內(nèi)生黏質(zhì)沙雷氏菌LIEH 92對向日葵菌核病的防治效果及其防病機制研究

王　靖,　蘇志芳,　李亞珍,　王海偉,　鄭喜清,　邸　娜

(內(nèi)蒙古河套學院農(nóng)學系, 巴彥淖爾　015000)

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內(nèi)生黏質(zhì)沙雷氏菌LIEH 92對向日葵菌核病的防治效果及其防病機制研究

王靖*,蘇志芳,李亞珍,王海偉,鄭喜清,邸娜

(內(nèi)蒙古河套學院農(nóng)學系, 巴彥淖爾015000)

本研究評價了從向日葵列當體內(nèi)分離篩選得到的內(nèi)生黏質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)LIEH 92對向日葵菌核病進行盆栽與大田防效評價,并測定了該菌株的生理特性和其在根際土與向日葵體內(nèi)的定殖情況。結(jié)果表明,LIEH 92發(fā)酵液對向日葵菌核病的室內(nèi)盆栽防效達73.35%,對大田根腐型菌核病和盤腐型菌核病防效分別達53.48%和38.64%。菌株LIEH 92可產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶,并能在根際土和向日葵根、莖、葉內(nèi)定殖與傳導(dǎo),定殖菌量達102～106cfu/g。其在向日葵植株的根內(nèi)定殖數(shù)量最大,莖中次之,葉中最少。在滅菌土中LIEH 92在根際土和向日葵根部的定殖菌量小于在自然土中其在相應(yīng)部位的定殖菌量,而滅菌土中LIEH 92在向日葵莖部和葉部的定殖菌量則大于自然土中相應(yīng)的定殖菌量。LIEH 92處理可提高向日葵植株P(guān)AL、POD 和PPO等防御酶活性,從而誘導(dǎo)向日葵對菌核病的抗性。LIEH 92對向日葵菌核病具有生防潛力。

向日葵菌核病;黏質(zhì)沙雷氏菌;防病效果;定殖動態(tài);防御酶活性

向日葵菌核病導(dǎo)致葵花籽空殼率增加、籽仁含油率及蛋白質(zhì)含量下降,油質(zhì)變苦,品質(zhì)嚴重下降。向日葵整個生育期均可受到核盤菌的侵染,根據(jù)其侵染和發(fā)病部位不同可分為根腐型、莖腐型、葉腐型、盤腐型4種,內(nèi)蒙古河套地區(qū)以根腐型和盤腐型為主。根腐型植株受病菌侵染后,形成水漬狀病斑,隨病情發(fā)展病部產(chǎn)生白色菌絲體,后期菌絲體相互糾結(jié)纏繞產(chǎn)生硬度較大的黑色菌核,嚴重者整株萎蔫枯死。盤腐型一般發(fā)生于向日葵開花末期,造成花盤變軟、腐爛。

植物內(nèi)生細菌一方面靠宿主提供生存繁殖所需的養(yǎng)分和空間,另一方面可通過自身復(fù)雜的新陳代謝或借助信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等作用對植物體產(chǎn)生影響,反作用于宿主,表現(xiàn)出一些特殊的生物學功能,例如營養(yǎng)傳遞功能(固氮菌)、分解功能(溶磷菌)、促生功能(分泌植物激素的微生物)以及生物防治(增強宿主對病、蟲及不良環(huán)境的抗性)等[1]。植物內(nèi)生細菌具有良好的生防潛力,是生物菌劑的重要來源和微生態(tài)研究的重要對象。植物內(nèi)生菌在植物體內(nèi)生活,受外界環(huán)境影響小,通過分泌抑菌物質(zhì)、營養(yǎng)競爭、生態(tài)位排斥、誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性(ISR)、增強寄主化感作用等機制促進植物生長、抑制病害發(fā)生,一種內(nèi)生菌可同時具有幾種作用機制。

