向日葵菌核病接種方法及品種抗病性鑒定

劉　佳,　張勻華,　孟慶林,　石鳳梅,　馬立功,　李易初,　劉　宇

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,哈爾濱　150086)

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向日葵菌核病接種方法及品種抗病性鑒定

劉佳,張勻華*,孟慶林,石鳳梅,馬立功,李易初,劉宇

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,哈爾濱150086)

為建立有效的向日葵菌核病田間接種鑒定方法,以核盤菌菌絲體懸浮液和孢子懸浮液作為接種物,分別對(duì)抗、感向日葵品種在現(xiàn)蕾期、始花期和盛花期進(jìn)行人工接種,并對(duì)接種后保濕材料和保濕時(shí)間進(jìn)行比較。試驗(yàn)結(jié)果表明: 兩種接種物均可使向日葵抗、感品種產(chǎn)生盤腐癥狀。用菌絲體懸浮液和孢子懸浮液接種時(shí),濃度分別為10.0～15.0 g/L 和200～500個(gè)/mL,始花期接種,牛皮紙袋保濕2～4 d,即可區(qū)分出向日葵品種間抗感性差異。用此方法鑒定出13個(gè)對(duì)盤腐型菌核病表現(xiàn)抗病的向日葵品種。

向日葵核盤菌;接種方法;抗病性鑒定

由核盤菌 (Sclerotiniasclerotiorum) 侵染引起的向日葵菌核病是黑龍江省向日葵生產(chǎn)上危害最重的病害之一,對(duì)向日葵產(chǎn)量和品質(zhì)造成很大的影響。近年來(lái),隨著我省向日葵播種面積不斷增加,重、迎茬以及與核盤菌其他寄主(大豆)套種,菌核病的發(fā)生日趨加重。據(jù)記載,黑龍江省1995-1997年菌核病平均發(fā)病率在40%～70%,迎茬、重茬地絕產(chǎn)[1]。2009-2014年連續(xù)6年對(duì)黑龍江省向日葵產(chǎn)區(qū)菌核病的實(shí)地調(diào)查結(jié)果顯示，菌核病的年平均發(fā)病率在30%～50%,有些地塊發(fā)病率達(dá)到80%以上。因此,菌核病已成為制約黑龍江省向日葵產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要障礙[2]。目前對(duì)此病害的防治尚沒有行之有效的辦法,國(guó)內(nèi)外學(xué)者在藥劑防治和抗病育種方面雖取得一定進(jìn)展,但收效不大[3]。由于核盤菌寄主范圍廣,子囊孢子可通過(guò)風(fēng)力傳播,整個(gè)生育期均能侵染,因此防治時(shí)期難以掌握[4]。生物防治尚處于試驗(yàn)階段,個(gè)別田間小面積試驗(yàn)效果雖好,但尚未作為一種防治措施推廣。因此,選育并合理利用抗病品種是控制向日葵菌核病經(jīng)濟(jì)、安全、有效的方法[5-8]。但是,生產(chǎn)上缺少良好的抗源育種材料,對(duì)抗病品種的篩選也沒有統(tǒng)一簡(jiǎn)便的方法。本研究旨在通過(guò)田間試驗(yàn),建立一種簡(jiǎn)便易行的向日葵盤腐型菌核病接種鑒定方法,為抗病育種工作及抗性品種資源的篩選提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試品種:‘豐葵雜1號(hào)’(抗病),‘7101’(感病),以及用于抗病篩選的75個(gè)向日葵品種,共計(jì)77個(gè)品種,由國(guó)家向日葵產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系病蟲害研究室統(tǒng)一提供。

供試菌株:向日葵核盤菌采自田間自然發(fā)病花盤上的菌核,經(jīng)分離純化獲得混合菌種。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,水1 000 mL,121 ℃濕熱滅菌30 min[9]。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1接種物的制備

