番茄黃化曲葉病毒的鑒定與群體進化分析

周　瑩,　尚巧霞,　羅　晨,　喬廣行,　劉　梅,　張　瑋,　燕繼曄*

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護環(huán)境保護研究所, 北京　100097; 2.北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 北京　102206)

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番茄黃化曲葉病毒的鑒定與群體進化分析

周瑩1,尚巧霞2,羅晨1,喬廣行1,劉梅1,張瑋1,燕繼曄1*

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護環(huán)境保護研究所, 北京100097; 2.北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 北京102206)

番茄黃化曲葉病(tomatoyellowleafcurldisease,TYLCD)是番茄上的重要病害,可由多種雙生病毒引起。為了明確北京地區(qū)番茄黃化曲葉病的病毒種類和病毒基因組變異情況,本研究收集了51個采自北京不同區(qū)縣的病毒疑似樣品,進行了雙生病毒的檢測及分離物的基因組分析。經(jīng)雙生病毒簡并引物檢測25個樣品呈陽性；擴增獲得10個代表性分離物的全基因組,大小均為2 781bp,共含有6個開放閱讀框；經(jīng)比對,10個分離物與Tomato yellow leaf curl virus-Israel(TYLCV-IL)同源率大于99%；基于我國TYLCV分離物全基因組序列的變異分析表明,TYLCV在進化上比較保守,整個基因組上的變異是不均勻的；系統(tǒng)發(fā)育樹顯示我國TYLCV分離物在進化樹上可分為3個組群,分析了我國TYLCV群體進化情況。

雙生病毒鑒定;基因組變異;系統(tǒng)發(fā)育

番茄黃化曲葉病(tomatoyellowleafcurldisease,TYLCD)是世界范圍內(nèi)引起番茄嚴(yán)重減產(chǎn)的重要病害,該病害由雙生病毒科病毒侵染引起。雙生病毒科(Geminiviridae)病毒是一類具有孿生顆粒形態(tài)的單鏈環(huán)狀DNA病毒,國際病毒分類委員會(InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses,ICTV)第九次報告中將雙生病毒科病毒分成7個屬[1],其中菜豆金色黃花葉病毒屬(Begomovirus)的成員最多。該屬成員多數(shù)為雙組分基因組,含有2條大小為2.5～3.0kb的DNA分子,即DNA-A和DNA-B；少數(shù)成員為單組分,其基因組結(jié)構(gòu)類似于雙組分的DNA-A,大小約2.8kb[2],單個組分就能侵染致病,如番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)[3]；還有一些單組分的病毒伴隨有一種衛(wèi)星分子DNAβ,兩者必須共同侵染才能引起典型癥狀[4-5]。

番茄被雙生病毒侵染后,主要表現(xiàn)為曲葉、斑駁、黃化、節(jié)間縮短以及植株矮化等癥狀。即使癥狀相似,引起番茄黃化曲葉病的病原也可能不同；引起番茄黃化曲葉的病毒種類較為復(fù)雜,同一地區(qū)的番茄往往被多種雙生病毒所侵染。Fauquet等報道番茄至少受到60多種雙生病毒的侵染[6],在我國侵染番茄的雙生病毒至少有9種,包括番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)[7]、中國番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)[5]、廣東番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl Guangdong virus,ToYLCGDV)[8]、泰國番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl Thailand virus,TYLCTHV)[9],中國番茄曲葉病毒(Tomato leaf curl China virus,ToLCCNV)[10],海南番茄曲葉病毒(Tomato leaf curl Hainan virus,ToLCHnV)[11],臺灣番茄曲葉病毒(Tomato leaf curl Taiwan virus,ToLCTWV)[12]、中國番木瓜曲葉病毒(Papaya leaf curl China virus,PaLCuCNV)[13]和煙草曲莖病毒(Tobacco curly shoot virus,TbCSV)[14]等。