生防菌能否在靶標植物體內(nèi)及其根際適應(yīng)并定殖存活是篩選、評價土傳病害生防菌的重要指標。生防細菌的定殖能力與其生防效果成正比,定殖能力越強,生防細菌環(huán)境適應(yīng)性越強、防效越穩(wěn)定[2-5]。徐大可等[6]報道雙抗生素標記的黏質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)菌株可在越橘體內(nèi)定殖,其對菜豆炭疽病病原真菌(Colletotrichumlindemuthianum)抑菌率達70.5%,對2種越橘葉斑病病原菌擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsissp.)和柯氏帚梗柱孢霉(Cylindrocladiumcolhounii)的抑制率分別達68.6%和57.7%。龍良鯤等[7]報道內(nèi)生細菌01-144通過浸種和灌根處理后可在番茄根莖內(nèi)定殖,定殖數(shù)量呈“由增到減”趨勢,且在根部定殖能力大于莖內(nèi)。李術(shù)娜等[8]報道棉花黃萎病拮抗細菌2-70施入土壤5個月后仍可在棉花根內(nèi)保持菌量達103cfu/g。胡小加等[9]研究表明枯草芽胞桿菌Tu-100在油菜體內(nèi)定殖30 d后在根內(nèi)仍保持菌量1.3×102cfu/g。

本研究以發(fā)生普遍且危害嚴重的向日葵菌核病菌為靶標,利用從向日葵列當體內(nèi)分離篩選得到的內(nèi)生黏質(zhì)沙雷氏菌LIEH 92對向日葵菌核病進行盆栽與大田防效評價,測定該菌株的生理特性,以利福平作為標記、測定菌株LIEH 92在向日葵體內(nèi)的定殖情況,并研究其抗病機理,以豐富新型高效生物農(nóng)藥和生物菌肥開發(fā)所需的菌株資源,為向日葵列當內(nèi)生細菌的開發(fā)利用提供理論依據(jù),同時為內(nèi)生生防細菌的大田應(yīng)用及新型生物制劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1供試菌株

黏質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)LIEH92分離自內(nèi)蒙古巴彥淖爾市雙河鎮(zhèn)黃河灘地向日葵種植區(qū)的向日葵列當莖部,由河套地區(qū)綠色農(nóng)產(chǎn)品安全生產(chǎn)與預(yù)警控制實驗室提供。

向日葵菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)分離自巴彥淖爾市臨河區(qū)向日葵菌核病自然發(fā)病株莖基部,于4℃保存。

1.2供試向日葵品種

供試向日葵品種為‘星火’(食用向日葵,內(nèi)蒙古杭錦后旗綠源種子公司),高感菌核病。

1.3供試藥劑

50%腐霉利可濕性粉劑(日本住友化學株式會社)。抗重茬菌劑(北京中農(nóng)綠康生物技術(shù)有限公司),葵花專用生物菌劑。

1.4向日葵列當內(nèi)生細菌LIEH 92發(fā)酵液和菌懸液制備

將活化好的菌株LIEH92接入肉汁胨液體培養(yǎng)基(牛肉膏3g,酵母浸膏1g,蛋白胨5g,葡萄糖10g,水1 000mL,pH7.0),置于28℃的搖床中160r/min振蕩培養(yǎng)48h,制成108cfu/mL的黏質(zhì)沙雷氏菌株LIEH92發(fā)酵液。菌株發(fā)酵液在8 000r/min離心15min后棄上清,沉淀用無菌水稀釋至濃度108cfu/mL,即得到菌懸液。

1.5LIEH 92對向日葵菌核病盆栽防效試驗

將土壤高溫滅菌后裝入27.5cm×20cm的盆缽內(nèi),每盆土表均勻撒菌核20g后再覆土2cm。將食用向日葵品種‘星火’用內(nèi)生細菌LIEH92發(fā)酵液(108cfu/mL)浸泡24h后播種。分別在播種時、播種后10d和25d用LIEH92發(fā)酵液灌根,每盆100mL。待向日葵出苗后每盆留苗5株,每處理3盆,共15株。以50%腐霉利可濕性粉劑1 500倍液和清水代替LIEH92發(fā)酵液作為藥劑對照和空白對照。待清水對照發(fā)病后,調(diào)查各處理的發(fā)病率和防病效果。