(1)PDA菌絲體懸浮液:在直徑為9 cm 的培養(yǎng)皿內(nèi)鋪入15 g PDA培養(yǎng)基,接種向日葵核盤菌,25 ℃條件下培養(yǎng) 14 d,置于4 ℃?zhèn)溆?。去除菌核?將 PDA 菌餅粉碎,每皿按15 g 計(jì)算,加入滅菌水配制成菌絲體懸浮液。

(2)孢子懸浮液:將向日葵菌核用4%次氯酸鈣表面消毒10 min,無(wú)菌水沖洗3次,埋入濕的滅菌沙中[10],置于4 ℃冰箱中保存,7周后取出洗凈并表面消毒,無(wú)菌水沖洗,置于發(fā)芽盒中的沙層上保濕培養(yǎng)。待菌核產(chǎn)盤后,用小吸塵器收集子囊孢子。將收集的子囊孢子用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并稀釋成所需濃度的孢子懸浮液。

1.2.2接種量試驗(yàn)

(1)PDA 菌絲體接種:將菌絲體懸浮液(10.0、15.0、20.0和25.0 g/L)均勻噴灑在向日葵花盤正面,每花盤定量5 mL,始花期每處理接種10個(gè)花盤,3次重復(fù)。然后用牛皮紙袋套住花盤。4周后揭開紙袋進(jìn)行病害調(diào)查。

(2)孢子懸浮液接種:將孢子懸浮液(200、500、1 000和2 000個(gè)/mL)均勻噴灑在花盤正面,每花盤定量5 mL,始花期每處理接種10個(gè)花盤,3 次重復(fù)。然后用牛皮紙袋套住花盤。4 周后揭開紙袋進(jìn)行病害調(diào)查。

1.2.3保濕材料及保濕時(shí)間試驗(yàn)

分別將PDA 菌絲體懸浮液(15.0 g/L)和孢子懸浮液(1 000個(gè)/mL)。均勻噴灑在花盤正面,始花期接種,每花盤定量5 mL,每處理接種 10 個(gè)花盤,3次重復(fù),設(shè)置接種后用牛皮紙袋保濕2、4 d;接種后用黑塑料袋保濕2、4 d;接種后不罩袋5個(gè)處理,以不接種不罩袋為對(duì)照,接種4周后調(diào)查記錄每花盤的病情級(jí)別,計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)。

1.2.4接種時(shí)期試驗(yàn)

分別在向日葵現(xiàn)蕾期(R-4)、始花期(初期R-5.1、中期R-5.5、末期R-5.9)、盛花期(R-6)采用 PDA菌絲體懸浮液(15.0 g/L)和孢子懸浮液(1 000個(gè)/mL)進(jìn)行接種,均勻噴灑在花盤正面,每花盤定量5 mL,以噴5 mL清水為對(duì)照,每處理接種10個(gè)花盤,3次重復(fù)。接種后用牛皮紙袋套住花盤。4 周后揭開紙袋進(jìn)行病害調(diào)查。

1.2.5向日葵不同品種對(duì)盤腐型菌核病的抗性鑒定

根據(jù)上述接種方法試驗(yàn)篩選結(jié)果,對(duì)供試的75個(gè)向日葵品種采用濃度為15.0 g/L的PDA菌絲體懸浮液于始花期進(jìn)行接種,每品種接10個(gè)花盤,均勻噴灑在花盤正面,每花盤定量5 mL。接種后用牛皮紙袋套住花盤。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組排列,小區(qū)7 m×1.4 m(2壟),3 次重復(fù),每小區(qū)種植一個(gè)向日葵品種。壟距 70 cm,壟上埯播,株距50 cm。在接種4周后揭開紙袋進(jìn)行病害調(diào)查。

