禾谷炭疽菌CFEM效應(yīng)子的生物信息學(xué)鑒定與轉(zhuǎn)錄分析

井忠英,　王國梁,　劉文德

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室, 北京　100193)

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禾谷炭疽菌CFEM效應(yīng)子的生物信息學(xué)鑒定與轉(zhuǎn)錄分析

井忠英,王國梁*,劉文德*

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室, 北京100193)

植物病原真菌效應(yīng)子是指可以改變寄主植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)或者細(xì)胞功能的分泌蛋白或其他小分子物質(zhì)。效應(yīng)子對病原真菌的侵入、擴展以及致病發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,是植物病原真菌與寄主的互作不斷演化的必然結(jié)果。真菌特有的CFEM(commoninseveralfungalextracellularmembraneprotein)蛋白對于病原真菌的致病性起重要作用,一些能夠被分泌到胞外的CFEM蛋白被證明是病原真菌效應(yīng)子。由禾谷炭疽菌(Colletotrichum graminicola)引起的玉米炭疽病是玉米上的重要病害,常年造成嚴(yán)重?fù)p失。本研究運用生物信息學(xué)工具對禾谷炭疽菌中的CFEM蛋白進(jìn)行信號肽分析和亞細(xì)胞定位分析,進(jìn)而通過轉(zhuǎn)錄分析明確禾谷炭疽菌CFEM蛋白的表達(dá)時期。分析結(jié)果表明,該病原真菌編碼32個CFEM蛋白,其中22個具有信號肽并可分泌至胞外,為分泌蛋白。轉(zhuǎn)錄分析表明,10個CFEM分泌蛋白于病菌侵染時附著胞形成期表達(dá),2個CFEM分泌蛋白于侵染后的活體寄生階段表達(dá),1個于死體寄生階段表達(dá),其余9個CFEM分泌蛋白在病菌侵染時期的3個階段均穩(wěn)定表達(dá)。結(jié)合生物信息學(xué)和轉(zhuǎn)錄分析結(jié)果,我們預(yù)測這22個CFEM分泌蛋白為禾谷炭疽菌致病相關(guān)的效應(yīng)子(簡稱CFEM效應(yīng)子)。明確禾谷炭疽菌中CFEM蛋白數(shù)量,預(yù)測病菌致病相關(guān)的CFEM效應(yīng)子組成,可為開展病原真菌CFEM蛋白介導(dǎo)的病菌—寄主互作研究奠定基礎(chǔ),并為玉米炭疽病的防治和抗性育種研究提供參考。

禾谷炭疽菌;CFEM效應(yīng)子;生物信息學(xué)分析

玉米是世界三大作物之一,也是目前中國第一大糧食作物。每年作物病害都會造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,直接威脅世界糧食安全[1-3]。據(jù)統(tǒng)計,玉米絲黑穗病以及大斑病、小斑病是危害我國玉米生產(chǎn)的3種主要病害,但隨著耕作方式的轉(zhuǎn)變以及全球氣候、生態(tài)的改變,十余種次要病害逐年加重[4-5],部分病害有上升為主要病害的趨勢,已成為制約玉米生產(chǎn)的重要因素。目前玉米炭疽病已在我國各玉米種植區(qū)普遍發(fā)生,其病原菌是半活體寄生菌禾谷炭疽菌(Colletotrichum graminicola),其侵染階段分為附著胞形成期、活體寄生和死體寄生3個階段。該病原真菌僅危害玉米,不危害其他禾本科作物[6-7]。基因組學(xué)和分子生物學(xué)的快速發(fā)展以及2008年該菌全基因組信息的公布,極大地促進(jìn)了禾谷炭疽菌—玉米的互作研究,為揭示病原菌的侵染致病機制和寄主植物的抗病反應(yīng)機理,以及制定該病害的有效防控措施奠定了基礎(chǔ)。