1.6LIEH 92對向日葵菌核病大田防效試驗

試驗地設(shè)在內(nèi)蒙古巴彥淖爾市干召廟鎮(zhèn)東風三社向日葵菌核病重病田,‘星火’用LIEH92發(fā)酵液(108cfu/mL)浸泡3h后播種。試驗區(qū)隨機區(qū)組排列,每小區(qū)面積30m2(長25m，寬1.2m),播種80 株,株距60cm,四周設(shè)保護行,3次重復(fù)。分別在播種時、播種后10d和25d用內(nèi)生細菌LIEH92發(fā)酵液灌根,每株100mL,其他田間管理同常規(guī)生產(chǎn)。以清水為空白對照,向日葵抗重茬菌劑為藥劑對照。由于當?shù)叵蛉湛瞬∫愿秃捅P腐型為主,待向日葵開花末期分別調(diào)查根腐型和盤腐型菌核病發(fā)病情況。

向日葵根腐型菌核病分級標準[10]:0級,無任何癥狀;1級,發(fā)病輕,葉枯萎;2級,植株萎蔫,莖基部水漬狀病斑大于3cm;3級,整株死亡。

向日葵盤腐型菌核病分級標準[11]:0級,無癥狀;1級,花盤背面病斑占花盤總面積的比例為0～25%;2級,花盤背面病斑面積占花盤總面積的比例為26%～50%;3級,花盤背面病斑面積占花盤總面積的比例為51%～75%;4級,花盤背面病斑面積占花盤總面積的比例大于75%。

病株率(%)=發(fā)病株數(shù)/總株數(shù)×100;

病情指數(shù)=Σ(發(fā)病級代表值×各級病株數(shù))/(調(diào)查總株數(shù)×最高病級代表值)×100;

防治效果(%)=(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)×100。

1.7LIEH 92生理特性測定

1.7.1生長曲線測定

取100μL培養(yǎng)24h的LIEH92發(fā)酵液加入裝有10mLNB培養(yǎng)液(牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl5g,水1 000mL,pH7.0)的試管,置 28℃搖床中160r/min振蕩培養(yǎng),每隔4h取樣1次,24h后每隔12h取樣1次,至 96h結(jié)束,測定A600(以肉汁胨培養(yǎng)液為對照),并繪制生長曲線。

1.7.2最適pH測定

將NB培養(yǎng)液用1mol/LHCl和1mol/LNaOH分別調(diào)整pH至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0,取100μL培養(yǎng)24h的LIEH92發(fā)酵液加入裝有10mLNB培養(yǎng)液的試管,28℃ 160r/min恒溫振蕩培養(yǎng)48h,測定A600。

1.7.3耐鹽性測定

將NB培養(yǎng)液中NaCl濃度分別調(diào)至0、0.5%、1.5%、3%、5%、7%、9%、11%,取100μL培養(yǎng)24h的LIEH92發(fā)酵液加入裝有10mLNB培養(yǎng)液的試管,28℃振蕩培養(yǎng)48h,測定A600。

1.8LIEH 92產(chǎn)幾丁質(zhì)酶檢測

幾丁質(zhì)平板(膠體幾丁質(zhì)2.5g,K2HPO40.7g,KH2PO40.3g,MgSO4·7H2O0.5g,FeSO4·7H2O0.01g,瓊脂15g,蒸餾水1 000mL,pH7.0)中央放置5mm滅菌濾紙片,并在濾紙片上滴加10μL向日葵列當內(nèi)生細菌LIEH92發(fā)酵液(108cfu/mL),28℃培養(yǎng)3～7d,觀察接菌濾紙片周圍有無透明圈產(chǎn)生。