TYLCV是番茄上發(fā)生很普遍的一種雙生病毒,我國于2006年在上海首次發(fā)現(xiàn)[7],隨后由南向北擴散[15-20],給番茄生產(chǎn)造成了嚴(yán)重影響。國際病毒委員會根據(jù)地區(qū)和序列的不同將TYLCV分為以下幾個株系：Tomato yellow leaf curl virus-Gezira(TYLCV-Gez)、Tomato yellow leaf curl virus-Mild(TYLCV-MLD)、Tomato yellow leaf curl virus-Iran(TYLCV-IR)、Tomato yellow leaf curl virus-Israel(TYLCV-IL)和Tomato yellow leaf curl virus-Oman(TYLCV-OM)[6]。2009年北京地區(qū)首次報道了TYLCD的發(fā)生[16],隨后宋晰等確定北京的優(yōu)勢株系為TYLCV-IL株系[21]。為進一步明晰近幾年北京地區(qū)TYLCD病原種類變化以及病毒基因組變異進化等情況,我們于2011年-2013年分別在北京不同區(qū)縣采集TYLCD疑似病株,進行了病毒鑒定及分離物基因組序列分析。

1　材料與方法

1.1樣品采集

2011年-2013年分別在北京延慶、平谷、順義、大興、房山以及通州的日光溫室和大棚中采集表現(xiàn)疑似病毒癥狀的番茄葉片,保存于-80℃冰箱。樣品編號詳見結(jié)果部分。

1.2方法

1.2.1主要試劑

基因組DNA快速提取試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA快速純化回收試劑盒；dNTPs、ExTaqDNA聚合酶、載體pMD18-T、連接酶、大腸桿菌(Escherichia coli )DH5α為TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.2.2番茄樣品總DNA的提取

樣品DNA使用TaKaRaMiniBESTPlantGenomicDNAExtractionKit提取,按照試劑盒說明書操作。

1.2.3引物合成

參照GenBank中報道的危害番茄的雙生病毒DNA-A序列,通過Blastn比對,根據(jù)其序列保守區(qū),設(shè)計了3對擴增引物,F1/R1用于檢測或擴增DNA-A部分區(qū)域,與F6/R6擴增片段拼接獲得全長；F4/R5可擴增DNA-A全長。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。引物序列見表1。

表1　用于檢測和擴增雙生病毒序列的引物1)Table 1　Primers used for detection andamplification of geminiviruses

1)R=A/G,W=A/T,D=A/G/T。

1.2.4PCR擴增、克隆及測序

PCR反應(yīng)體系：10×PCR反應(yīng)緩沖液5μL,2.5mmol/LdNTPs4μL,20μmol/L上下游引物各2μL,ExTaq酶0.5μL,基因組DNA1μL,加ddH2O至總體積到50μL。充分混勻后于PCR儀上進行反應(yīng)。引物F1和R1PCR程序：94℃預(yù)變性4min；94℃變性45s,53℃退火30s,72℃延伸45s,30個循環(huán)；72℃延伸5min。引物F6和R6的PCR程序：94℃預(yù)變性4min；94℃變性45s,60℃退火45s,72℃延伸45s,30個循環(huán)； 72℃延伸10min。引物F4和R5的PCR程序：94℃預(yù)變性4min；94℃變性45s,53℃退火45s,72℃延伸90s,30個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR反應(yīng)以測序樣品為陽性對照,以健康植株為陰性對照。

將PCR產(chǎn)物回收克隆到載體pMD18-T上,篩選陽性克隆,委托博邁德科技發(fā)展有限公司測序。

1.2.5序列分析

引物F1/R1的擴增片段與引物F6/R6擴增片段利用DNAMAN軟件(Version6.0)拼接獲得基因組全長序列；DnaSP軟件(Version5)進行分離物全基因組序列的變異分析；進化樹采用MEGA(Version5.05)軟件neighbor-joining方法構(gòu)建。用于序列分析的GenBank序列見表2。

表2　用于系統(tǒng)進化及同源性分析的雙生病毒來源及基因組序列Table 2　GenBank sequences used in phylogenetic and homology analysis

2　結(jié)果與分析

2.1樣品檢測

以番茄葉片總DNA為模板,利用引物F1/R1對采集的51個樣品進行PCR檢測,其中25個樣品擴增得到約660bp特異條帶,檢出率為49%(表1)。

2.2DNA全序列特征及北京地區(qū)優(yōu)勢株系初步分析

選擇代表性樣品YQ11-1、PG11-4、SY13-2、DX13-1、DX13-9、FS13-2、FS13-3、FS13-5、FS13-10和TZ13-1等10個分離物進行全基因組序列測定,通過PCR擴增、克隆及測序,10個分離物基因組大小均為2 781bp(登錄號見表4),具有典型的雙生病毒基因組特征：閉合環(huán)狀的單鏈DNA,共編碼6個開放閱讀框(ORF)。10個病毒分離物間同源率為99.41%,通過NCBI比對,與TYLCV同源性很高；經(jīng)與TYLCV主要株系進行同源性比對發(fā)現(xiàn)(圖1),這些來源于北京不同區(qū)縣的病毒分離物與TYLCV-IL株系同源率高達99%,推斷目前北京地區(qū)引起TYLCD的病原為TYLCV,優(yōu)勢株系為TYLCV-IL。