病菌效應(yīng)子在病原真菌和寄主的互作中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,其直接影響病菌的侵入、擴展蔓延和病害發(fā)生[8-10]。病原真菌效應(yīng)子主要為病菌分泌蛋白,少部分為病菌分泌的其他小分子物質(zhì),由病菌分泌至寄主細(xì)胞間或細(xì)胞內(nèi)[11],繼而與寄主相應(yīng)靶標(biāo)互作,引起寄主細(xì)胞結(jié)構(gòu)或功能的改變[12]。病原真菌效應(yīng)子一般具有如下3方面特征:(1)一般通過胞吐的方式由病菌分泌至體外,故效應(yīng)子N端氨基酸序列具有信號肽[11,13];(2)真菌效應(yīng)子一般不具有膜蛋白的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域及GPI(glycosylphosphatidyli-nositol)錨定位點;(3)效應(yīng)子一般在病原真菌侵染階段表達(dá),尤其是活體或死體寄生階段[14]。

CFEM(commoninseveralfungalextracellularmembraneprotein)蛋白僅存在于真菌中,且常見于真菌的胞外膜蛋白[15],并因此而得名。該蛋白結(jié)構(gòu)域約有60個氨基酸,共有8個半胱氨酸。研究證實CFEM蛋白與病菌致病性密切相關(guān),白假絲酵母(Candida albicans)[16]以及粗球孢子菌(Coccidioides immitis)[17]等病原真菌中均已發(fā)現(xiàn)致病相關(guān)的CFEM蛋白。半活體寄生菌稻瘟病菌(Magnapothe oryzae)已發(fā)現(xiàn)致病相關(guān)的CFEM效應(yīng)子[18],但目前尚無禾谷炭疽菌(C.graminicola)致病相關(guān)CFEM效應(yīng)子的報道。因此,本文利用生物信息學(xué)方法分析禾谷炭疽菌CFEM蛋白。通過對CFEM蛋白進(jìn)行信號肽分析,亞細(xì)胞定位分析,結(jié)合轉(zhuǎn)錄分析結(jié)果,預(yù)測禾谷炭疽菌CFEM效應(yīng)子組成,將為進(jìn)一步研究該菌CFEM效應(yīng)子的功能奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

利用已發(fā)表的稻瘟菌(M. oryzae)胞外受體信號分子CFEM蛋白ACI1[19]的CFEM結(jié)構(gòu)域氨基酸序列進(jìn)行Blastp(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)搜索禾谷炭疽菌全基因組數(shù)據(jù)庫(http:∥www.broadinstitute.org/annotation/genome/colletotrichum_group/MultiHome.html)。根據(jù)是否存在CFEM結(jié)構(gòu)域的典型特征,共鑒定到32個C.graminicolaCFEM蛋白,并從禾谷炭疽菌全基因組數(shù)據(jù)庫中調(diào)取這32個CFEM蛋白的氨基酸序列,供進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析。

試驗所用玉米品種‘Mo17’由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所王曉鳴研究員提供。禾谷炭疽菌(C.graminicola)M2菌株由美國TexasA&MUniversity的MartinDickman教授惠贈。

1.2方法

1.2.1生物信息學(xué)分析

使用ExPASy平臺的在線軟件SignalP4.1Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和TargetP1.1(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)分別預(yù)測蛋白質(zhì)氨基酸序列的N端信號肽和亞細(xì)胞定位。按要求輸入fasta格式的32個氨基酸序列,N信號肽分析選擇默認(rèn)設(shè)置,而亞細(xì)胞定位分析時organismgroup選擇non-plant,其他為默認(rèn)設(shè)置。

1.2.2轉(zhuǎn)錄分析

玉米‘Mo17’3葉1心期為最佳接種時期,菌株M2孢子濃度為(5～6)× 105個/mL,分別于接種后20h(附著胞形成階段,PA)、36h(活體寄生階段,BP)、64h(死體寄生階段,NP)取樣。提取野生型禾谷炭疽菌M2侵染時期表達(dá)RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,RT-PCR擴增獲得3個表達(dá)時期的CFEM蛋白基因。RNA提取及反轉(zhuǎn)錄為cDNA的方法按O′Connell等[20]所述,所有CFEM蛋白基因克隆片段均構(gòu)建至Peasy-T載體(購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)并送北京六合華大基因科技有限公司測序,測序結(jié)果與基因注釋完全一致。所有引物皆由北京六合華大基因科技有限公司合成;RNA提取方法參見QIGEN公司RNeasePlantMinikit試劑盒使用說明;反轉(zhuǎn)錄參見Promega公司M-MLV反轉(zhuǎn)錄體系說明。