1.9向日葵列當內(nèi)生細菌LIEH 92定殖能力測定

1.9.1抗利福平(Rif)LIEH92突變菌株的篩選

取培養(yǎng)24h的LIEH92發(fā)酵液10mL接種在含5μg/mLRif的NB培養(yǎng)液中(裝液量100mL/250mL)。28℃,160r/min振蕩培養(yǎng)至NB培養(yǎng)液變混濁,吸取10mL接入Rif濃度為10μg/mL的100mLNB培養(yǎng)液中,以后每次更換的新鮮NB培養(yǎng)液中Rif的濃度均增加20μg/mL,直到標記至300μg/mL。然后用含300μg/mLRif的NA平板檢測并挑取能穩(wěn)定生長,且拮抗能力、菌落形態(tài)變化不大的突變菌株。采用平板對峙法檢測突變菌株對向日葵菌核病菌的拮抗能力。將突變菌株在不含Rif的NB培養(yǎng)液中連續(xù)培養(yǎng)10代,取適量涂布在含300μg/mLRif的NA固體培養(yǎng)基上觀察其是否能正常生長,以檢測突變菌株的遺傳穩(wěn)定性。選擇遺傳性穩(wěn)定、抗菌能力不變的抗利福平突變菌株用于定殖試驗。

1.9.2LIEH 92在向日葵根際土和植株體內(nèi)的定殖

抗利福平突變菌株菌懸液以灌根的方式施入。將‘星火’種子在50℃水中浸泡20min,期間不斷攪拌,然后降至室溫,用l%次氯酸鈉表面消毒10min,無菌水漂洗數(shù)次后播種至27.5cm×20cm的盆缽中。設(shè)置自然土(取自向日葵田)和滅菌土(121℃濕熱滅菌2h)2個處理。向日葵出苗后每盆留苗5株,每處理10盆。待向日葵苗長出第4葉時,往向日葵苗根部土壤注入108cfu/mL突變菌株菌懸液,每株10mL,同時以清水代替菌懸液灌根作為對照。從處理后第5天開始,每隔5d分離向日葵苗內(nèi)(根、莖和葉)和根際土的抗利福平突變標記菌,計算每克根、莖、葉和根際土中的標記菌含量。

根際土中抗利福平突變標記菌的分離采用稀釋涂平板法。土壤溶液經(jīng)梯度稀釋后,取10-4、10-5、10-6濃度的土壤稀釋液進行平板涂布。向日葵根、莖、葉內(nèi)標記菌株的分離,各稱取1g根、莖、葉組織,分別放入70%乙醇中浸泡1min,隨即浸入2%次氯酸鈉溶液中消毒3min,然后用70%乙醇處理30s,最后無菌水反復(fù)漂洗4次。分別將經(jīng)表面消毒的根、莖、葉置于研缽中,并加10mL無菌水進行研磨,研磨液靜置15min后,取100μL上清液涂抹于含300μg/mL利福平的NA平板上,置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)48h,檢測是否有待測菌生長,同時采用平板對峙法測定回收菌的抑菌效果。

1.10向日葵列當內(nèi)生細菌LIEH 92對向日葵植株防御酶系的誘導(dǎo)

將‘星火’種子表面消毒后播種于裝有滅菌土的27.5cm×20cm盆缽中。向日葵出苗后每盆留苗5株,每處理10盆。待向日葵苗長至4葉時,往向日葵苗根部土壤注入108cfu/mLLIEH92發(fā)酵液,每株10mL,對照用清水代替發(fā)酵液。從處理后第1天起,每隔2d隨機取植株葉片1次,直至13d,分別研磨后測定過氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和多酚氧化酶(PPO)活性[12-13]。

試驗設(shè)4個處理:處理1(清水灌根,未接核盤菌菌核,對照),處理2(土壤接種核盤菌菌核),處理3(細菌LIEH92發(fā)酵液灌根,未接核盤菌菌核),處理4(土壤接入核盤菌菌核,并用細菌LIEH92發(fā)酵液灌根)。

2　結(jié)果與分析

2.1向日葵列當內(nèi)生細菌LIEH 92對向日葵菌核病的防治效果

用內(nèi)生菌株LIEH92的發(fā)酵液處理向日葵植株,室內(nèi)盆栽和大田試驗均表明其菌核病的發(fā)病率和病情指數(shù)明顯低于清水對照,且低于藥劑對照(50%腐霉利1 500倍液和向日葵抗重茬菌劑)。菌株LIEH92對向日葵菌核病的室內(nèi)盆栽防效達73.35%(表1),對大田根腐型菌核病和盤腐型菌核病防效分別達53.48%和38.64%(表2)。LIEH92的室內(nèi)盆栽防效高于大田防效,對根腐型菌核病的防效大于盤腐型。

