 μL、10 μmol/L的反向引物1 μL、10 mmol/L 的dNTPs 1 μL、5 U/μL 的ExTaqDNA聚合酶0.3 μL,總體積為25 μL,混勻后進行PCR反應。反應程序為:94℃預變性5 min;94℃變性30 s、57℃復性45 s、72℃延伸60 s,35個循環(huán);72℃延伸10 min,反應結束后保存于4℃。

1.7電泳

取5 μL RPA或PCR擴增產物在3%的瓊脂糖上電泳30 min,凝膠成像儀上拍照 。

2　結果與分析

2.1引物的篩選

用所設計的8條引物建立9種檢測組合(表2),以番茄細菌性葉斑病菌的DNA為模板進行RPA反應,篩選擴增效率高的引物對。結果顯示,所有組合均能擴增出預期大小的片段,試劑盒陽性對照擴增出預期的143 bp 片段,空白對照未擴增出產物。從凝膠電泳圖片分析,T1、T2和T3組合產物擴增量較大,條帶清晰,其中T1組合條帶最粗亮,擴增效率最高;T6、T7、T8、T9擴增較明顯,T4、T5擴增較弱(圖1)。因此,選擇T1引物對用于后續(xù)RPA方法檢測靈敏度和特異性測試。

表2　RPA擴增用的引物對Table 2　Primer pairs for RPA

圖1　9對RPA引物組擴增檢測結果Fig.1　Amplification results of nine RPA primer pairs

2.2RPA 檢測靈敏度

將番茄細菌性葉斑病菌菌株ATCC BAA-871的DNA做10倍梯度稀釋,用引物對p1-f/p1-r分別進行RPA和PCR凝膠電泳檢測,結果表明,檢測靈敏度均為75 fg/μL DNA。靈敏度相當(圖2)。

圖2　RPA 法和PCR法的靈敏度檢測結果Fig.2　Sensitivity test results of RPA and PCR methods

2.3RPA方法的特異性測試

利用5株番茄病原細菌和7株近緣細菌菌株進行該RPA方法特異性測試。結果表明,3個供試的番茄細菌性葉斑病菌菌株均能擴增出282 bp的目標片段,而其他9種病原細菌未擴增出282 bp的目標片段(圖3),表明利用RPA能特異性擴增出番茄細菌性葉斑病菌的目標片段,可用于快速檢測。

圖3　RPA法檢測番茄細菌性葉斑病菌的特異性Fig.3　Specificity test results of RPA for Pst

3　討論

本文建立的番茄細菌性葉斑病菌RPA檢測方法,38℃等溫條件下就能實現DNA 解鏈并在40 min內完成目標DNA 的快速擴增,可特異性檢測到3個供試的番茄細菌性葉斑病菌菌株,對其他9種細菌的檢測結果為陰性,RPA檢測番茄細菌性葉斑病菌(ATCC BAA-871)的靈敏度和普通PCR的結果相當,均可達到75 fg/μL DNA。

RPA對引物的要求比較嚴格。用于RPA擴增的引物通常由30～35個核苷酸組成,這種較長的引物與模板序列嚴格互補,使RPA擴增出來的產物特異性高,普通PCR引物(長度通常為20 個左右的核苷酸)不能用于RPA擴增,而RPA的引物卻可用于PCR擴增。

RPA對儀器設備的要求比PCR要低,不需要貴重的PCR儀,一臺小型的金屬浴或水浴鍋即可完成反應,若配以瓊脂糖凝膠電泳或小型便攜設備[16],1 h內即可獲得檢測結果,適合基層簡易實驗室的快速檢測。

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(責任編輯：楊明麗)

RapiddetectionofPseudomonas syringaepv. tomatobyRPAmethod

WeiMeisheng,TianQian,ZhaoWenjun,LiGuifen,KongJun

(Institute of Plant Quarantine, Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing100029, China)

BacterialspeckoftomatocausedbyPseudomonas syringaepv. tomato (Pst)isaseriousdiseaseintomatoandathreattotomatoproduction,whichcouldbetransmittedbyinfectedseeds.PstisconsideredaquarantineorganismandsubjecttophytosanitaryregulationsinChina.Rapidandconvenientdetectionmethodisimportantforthediseasecontrol.Arecombinasepolymeraseamplification(RPA)assaywasdevelopedbasedonthehrpZPstgenesequence.ThreeisolatesofPstcanbespecificallydetectedandotherninebacterialstrainsgotnegativeresult.ThedetectionlimitofRPAforbacterialgenomeDNAisabout75fg/μL,similartoPCRagarosegelelectrophoresis.Themethodisrapid,sensitive,andsuitableforuseinprimarylevellaboratory.

Pseudomonassyringaepv.tomato;recombinase polymerase amplification;RPA;isothermal amplification;detection

2014-12-14

2015-01-03

質檢公益性行業(yè)科研專項(201310071)；“十二五”國家科技支撐計劃項目(2012BAK11B02)

E-mail:wenjunzhao@188.com

S436.412

ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2016.01.027