2　結(jié)果與分析

2.1禾谷炭疽菌CFEM蛋白信號肽分析

信號肽是分泌蛋白的基本特征。因此,本文首先對禾谷炭疽菌中所有的CFEM蛋白信號肽預(yù)測,初步確定禾谷炭疽菌CFEM分泌蛋白的組成。由SignalP4.1Server在線軟件對該菌CFEM蛋白進(jìn)行信號肽預(yù)測分析的結(jié)果顯示,32個CFEM蛋白中有22個CFEM蛋白N端氨基酸序列具有信號肽,其信號肽序列為N端15～28個氨基酸(表1)。信號肽可引導(dǎo)蛋白精確地定位于胞內(nèi)線粒體、葉綠體或通過分泌系統(tǒng)分泌至胞外[21]。因此,需進(jìn)一步明確CFEM蛋白的亞細(xì)胞定位,從而排除胞內(nèi)CFEM蛋白或膜蛋白。

表1　禾谷炭疽菌CFEM蛋白信號肽分析1)Table 1　Bioinformatic analysis of signal peptide of CFEM proteins in Colletotrichum graminicola

1) +表示該基因表達(dá)的蛋白具有信號肽；-表示該基因表達(dá)的蛋白不具有信號肽。

+indicatestheproteinhassignalpeptidesequences;-indicatestheproteinhasnosignalpeptidesequences.

2.2禾谷炭疽菌CFEM蛋白亞細(xì)胞定位分析

繼信號肽分析之后,本文利用TargetP軟件對22個具信號肽CFEM蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析,進(jìn)一步明確CFEM胞外分泌蛋白的組成。預(yù)測結(jié)果表明,22個具有信號肽CFEM蛋白通過分泌途徑分泌至胞外的得分值≥0.672。其中,除GLRG_08904.1、GLRG_10834.1定位可信度略低(RC=4)外,其余20個CFEM蛋白的定位預(yù)測可信度皆較高(RC≤2)。因此,22個具有信號肽CFEM蛋白均為分泌蛋白,可通過禾谷炭疽菌分泌途徑分泌至胞外(表2)。

表2　22個具信號肽的CFEM蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測分析1)Table 2　Subcellular localization prediction of CFEM proteins in Colletotrichum graminicola

續(xù)表2Table2(Continued)

蛋白序列號ProteinID細(xì)胞器定位得分值SubcellularlocalizationpredictionvaluesmTPSPOtherLocRC蛋白序列號ProteinID細(xì)胞器定位得分值SubcellularlocalizationpredictionvaluesmTPSPOtherLocRCGLRG_06380.10.0560.8620.039S1GLRG_10780.10.0370.9740.021S1GLRG_06414.10.0190.9700.046S1GLRG_10834.10.0630.6720.316S4GLRG_08253.10.1140.7930.034S2GLRG_10885.10.0370.9550.042S1

1) RC:可信度等級,估算亞細(xì)胞定位預(yù)測最大值和次值之間的差距(diff)。RC=1～5,1:diff≥0.800;2:0.800>diff≥0.600;3:0.600>diff≥0.400;4:0.400>diff≥0.200;5:diff<0.200。RC值越低,定位越準(zhǔn)確,RC=1定位預(yù)測最可靠。mTP:線粒體定位;S:分泌途徑;SP:該蛋白含有信號肽,可通過分泌途徑分泌至胞外,為分泌蛋白;Other:其他定位;Loc:預(yù)測定位結(jié)果。
RC:Reliabilityclass,from1to5,where1indicatesthestrongestprediction. RCisameasureofthesizeofthedifference(diff)betweenthehighest(winning)andthesecondhighestoutputscores.Thereare5reliabilityclasses,definedasfollows: 1, diff ≥ 0.800; 2, 0.800 > diff ≥ 0.600; 3, 0.600 > diff ≥ 0.400; 4, 0.400 > diff ≥ 0.200;5, diff<0.200.Thus,thelowerthevalueofRC,thesafertheprediction;mTP:Mitochondrionlocalization,i.e.thesequencecontainsmTP,amitochondrialtargetingpeptide;S:Secretionpathway;SP:Signalpeptide;Other:Anyotherlocalization;Loc:Predictionoflocalization.