表1　內(nèi)生細菌LIEH 92對向日葵菌核病的室內(nèi)盆栽防效1)Table 1　Control efficacy of endophytic bacterium LIEH 92 against Sclerotinia sclerotiorum in pot experiments

1) 表中數(shù)據(jù)均為平均值±標準誤,同列數(shù)據(jù)后不同字母表示經(jīng)Duncan氏新復(fù)極差法檢驗在0.05水平差異顯著。下同。

Datainthetablearemeans±SE.Datafollowedbydifferentlettersinthesamecolumnaresignificantlydifferentatthe0.05levelbyDuncan′snewmultiplerangetest.Thesamebelow.

表2　內(nèi)生細菌LIEH 92對向日葵菌核病的大田防效Table 2　Control efficacy of endophytic bacteria LIEH 92 against Sclerotinia sclerotiorum in field plot experiments

2.2向日葵列當內(nèi)生細菌LIEH 92生理特性測定

從繪制的內(nèi)生細菌LIEH92生長曲線(圖1)可以看出,菌株LIEH92在發(fā)酵培養(yǎng)16h后進入對數(shù)生長期,菌液濃度迅速增加,24～48h菌株處于穩(wěn)定生長期,在36h菌液濃度達到最大值。48h后,菌株生長進入衰亡期。

菌株LIEH92在pH4～10的范圍內(nèi)均能生長,pH6～8時生長旺盛,期間菌液濃度達到最大值(圖2)。在pH<5 時菌體生長慢,菌液濃度低;當pH>8 時,菌體生長緩慢,菌液濃度開始下降。

LIEH92在NaCl濃度0～9%時均可生長。NaCl濃度在0～0.5%之間時菌體生長旺盛,鹽濃度在0.5%時菌體濃度達最大值(圖3)。當NaCl濃度大于0.5%時,隨著鹽濃度增加,菌體生長呈現(xiàn)下降趨勢。當NaCl濃度大于10%時,菌株生長基本停滯。

2.3向日葵列當內(nèi)生細菌LIEH 92產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的測定

將內(nèi)生菌株接于幾丁質(zhì)平板培養(yǎng)4d后,平板上出現(xiàn)了明顯的透明圈,說明菌株LIEH92能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。

圖1　內(nèi)生細菌LIEH 92生長曲線Fig.1　Growth curve of endophytic bacteria LIEH 92

圖2　內(nèi)生細菌LIEH 92生長適宜pH測定Fig.2　Optimized pH of endophytic bacteria LIEH92

圖3　內(nèi)生細菌LIEH 92耐鹽性測定Fig.3　Effects of the NaCl concentration on growth of endophytic bacteria LIEH 92

2.4向日葵列當內(nèi)生細菌LIEH 92的定殖能力

用108cfu/mL抗生素標記的內(nèi)生細菌LIEH92突變菌株菌懸液灌根處理向日葵苗5d后即可在根際土壤和植株體內(nèi)分離到標記的突變菌株,30d時仍能在向日葵根、莖部回收到突變菌株。而使用清水代替菌懸液處理的對照向日葵根際和體內(nèi)均未分離到標記的突變菌株,說明菌株LIEH92能在根際土壤和向日葵根、莖、葉內(nèi)定殖并傳導(dǎo)。

2.4.1LIEH 92在向日葵根際土的定殖

根際土中所測得的內(nèi)生菌LIEH92突變菌株菌量均小于其菌懸液濃度108cfu/mL,且25d前在滅菌土中該菌株的定殖菌量小于在自然土中的定殖菌量(圖4)。自然土中,LIEH92突變菌株定殖菌量在10d時達到最大,為10.33×106cfu/g,之后開始下降,20d后定殖菌量開始急劇下降。而在滅菌土中,LIEH92突變菌株定殖菌量在15d時達到最大,為9.17×106cfu/g,之后開始下降。這可能和土壤中微生物之間的相互作用有關(guān),滅菌土土壤結(jié)構(gòu)和微生物遭到破壞,可能不利于生防菌株定殖。