表3　樣品采集信息及帶毒情況Table 3　Sampling details and detection results of collected samples

表4　TYLCV北京分離物GenBank登錄信息Table 4　GenBank accession numbers ofTYLCV isolates from Beijing

圖1　TYLCV北京分離物與TYLCV主要株系的同源性分析Fig.1　Homology analysis between Beijing isolates and main overseas strains of TYLCV

2.3我國TYLCV分離物進化變異分析

將來自北京的10個TYLCV分離物全序列與我國其他地區(qū)TYLCV分離物全序列進行比對,發(fā)現(xiàn)其同源率高達98.94%,說明TYLCV在進化上比較保守。為進一步分析我國TYLCV分離物基因組變異情況,用DnaSP(Version5)對45個我國TYLCV分離物進行了全基因組的序列變異分析,發(fā)現(xiàn)整個基因組上的變異是不均勻的,最大變異峰值在IR區(qū),另外1個變異峰值位于AC2和AC3的ORF的交疊處,最保守區(qū)段位于AC1ORF中間區(qū)域(圖2)。

圖2　我國TYLCV全基因組核苷酸變異分析Fig.2　Distribution of genetic variation estimated by nucleotide diversity(Pi)of TYLCV isolates in China

我國番茄黃化曲葉病毒病發(fā)生地域廣,發(fā)生時間也各異,為進一步分析我國番茄黃化曲葉病毒的來源和進化情況,選擇國內(nèi)主要發(fā)病省市的TYLCV分離物、其他代表性的番茄雙生病毒分離物以及國外代表性的TYLCV-Israel分離物,利用MEGA(Version5.05)軟件neighbor-joining方法構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹(圖3)。

圖3　基于侵染番茄的番茄黃化曲成病毒基因組序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.3　Phylogenetic tree of the genomic sequences of TYLCV-infecting tomato isolates from China and other countries

從進化樹看出：我國TYLCV分離物與TYLCV-IL株系處于同一分支,在進化樹上可分為3個組群,從每個組群包括的不同地理區(qū)域初步分析出TYLCV入境我國的2條路線,第一條由廣東一帶入境,經(jīng)過上海、浙江,逐步傳入內(nèi)陸湖北、河南、山東、河北、山西、北京及天津等地,第二條由江蘇一帶入境,逐步傳入內(nèi)陸安徽、河南、河北、山東、北京、遼寧、新疆等地；我國TYLCV分離物與墨西哥分離物(TYLCV-Israel_Mexico)親緣關(guān)系最近,與亞洲國家約旦、黎巴嫩、非洲國家突尼斯、埃及、美洲波多黎各、多米尼加以及美國TYLCV-Israel分離物親緣關(guān)系次之。我國另外3種重要的番茄雙生病毒中,中國番茄黃化曲葉病毒云南分離物(TYLCCNV-Chu)與日本、土耳其以及以色列TYLCV-Israel分離物親緣關(guān)系最近,廣東番茄黃化曲葉病毒(TYLCGdV)廣東分離物和泰國番茄黃化曲葉病毒(TYLCThV)云南分離物與TYLCV-MLD分離物、TYLCV-OM分離物、意大利、古巴、摩洛哥以及西班牙TYLCV-Israel分離物親緣關(guān)系最近。

3　討論

本試驗對2011年-2013年采自于北京不同區(qū)縣的疑似病毒感染的51個番茄樣品進行了雙生病毒的檢測,陽性率為49%,說明北京地區(qū)番茄雙生病毒危害依然很普遍；對部分代表性陽性樣品進行了病毒全基因組擴增和序列測定,獲得10個病毒分離物,序列分析顯示,這些來源于北京不同區(qū)縣的病毒分離物均與TYLCV-Israel株系同源性高,推測目前北京地區(qū)引起TYLCD的病原為TYLCV,優(yōu)勢株系為TYLCV-Israel株系。