2.3禾谷炭疽菌CFEM分泌蛋白的轉(zhuǎn)錄分析

禾谷炭疽菌侵染玉米的過程可以分為3個階段,分別是“附著胞形成階段(in plantaappressoria,PA)、活體寄生階段(biotrophicphase,BP)、死體寄生階段(necrotrophicphase,NP)”。已知病原真菌侵染階段表達(dá)的分泌蛋白更有可能與病菌的致病密切相關(guān),為此,繼亞細(xì)胞定位分析之后,我們對已鑒定的禾谷炭疽病菌22個CFEM分泌蛋白做相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄分析,即利用病原真菌接種寄主植物,獲取侵染時期3個階段的RNA和cDNA,繼而借助RT-PCR分析所有CFEM分泌蛋白的表達(dá)情況。RT-PCR分析結(jié)果表明,9個CFEM分泌蛋白在禾谷炭疽菌3個時期均有表達(dá);10個CFEM分泌蛋白在禾谷炭疽菌侵染玉米過程的附著胞形成階段特異表達(dá);GLRG_08904.1、GLRG_09163.1在禾谷炭疽菌形成初級侵染菌絲的活體寄生階段特異表達(dá);GLRG_05629.1在禾谷炭疽菌形成次級侵染菌絲、誘導(dǎo)寄主細(xì)胞凋亡的死體寄生階段特異表達(dá)(表3)。因此,22個CFEM分泌蛋白皆可在禾谷炭疽菌侵染階段表達(dá),我們預(yù)測這22個基因均為禾谷炭疽菌CFEM效應(yīng)子。

表3　CFEM效應(yīng)子轉(zhuǎn)錄分析1)Table 3　Transcriptional analysis of Colletotrichum graminicola CFEM effectors

1)PA:附著胞形成階段表達(dá)的CFEM效應(yīng)子;BP:活體寄生階段表達(dá)的CFEM效應(yīng)子;NP:死體寄生階段表達(dá)的CFEM效應(yīng)子;ALL:以上3個階段均表達(dá)的CFEM效應(yīng)子;+表示效應(yīng)子在該時期表達(dá)。

PA:In plantaappressoriumphase;BP:Biotrophicphase;NP:Necrotrophicphase;ALL:Allthesethreeinfectionphase,includingPA,BPandNP;+meansthiscandidateeffectorexpressedinthisphase.

3　討論

病原真菌與寄主植物的互作一直是近年來的研究熱點,其中效應(yīng)子誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)ETI(effector-triggeredimmunity)和效應(yīng)子誘導(dǎo)的感病反應(yīng)ETS(effector-triggeredsusceptibility)的研究報道尤其之多。禾谷炭疽菌侵染寄主植物時,其附著胞在病原真菌侵染初期吸附于寄主植物表面,通過膨壓直接穿透寄主表面;隨后病原真菌的侵染菌絲(初級侵染菌絲及次級侵染菌絲)在寄主細(xì)胞內(nèi)蔓延擴展,通過分泌大量的效應(yīng)子對寄主的生理生化免疫防衛(wèi)反應(yīng)起到直接干擾作用,阻礙寄主相應(yīng)受體靶標(biāo)的功能執(zhí)行,進(jìn)而導(dǎo)致寄主免疫防衛(wèi)體系紊亂,誘發(fā)ETS[22]。因此,效應(yīng)子研究可以明晰病原真菌與寄主互作機理,為抗病育種和病害防治提供理論指導(dǎo)。

據(jù)報道,半活體寄生菌稻瘟菌約含61個CFEM蛋白[23],研究表明PTH11[24-26]、ACI1[19,27]及MoCDIP2[18]這3個CFEM基因均于附著胞形成期表達(dá)。ACI1為胞外受體信號分子,通過與MAC1的互作,參與cAMP信號傳遞,直接影響附著胞的形成,但與稻瘟菌營養(yǎng)生長和致病性無關(guān)[27]。與之相反,PTH11作為附著胞及芽管胞內(nèi)信號分子[24]與附著胞的形成無關(guān)[25],而與稻瘟菌的致病性密切相關(guān)[24,26];MoCDIP2可誘導(dǎo)寄主細(xì)胞凋亡[18],是目前唯一鑒定到的稻瘟菌CFEM效應(yīng)子。此外,研究證實白假絲酵母(C.albicans)的CFEM蛋白CSA1及粗球孢子菌(C.immitis)的CFEM蛋白AG2均為膜蛋白,能夠調(diào)節(jié)菌絲生長及其致病性[16-17]。因此,推測CFEM蛋白可能為真菌細(xì)胞表面受體或信號分子,承接信號傳遞,從而影響真菌致病性。