圖4　內(nèi)生細菌LIEH 92在向日葵根際土的定殖動態(tài)Fig.4　Colonization dynamics of endophytic bacteria LIEH 92 in rhizosphere soil of sunflower

2.4.2LIEH 92在向日葵體內(nèi)的定殖

無論是自然土還是滅菌土,內(nèi)生細菌LIEH92突變菌株在向日葵植株根內(nèi)的定殖數(shù)量最大,莖中次之,葉中最少,推測內(nèi)生細菌由植株根部進入體內(nèi),并從下向上進行傳導(dǎo)運輸。

整個檢測過程中,在滅菌土中LIEH92突變菌株在向日葵根部的定殖菌量均小于在自然土中向日葵根部的定殖菌量(圖5),這與根際土中的定殖菌量變化規(guī)律基本保持一致。在向日葵根部,自然土中LIEH92突變菌株定殖菌量在10d時達到最大,為1.76×105cfu/g,15d后定殖菌量開始急劇下降;而在滅菌土中,LIEH92突變菌株定殖菌量在15d時達到最大,為1.63×105cfu/g。推斷自然土中存在的某些微生物可能利于LIEH92突變菌株的定殖,這也反映了該菌株有較好的環(huán)境適應(yīng)能力。

圖5　內(nèi)生細菌LIEH 92在向日葵根部的定殖動態(tài)Fig.5　Colonization dynamics of endophytic bacteria LIEH 92 in sunflower roots

當LIEH92突變菌株進入植株根部后,受外界因素的干擾變小,出現(xiàn)了在滅菌土中向日葵莖部、葉部LIEH92的定殖菌量大于在自然土中定殖菌量的現(xiàn)象。在向日葵莖部,自然土中LIEH92突變菌株定殖菌量在20d時達到最大,為2.33×104cfu/g;而在滅菌土中,LIEH92突變菌株定殖菌量在15d時達到最大,為2.55×104cfu/g(圖6)。在向日葵葉部,自然土和滅菌土中LIEH92定殖菌量均在15d時達到最大,分別為2.83×103cfu/g和3.44×103cfu/g(圖7)。

圖6　內(nèi)生細菌LIEH 92在向日葵莖部的定殖動態(tài)Fig.6　Colonization dynamics of endophytic bacteria LIEH 92 in sunflower stems

圖7　內(nèi)生細菌LIEH 92在向日葵葉部的定殖動態(tài)Fig.7 Colonization dynamics of endophytic bacteria LIEH 92 in sunflower leaves

2.5向日葵列當內(nèi)生細菌LIEH 92對向日葵植株防御酶系的誘導(dǎo)

清水灌根對照各防御酶活性變化不大。僅用內(nèi)生菌LIEH92發(fā)酵液灌根的向日葵植株葉片中PAL、POD和PPO活性均高于清水對照,PAL和PPO活性峰均出現(xiàn)在處理后第7天,而POD則在處理后第5天、第9天出現(xiàn)了2次活性峰。僅接核盤菌時,向日葵葉片PAL、POD和PPO各活性峰分別出現(xiàn)在第5、9和5天。

接核盤菌的同時用菌株LIEH92發(fā)酵液灌根后,從第1天開始各防御酶的活性便持續(xù)快速增加,PAL、POD和PPO活性峰分別出現(xiàn)在第5、7和 9天,其中POD活性峰出現(xiàn)時間比僅接核盤菌時提前了2d。除第9天單獨施用菌株LIEH92發(fā)酵液的向日葵植株葉片中POD活性略高外,其余情況下,既接種核盤菌又使用菌株LIEH92發(fā)酵液灌根的處理向日葵葉片PAL、POD和PPO各防御酶活性均高于其他3種處理(圖8～10)。說明在核盤菌和菌株LIEH92的共同作用下,向日葵葉片各防御酶活性顯著升高,迅速激活向日葵植株體內(nèi)防御酶系,提高向日葵的抗病性。