1.2.6病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

0 級(jí): 無(wú)癥狀; 1 級(jí): 病斑占花盤面積<25%; 2級(jí): 25%≤病斑占花盤面積<50%; 3 級(jí): 50%≤病斑占花盤面積<75%; 4 級(jí): 病斑占花盤面積≥75%。向日葵品種的抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn): 抗: 病情指數(shù)<10; 中抗: 10≤病情指數(shù)<30; 中感: 30≤病情指數(shù)<50; 感: 50≤病情指數(shù)<75; 高感: 病情指數(shù)≥75[11]。

病情指數(shù)=∑(各級(jí)別花盤數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)值)/(調(diào)查總花盤數(shù)×最高病級(jí))×100;

發(fā)病率(%)=發(fā)病花盤數(shù)/處理總花盤數(shù)×100。

2　結(jié)果與分析

2.1不同接種量對(duì)向日葵菌核病發(fā)病的影響

不同濃度菌絲體懸浮液接種試驗(yàn)結(jié)果(表1)表明,隨著接種濃度的增加,抗病品種‘豐葵雜1號(hào)’菌核病發(fā)病率及病情指數(shù)均增高,接種濃度為20 g/L和25 g/L的病情指數(shù)和發(fā)病率顯著高于接種濃度10 g/L和15 g/L的兩個(gè)處理;感病品種在各處理濃度下發(fā)病率和病情指數(shù)都比較高,發(fā)病率均為100%,病情指數(shù)為89.2～100,各處理之間發(fā)病率和病情指數(shù)差異不顯著;接種處理的抗、感品種發(fā)病率與病情指數(shù)均顯著高于對(duì)照。

不同濃度孢子懸浮液接種試驗(yàn)結(jié)果(表1)表明,感病品種接種孢子液濃度為200個(gè)/mL的發(fā)病率為93.3%,其他處理發(fā)病率均達(dá)100%,病情指數(shù)為 70.8～100, 抗病品種的發(fā)病率為10%～33.3%,病情指數(shù)為3.3～20.8;抗病品種接種孢子懸浮液濃度為500、1000、2000個(gè)/mL 3個(gè)處理的病情指數(shù)和發(fā)病率差異不顯著;感病品種接種濃度為1 000、2 000個(gè)/mL的處理與200個(gè)/mL處理間病情指數(shù)差異顯著,但與500個(gè)/mL處理差異不顯著。接種處理的抗、感品種發(fā)病率與病情指數(shù)均顯著高于對(duì)照。綜上，用菌絲體懸浮液和孢子懸浮液接種時(shí),接種濃度分別為10.0～15.0 g/L和200～500個(gè)/mL時(shí)可較好地區(qū)分出品種間的抗病性。

表1　接種量對(duì)向日葵抗感品種菌核病發(fā)病的影響1)Table 1　Effects of inoculation amounts on the occurrence of Sclerotinia sclerotiorum on resistant and susceptible sunflower varieties

1) 表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。同一品種后不同大寫字母表示在0.01水平差異顯著。下同。

Data in the table are mean±SD. Data of same variety followed by different capital letters in the same column are significantly different at 0.01 level. The same below.

2.2不同保濕材質(zhì)及保濕時(shí)間對(duì)向日葵菌核病發(fā)病的影響

菌絲體懸浮液接種試驗(yàn)結(jié)果(表2)表明,感病品種‘7101’罩袋保濕處理的發(fā)病率基本上均達(dá)100%,病情指數(shù)高于70,保濕2 d即可達(dá)到有效發(fā)病。統(tǒng)計(jì)分析表明,袋的材質(zhì)及保濕時(shí)間對(duì)發(fā)病影響差異不顯著;保濕處理的發(fā)病率均顯著高于不保濕處理;抗病品種‘豐葵雜1號(hào)’保濕2 d和4 d的發(fā)病率差異不顯著。牛皮紙袋處理的發(fā)病率顯著高于未罩袋和黑塑料袋處理。