隨著基因組預(yù)測的快速發(fā)展,生物信息學(xué)分析逐漸成為一門基于計算機學(xué)、數(shù)學(xué)、物理學(xué)、生物學(xué)的交叉學(xué)科,在序列同源性分析、二級或三級結(jié)構(gòu)域分析以及功能預(yù)測方面發(fā)揮重要作用,基于生物信息學(xué)分析的研究亦與日俱增[28-31],極大地促進(jìn)了病原真菌效應(yīng)子的預(yù)測和研究。禾谷炭疽菌是半活體寄生菌研究的模式物種,然而,尚無相關(guān)CFEM效應(yīng)子的報道。因此,CFEM效應(yīng)子功能的解讀有助于加快病菌-寄主互作機理的研究步伐。效應(yīng)子各具特色,無明顯的結(jié)構(gòu)特征。除Fusarium oxysporumf.sp. lycopersici中的Six1[32]外,同一屬不同種的效應(yīng)子亦不盡相同。但只要病原菌可以分泌該蛋白質(zhì)至體外，并且該蛋白可影響寄主植物的生理反應(yīng)，干擾寄主的免疫防衛(wèi)反應(yīng)，即是效應(yīng)子。因此,信號肽成為效應(yīng)子評判的重要指標(biāo)[14]。因此,本文首先利用SignalP軟件分析禾谷炭疽菌中32個CFEM蛋白,確定禾谷炭疽菌共有22個具信號肽CFEM蛋白。其次,利用TargetP軟件分析是否所有的具信號肽CFEM蛋白皆可分泌至胞外,從而影響病菌與寄主的互作。Lee等及陳繼圣等已用TargetP軟件預(yù)測稻瘟菌(M. oryzae)和假絲酵母(C.albicans)基因組中的分泌蛋白,其預(yù)測結(jié)果與實際基本一致[21,33]。我們綜合信號肽分析和亞細(xì)胞定位分析兩方面的預(yù)測結(jié)果,推測禾谷炭疽菌C.graminicola共有22個CFEM分泌蛋白。然而,并非所有的分泌蛋白都與病菌的致病性相關(guān),研究證實侵染階段表達(dá)的分泌蛋白更有可能影響病菌致病性,即更有可能為效應(yīng)子[14]。我們通過RT-PCR技術(shù),確定禾谷炭疽菌(C.graminicola)22個CFEM分泌蛋白均在病菌的侵染階段表達(dá)。其中,GLRG_08904.1、GLRG_09163.1以及GLRG_05629.1分別于病菌的活體寄生階段和死體寄生階段表達(dá),與病菌的致病性關(guān)系可能更為密切。鑒于以上3個方面的分析,預(yù)測禾谷炭疽菌中存在22個CFEM效應(yīng)子。本研究利用生物信息學(xué)的方法對禾谷炭疽菌所有CFEM蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)測和分析,將為后續(xù)的功能研究(通過酵母蛋白分泌系統(tǒng)分析、基因敲除和突變體接種、煙草瞬時表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞凋亡篩選等試驗)奠定堅實的基礎(chǔ)。

[1]PennisiE.Armedanddangerous[J].Science, 2010, 327(5967): 804-805.

[2]FisherMC,HenkDA,BriggsCJ,etal.Emergingfungalthreatstoanimal,plantandecosystemhealth[J].Nature,2012,484(7393):186-194.

[3]LiuWende,LiuJinling,NingYuese,etal.RecentprogressinunderstandingPAMP-andeffector-triggeredimmunityagainstthericeblastfungusMagnaporthe oryzae [J].MolecularPlant,2013,6(3):605-620.

[4]王曉鳴,晉齊鳴,石潔,等.玉米病害發(fā)生現(xiàn)狀與推廣品種抗性對未來病害發(fā)展的影響[J].植物病理學(xué)報,2006,36(1):1-11.

[5]冀萍. 玉米病害的發(fā)生與防治[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2011(19): 196-196.

[6]VargasWA,MartínJMS,RechGE,etal.PlantdefensemechanismsareactivatedduringbiotrophicandnecrotrophicdevelopmentofColletotrichum graminicolainmaize[J].PlantPhysiology, 2012, 158(3): 1342-1358.