圖8　內(nèi)生細菌LIEH 92和核盤菌處理對 向日葵PAL酶活性的影響Fig.8　Impact of endophytic bacteria LIEH 92 and Sclerotinia sclerotiorum on sunflower PAL enzyme activity

圖9　內(nèi)生細菌LIEH 92和核盤菌處理對 向日葵POD酶活性的影響Fig.9　Impact of endophytic bacteria LIEH 92 and Sclerotinia sclerotiorum on sunflower POD enzyme activity

圖10　內(nèi)生細菌LIEH 92和核盤菌處理對 向日葵PPO酶活性的影響Fig.10　Impact of endophytic bacteria LIEH 92 and Sclerotinia sclerotiorum on sunflower PPO enzyme activity

3　討論

由于拮抗細菌在田間應(yīng)用時可能受到外界復(fù)雜環(huán)境因素(溫度、濕度等)、土壤性狀、微生物間相互作用的影響,因此本研究利用向日葵列當內(nèi)生細菌LIEH92進行向日葵菌核病防治試驗時,室內(nèi)盆栽防效高于大田。根腐型菌核病在向日葵整個生育期內(nèi)均可發(fā)生,而盤腐型菌核病通常在向日葵開花末期開始出現(xiàn)。而本試驗僅在播種時、播種后10d和25d用細菌LIEH92發(fā)酵液灌根,結(jié)果表明該菌株對大田根腐型菌核病防效大于盤腐型。盤腐型菌核病發(fā)生時,菌株LIEH92的防效較低。說明隨施用時間延長,該生防菌株的作用逐漸減弱,應(yīng)該增加施藥次數(shù)來提高防效。

病原真菌細胞壁主要成分為幾丁質(zhì),向日葵列當內(nèi)生黏質(zhì)沙雷氏菌LIEH92可分泌幾丁質(zhì)酶來水解向日葵菌核病菌的細胞壁,從而抑制核盤菌生長。

抗生素標記是研究細菌定殖最常用的方法。本研究利用抗生素利福平來標記內(nèi)生菌株LIEH92,獲得突變菌株,采用灌根法分別在滅菌土和自然田土的盆栽中接種,結(jié)果表明菌株LIEH92在向日葵體內(nèi)和土壤中均能成功定殖。到第30天時,LIEH92突變菌株在向日葵根、莖、葉中的定殖量仍保持較高水平,葉中最低也達102cfu/g。同時30d時,其在土壤中的定殖量達106cfu/g,說明菌株LIEH92能適應(yīng)向日葵體內(nèi)外的生態(tài)環(huán)境,應(yīng)用潛力較大。

當受到病原物侵染或其他誘導(dǎo)因子作用時,植物體內(nèi)與抗病性相關(guān)的防御酶(苯丙氨酸氨解酶PAL、過氧化物酶POD、多酚氧化酶PPO等)會發(fā)生變化,從而提高自身的免疫力[14]。PAL是該代謝途徑中的關(guān)鍵酶和限速酶,能催化L-苯丙氨酸形成反式肉桂酸,控制植物體內(nèi)多種次生酚類化合物(類黃酮、酚類物質(zhì)、木質(zhì)素、植保素、花青素等)的合成。POD是一類氧化還原酶,能催化脂肪族、芳香族和酚類物質(zhì)的氧化,水解細胞毒性物質(zhì)過氧化氫,參與木質(zhì)素的沉積。PPO參與酚的氧化和木質(zhì)素的合成,可將細胞代謝產(chǎn)物中的酚類物質(zhì)氧化為醌類來殺死細胞,或使細胞壁增厚以抵御病菌的入侵和擴展。