孢子懸浮液接種試驗(yàn)結(jié)果表明,感病品種‘7101’罩袋保濕處理的發(fā)病率均達(dá)100%,病情指數(shù)高于70,保濕時(shí)間2 d即可達(dá)到有效發(fā)病。統(tǒng)計(jì)分析表明,袋的材質(zhì)及保濕時(shí)間對(duì)發(fā)病影響差異不顯著;保濕處理顯著高于不保濕處理;抗病品種‘豐葵雜1號(hào)’保濕2 d和4 d的發(fā)病率差異不顯著。牛皮紙袋處理的發(fā)病率顯著高于未罩袋處理,但與黑塑料袋處理差異不顯著(表2)。

2.3不同接種時(shí)期對(duì)向日葵菌核病發(fā)病的影響

兩種接種物在3個(gè)時(shí)期接種均能使向日葵發(fā)病,其中在現(xiàn)蕾期接種,抗病品種和感病品種的發(fā)病率和病情指數(shù)均最低,在盛花期菌絲體接種和孢子懸浮液接種后抗病品種病情指數(shù)為3.3和6.7,發(fā)病率為 6.7%和10%;感病品種病情指數(shù)分別為17.6和22.5,發(fā)病率分別為23.3%和30.0%;而在始花期接種的抗感品種菌核病發(fā)病率和病情指數(shù)均最高,抗病品種在始花期接種的病情指數(shù)為4.8～17.6,發(fā)病率13.8%～26.7%;感病品種在始花期接種的病情指數(shù)為83.3～93.3,發(fā)病率90%～100%;應(yīng)用 DPS 數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,抗感品種在始花期接種的發(fā)病程度均顯著高于現(xiàn)蕾期和盛花期,而在始花期3個(gè)階段(始花初期、始花中期、始花末期)接種的向日葵其病情指數(shù)差異不顯著(表3)。

2.4向日葵品種對(duì)盤腐型菌核病的抗病性鑒定

75個(gè)參試品種中對(duì)盤腐表現(xiàn)抗性的有13份,包括‘赤CY101’、‘57151*52284’、‘龍葵雜4號(hào)’、‘新食葵9號(hào)’、‘赤葵2號(hào)’、‘赤葵3009’、‘NKY03-4’、‘科陽(yáng)1號(hào)’、‘龍食葵3號(hào)’、‘龍食葵2號(hào)’、‘JK518’、‘JK578’、‘JK108(BC11-2)’; 中抗的21份,有‘赤葵3006’、‘新葵22號(hào)’、‘赤CY102’、‘龍葵雜7號(hào)’、‘LS06-9’、‘YS14A*Z08-34’、‘油A6’、‘油A5’、‘S31’、‘S18’、‘MSG’、‘遼豐F53’、‘NKY03-1’、‘NKY03-3’、‘NKY03-7’、‘NKY03-8’、‘LSK15’、‘巴葵138’、‘油食2’、‘寧食葵1號(hào)’、‘NK03-2’;中感的13份,感病的16份,高感的12份(表4)。

表2　保濕材質(zhì)及保濕時(shí)間對(duì)向日葵菌核病發(fā)病的影響Table 2　Effects of moisturizing materials and moisture time on the occurrence of Sclerotinia sclerotiorum on resistant and susceptible sunflower varieties

表3　接種時(shí)期對(duì)向日葵菌核病發(fā)病的影響Table 3　Effects of inoculation time on the occurrence of Sclerotinia sclerotiorum on resistant and susceptible sunflower varieties

表4　向日葵不同品種抗菌核病(盤腐)接種鑒定結(jié)果Table 4　Resistance of different sunflower varieties to Sclerotinia sclerotiorum in field experiments