[7]TorresMF,CuadrosDF,VaillancourtLJ.EvidenceforadiffusiblefactorthatinducessusceptibilityintheColletotrichum-maizediseaseinteraction[J].MolecularPlantPathology, 2014, 15(1): 80-93.

[8]DoddsPN,RathjenJP.Plantimmunity:towardsanintegratedviewofplant-pathogeninteractions[J].NatureReviewsGenetics, 2010, 11(8): 539-548.

[9]MaekawaT,KuferTA,Schulze-LefertP.NLRfunctionsinplantandanimalimmunesystems:sofarandyetsoclose[J].NatureImmunology, 2011, 12(9): 817-826.

[10]GassmannW,BhattacharjeeS.Effector-triggeredimmunitysignaling:fromgene-for-genepathwaystoprotein-proteininteractionnetworks[J].MolecularPlant-MicrobeInteractions, 2012, 25(7): 862-868.

[11]GiraldoMC,ValentB.Filamentousplantpathogeneffectorsinaction[J].NatureReviewsMicrobiology, 2013, 11(11): 800-814.

[12]KamounS.Acatalogueoftheeffectorsecretomeofplantpathogenicoomycetes[J].AnnualReviewofPhytopathology, 2006, 44: 41-60.

[13]TortoTA,LiShuang,StyerA,etal.ESTminingandfunctionalexpressionassaysidentifyextracellulareffectorproteinsfromtheplantpathogenPhytophthora [J].GenomeResearch, 2003, 13(7): 1675-1685.

[14]EllisJG,RafiqiM,GanP,etal.Recentprogressindiscoveryandfunctionalanalysisofeffectorproteinsoffungalandoomyceteplantpathogens[J].CurrentOpinioninPlantBiology, 2009, 12(4): 399-405.

[15]KulkarniRD,KelkarHS,DeanRA.Aneight-cysteine-containingCFEMdomainuniquetoagroupoffungalmembraneproteins[J].TrendsinBiochemicalSciences, 2003, 28(3): 118-121.

[16]LamarreC,DeslauriersN,BourbonnaisY.ExpressioncloningoftheCandida albicansCSA1geneencodingamycelialsurfaceantigenbysortingofSaccharomyces cerevisiaetransformantswithmonoclonalantibody-coatedmagneticbeads[J].MolecularMicrobiology, 2000, 35(2): 444-453.

[17]PengT,OrsbornKI,OrbachMJ,etal.Proline-richvaccinecandidateantigenofCoccidioides immitis:conservationamongisolatesanddifferentialexpressionwithspherulematuration[J].JournalofInfectiousDiseases, 1999, 179(2): 518-521.

[18]ChenS,SongkumarnP,VenuRC,etal.Identificationandcharacterizationofinplanta-expressedsecretedeffectorproteinsfromMagnaporthe oryzaethatinducecelldeathinrice[J].MolecularPlant-MicrobeInteractions,2013,26(2):191-202.

[19]KulkarniRD,DeanRA.Identificationofproteinsthatinteractwithtworegulatorsofappressoriumdevelopment,adenylatecyclaseandcAMP-dependentproteinkinaseA,inthericeblastfungusMagnaporthe grisea [J].MolecularGeneticsandGenomics, 2004, 270(6): 497-508.

[20]O′ConnellRJ,ThonMR,HacquardS,etal.LifestyletransitionsinplantpathogenicColletotrichumfungidecipheredbygenomeandtranscriptomeanalyses[J].NatureGenetics, 2012, 44(9): 1060-1065.

[21]LeeSA,WormsleyS,KamounS,etal.AnanalysisoftheCandida albicansgenomedatabaseforsolublesecretedproteinsusingcomputer-basedpredictionalgorithms[J].Yeast, 2003, 20(7): 595-610.

[22]PieterseCMJ,Leon-ReyesA,vanderEntS,etal.Networkingbysmall-moleculehormonesinplantimmunity[J].NatureChemicalBiology, 2009, 5(5): 308-316.

[23]KulkarniRD,ThonMR,PanHuaqin,etal.NovelG-protein-coupledreceptor-likeproteinsintheplantpathogenicfungusMagnaporthe grisea [J].GenomeBiology, 2005, 6(3):R24.