許英俊等[15]報道，鏈霉菌屬的3株放線菌對草莓有促生作用,且能夠提高草莓根系PPO活性,對增強抵抗草莓根系根區(qū)病原菌侵染有一定效果。陳劉軍等[16]報道蠟質(zhì)芽胞桿菌AR156可提高水稻植株SOD、PAL、POD和CAT等防御酶活性,用菌株AR156預(yù)處理水稻植株后接種立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)HNW-21,其SOD和PAL分別提前 4d和2d出現(xiàn)活性峰,誘導(dǎo)水稻對紋枯病的抗性。Lavania等[17]研究表明黏質(zhì)沙雷氏菌NBRI1213可誘導(dǎo)PAL、POD、PPO等防御酶活性來提高植物抗煙草疫霉菌(Phytophthora nicotianae)所引起根腐病的能力,且促生增產(chǎn)作用明顯。Press等[18]報道黏質(zhì)沙雷氏菌能誘導(dǎo)黃瓜和煙草產(chǎn)生抗性而抵御多種真菌、細菌及病毒的侵染。本研究中內(nèi)生細菌LIEH92對向日葵的防御酶系具有誘導(dǎo)作用,能提高植株自身的免疫力。

內(nèi)生細菌的作用機制主要包括兩方面,一是對病原菌的直接抑制,如產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶(溶解病原真菌的細胞壁)、纖維素酶、淀粉水解酶、蛋白酶、嗜鐵素(螯合鐵離子),固氮作用,產(chǎn)生抗生素、合成ACC-脫氫酶、吲哚-3-乙酸(IAA)及鐵載體等;另一方面是增強寄主植物自身的抗性,如激發(fā)誘導(dǎo)抗性、分泌促生物質(zhì)等。

綜合各方面研究,向日葵列當內(nèi)生黏質(zhì)沙雷氏菌LIEH92防治向日葵菌核病的作用機制包括產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、在向日葵體內(nèi)定殖、誘導(dǎo)向日葵植株的防御酶系等,菌株LIEH92的抑菌作用可能是這些機制共同作用的結(jié)果。生產(chǎn)上要將內(nèi)生細菌LIEH92真正用于向日葵菌核病的生物防治,還需進行該菌株活性物質(zhì)的提取與鑒別、發(fā)酵工藝、制劑研發(fā)、應(yīng)用方式等方面的深入研究。

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(責任編輯：楊明麗)

Control effect of antagonistic endophyticSerratiamarcescensLIEH 92 on sunflower sclerotinia rot and its antifungal mechanism

Wang Jing,Su Zhifang,Li Yazhen,Wang Haiwei,Zheng Xiqing,Di Na

(Department of Agronomy, Hetao College, Bayannur015000, China)

SerratiamarcescensLIEH 92 was obtained fromOrobanchecumana. The control efficacy of LIEH 92 against sunflower sclerotinia rot were evaluated in pot experiments and field plot experiments. The physiological characteristics of LIEH 92 and its colonization in rhizosphere soil and sunflower plants were determined. The results showed that the control efficacy of fermented liquid from LIEH 92 against sunflower sclerotinia rot was 73.35% in pot experiments, 53.48% for sunflower sclerotinia root rot and 38.64% for sunflower sclerotinia head rot in field plot experiments. The chitinase-producing by LIEH 92 could colonize and transmit in rhizosphere soil and roots, stems, leaves of sunflowers. The quantity of LIEH 92 reached 102-106cfu/g, and the most was observed in roots, followed by stems and leaves. The colonizing bacterial quantity of strain LIEH 92 from rhizosphere soil and roots in sterile soil was lower than that in natural soil, while the colonizing bacterial quantity from stems and leaves in sterile soil was higher than that in natural soil. Strain LIEH 92 increased the activities of defensive enzymes PAL, POD and PPO in sunflowers, and the resistance of the plants toSclerotiniasclerotiorumwas induced. LIEH 92 has great potential for bio-controlling sunflower sclerotinia rot.

Sclerotiniasclerotiorumof sunflower;Serratiamarcescens;control efficacy;colonization dynamics;defense enzyme activity

2014-12-22

2015-02-02

內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學?？茖W技術(shù)研究一般項目(NJZY12277)；河套學院引進人才科研啟動項目(HYRC2014001)；河套學院科學技術(shù)研究自然科學重點項目(HTXYZZ13001)

E-mail：304081257@qq.com

S 435.655

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.01.013