北京的10個TYLCV分離物全序列與我國其他地區(qū)的35個TYLCV分離物全序列同源率為98.94%,利用DnaSP對共計45個TYLCV分離物進行全基因組序列變異分析后發(fā)現(xiàn),TYLCV在進化上比較保守,而且整個基因組上的變異是不均勻的,最大變異峰值在IR區(qū),另外1個變異峰值位于AC2和AC3的ORF的交疊處,最保守區(qū)段位于AC1ORF中間區(qū)域。

系統(tǒng)進化樹中我國TYLCV分離物與TYLCV-IL株系處于同一分支,表明目前我國TYLCV種群仍以TYLCV-IL為優(yōu)勢株系；我國TYLCV分離物在進化樹上可分為3個組群,從地理區(qū)域角度分析TYLCV入境我國的2條路線：廣東路線和江蘇路線,均由東部沿海一帶入境，沿鄰近省市向內(nèi)陸蔓延,反映出依靠煙粉虱的遷徙以及頻繁的苗木調(diào)運等由我國東南沿海地區(qū)向中部內(nèi)陸逐漸擴散的過程；對于北京各區(qū)縣的TYLCV毒源分析,大部分可能來源于廣東路線,小部分來源于江蘇路線；對我國TYLCV分離物與其他國家TYLCV分離物親緣關(guān)系分析發(fā)現(xiàn),我國TYLCV分離物與墨西哥分離物(TYLCV-Israel_Mexico)親緣關(guān)系最近,與亞洲國家約旦、黎巴嫩、非洲國家突尼斯、埃及、美洲波多黎各、多米尼加以及美國TYLCV-Israel分離物關(guān)系次之,反映了TYLCV-IL種群的進化過程,由此也推測國家之間頻繁的經(jīng)濟貿(mào)易可能是此類病毒長距離傳播最為重要的一種方式。而對我國另外3種重要的番茄雙生病毒親緣關(guān)系分析中,中國番茄黃化曲葉病毒云南分離物(TYLCCNV-Chu)與日本、土耳其以及以色列TYLCV-Israel分離物親緣關(guān)系最近,廣東番茄黃化曲葉病毒(TYLCGdV)和泰國番茄黃化曲葉病毒(TYLCThV)云南分離物與TYLCV-MLD分離物、TYLCV-OM分離物、意大利、古巴、摩洛哥以及西班牙的TYLCV-Israel分離物親緣關(guān)系最近,以上結(jié)果是否能反映侵染番茄的不同雙生病毒間的變異演化過程,有待于進一步分析。

綜上所述,TYLCV的發(fā)展與煙粉虱的遷徙和苗木貿(mào)易關(guān)系密切,因此加強苗木的檢測和煙粉虱的防治對于控制該病害具有非常重要的意義。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

IdentificationandevolutionaryanalysisofTomato yellow leaf curl virusisolatesinChina

ZhouYing1,ShangQiaoxia2,LuoChen1,QiaoGuanghang1,LiuMei1,ZhangWei1,YanJiye1

(1.InstituteofPlantandEnvironmentalProtection,BeijingAcademyofAgricultureandForestrySciences,Beijing100097,China; 2.PlantScienceandTechnologyCollege,BeijingUniversityofAgriculture,Beijing102206,China)

Tomatoyellowleafcurldisease(TYLCD)isanimportantdiseaseoftomatocausedbymanygeminiviruses.Ageminiviruswasfoundin25ofthe51samplescollectedinBeijing,andcompletegenomesequencesof10isolatesweredetermined.Allofthesequencescontained2 781nucleotidesencodingsixproteinsandsharedmorethan99%nucleotideidentitywithTomato yellow leaf curl virus-Israel(TYLCV-IL).GeneticanalysisbasedonthegenomesequenceofTYLCVisolatesinChinarevealedthatTYLCVhadlittlegeneticvariability,andphylogeneticanalysesshowedthattheyclusteredintothreegroups.

identificationofgeminivirus;geneticvariationofgenome;phylogeneticanalysis

2015-01-15

2015-03-25

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201003065);北京市農(nóng)林科學(xué)院青年科研基金(QNJJ201320)

E-mail：jiyeyan@gmail.com

S432.4

ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2016.01.018