[24]RamanujamR,CalvertME,SelvarajP,etal.Thelateendosomalhopscomplexanchorsactiveg-proteinsignalingessentialforpathogenesisinMagnaporthe oryzae [J].PLoSPathogens, 2013, 9(8):e1003527.

[25]JinQingchao,DongHaitao,PengYouliang,etal.ApplicationofcDNAarrayforstudyingthegeneexpressionprofileofmatureappressoriaofMagnaporthe grisea [J].JournalofZhejiangUniversityScienceB:Biomedicine&Biotechnology, 2007, 8(2): 88-97.

[26]DeZwaanTM,CarrollAM,ValentB,etal. Magnaporthe griseaPth11pisanovelplasmamembraneproteinthatmediatesappressoriumdifferentiationinresponsetoinductivesubstratecues[J].ThePlantCell, 1999, 11(10): 2013-2030.

[27]DengJixin,DeanRA.CharacterizationofadenylatecyclaseinteractingproteinACI1inthericeblastfungus, Magnaporthe oryzae [J].TheOpenMycologyJournal, 2008, 2: 74-81.

[28]SalomonD,KinchLN,TrudgianDC,etal.MarkerfortypeVIsecretionsystemeffectors[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences, 2014, 111(25): 9271-9276.

[29]SoyerJL,ElGhalidM,GlaserN,etal.EpigeneticcontrolofeffectorgeneexpressionintheplantpathogenicfungusLeptosphaeria maculans [J].PLoSGenetics, 2014, 10(3):e1004227.

[30]WangChenfang,ZhangShijie,HouRui,etal.FunctionalanalysisofthekinomeofthewheatscabfungusFusarium graminearum [J].PLoSPathogens, 2011, 7(12):e1002460.

[31]HrabakEM,ChanCWM,GribskovM,etal.TheArabidopsisCDPK-SnRKsuperfamilyofproteinkinases[J].PlantPhysiology, 2003, 132(2): 666-680.

[32]vanderDoesHC,LievensB,ClaesL,etal.ThepresenceofavirulencelocusdiscriminatesFusarium oxysporumisolatescausingtomatowiltfromotherisolates[J].EnvironmentalMicrobiology, 2008, 10(6): 1475-1485.

[33]陳繼圣, 鄭士琴, 鄭武, 等. 全基因組預(yù)測稻瘟菌的分泌蛋白[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2006, 39(12): 2474-2482.

(責(zé)任編輯：楊明麗)

BioinformaticidentificationandtranscriptionalanalysisofColletotrichum graminicolaCFEMeffectorrepertoires

JingZhongying,WangGuoliang,LiuWende

(StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)

Fungaleffectorsaresecretedproteinsorothermoleculesthatcanalterhostcellstructureandfunctions.Theyplayacrucialroleinfungalpathogenesisandaretheweaponsfrompathogensforthecontinuousbattlewithhostplants.Untilnow,itisunclearhowtheCFEM(commoninseveralfungalextracellularmembraneprotein)proteinsandeffectorsconstituteinColletotrichum graminicola,thecausalagentofmaizeanthracnosedisease.Inthisstudy,weperformedasystematicalbioinformaticandtranscriptionalexpressionanalysisoftheCFEMeffectorrepertoiresencodedintheC.graminicolagenome.Weidentified32 C.graminicolaCFEMproteins,with22CFEMsecretedproteinswhichshowedvariousexpressionpatternsatdifferentinfectionstages.Amongthesesecretedproteins, 10proteinsexpressedinin-plantaappressoriumstage,twoexpressedinbiotrophicstage,oneexpressedinnecrotrophicstage,andothernineexpressedinallofthesethreestages.Finally,weproposedthatthese22CFEMsecretedproteinsarecandidateeffectorsinC.graminicola.OurfindingsprovideasolidfoundationforthefutureinvestigationofCFEMeffectormediatedpathogen-hostinteraction,andalsowillfacilitatemaizeanthracnosepreventionandcontrolanddiseaseresistancebreeding.

Colletotrichum graminicola;CFEMeffector;bioinformaticanalysis

2014-12-10

2015-03-03

植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室開放課題(SKLOF201508)

E-mail:wang.620@osu.edu;liuwende@caas.cn

S435.131.4

ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2016.01.014