3　結(jié)論與討論

向日葵菌核病可發(fā)生在向日葵生長(zhǎng)發(fā)育的任何階段,其表現(xiàn)類型多樣, 遺傳機(jī)制復(fù)雜,且環(huán)境條件對(duì)向日葵的抗病性有較大的影響,目前尚沒有一種單一高效的抗病鑒定方法[12-13]。劉學(xué)敏等[14]采用純培養(yǎng)菌絲塊、向日葵立枯型菌絲和子囊孢子等材料及傷口和非傷口方法接種,對(duì)向日葵菌核病菌的田間接種材料和接種方法進(jìn)行了試驗(yàn)。結(jié)果表明:用感染立枯型菌核病菌的莖稈制成菌絲簽接種效果最佳,子囊孢子接種效果最差。杜娟等[15]以采自新疆6種不同作物上的核盤菌作為供試菌株,對(duì)植株苗期抗病性鑒定方法進(jìn)行篩選,結(jié)果顯示:菌絲塊貼接法和草酸澆灌法都能用于抗性植株的篩選,且30 mol/L草酸澆灌法可作為苗期鑒定抗病性的一種快速簡(jiǎn)便的方法。孟慶林等[16]以菌核病菌菌絲體懸浮液和高粱粒菌絲體作為接種物,分別對(duì)不同抗感向日葵品種在始花期和盛花期進(jìn)行人工接種,從而篩選出最佳接菌物類型、濃度及接種時(shí)期,試驗(yàn)結(jié)果表明:兩種接種物均可使向日葵感病品種產(chǎn)生盤腐癥狀。始花期接種較盛花期可獲得更高的發(fā)病率及病情指數(shù)。本研究結(jié)果表明:采用菌絲體懸浮液與孢子懸浮液接種均可使向日葵發(fā)生盤腐癥狀,菌絲體懸浮液濃度在10～15 g/L之間接種效果較好,孢子懸浮液濃度在200～500個(gè)/mL之間接種效果較好;菌絲體懸浮液接種的優(yōu)點(diǎn)在于菌株容易培養(yǎng),獲取方便,缺點(diǎn)是定量困難,菌量誤差較大,而孢子懸浮液接種可精確定量,減少試驗(yàn)誤差,但孢子收集較為困難,且收集的孢子難以保存。對(duì)于盤腐的抗性鑒定接種時(shí)期應(yīng)選擇始花期接種,接種后牛皮紙袋保濕2～4 d即可,試驗(yàn)中用牛皮紙袋套住花盤 4 周,是為了排除田間自然致病菌對(duì)本試驗(yàn)的干擾。用此方法鑒定了75個(gè)向日葵品種,篩選出13個(gè)抗性的品種。本研究所建立的田間接種方法能夠有效地對(duì)向日葵進(jìn)行抗菌核病篩選和鑒定。本試驗(yàn)是在不破壞寄主組織并接近田間自然條件下篩選出的抗性材料,對(duì)抗病育種更有實(shí)際意義。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Inoculation methods ofSclerotiniasclerotiorumon sunflower heads and identification of variety resistance

Liu Jia,Zhang Yunhua,Meng Qinglin,Shi Fengmei,Ma Ligong,Li Yichu,Liu Yu

(Institute of Plant Protection, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin150086, China)

In order to establish the effective field inoculation method ofSclerotiniadisease, theS.sclerotiorummycelia suspension and spore suspension were used as the inoculums to inoculate the resistant and susceptible varieties of sunflowers, respectively, during the squaring period, early flowering season and full-bloom period. Effects of moisture material and moisture retention time on occurence ofS.sclerotiorumwere also compared. The results showed that both inoculation methods could make infection of both resistant and susceptible varieties of sunflowers byS.sclerotiorum. Inoculated with the mycelium suspension and spore suspension at the concentrations of 10.0-15.0 g/L or 200-500 spore/mL during the early flowering period with kraft paper moisture for 2-4 d, the difference between the resistant and susceptible varieties of sunflowers could be differentiated immediately. With this identification method, 13 sunflower varieties were identified to be resistant to the sclerotinia rot.

Sclerotiniasclerotiorum;inoculation method;identification of disease resistance

2015-03-09

2015-04-27

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(向日葵)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-16)

E-mail:yhzhang9603@126.com

S 435.655

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.02.024