實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)瓜炭疽病菌

王　翀,　張小菊,　張祥林,　張　偉,張　瑜,　李亞偉,　孫燕飛

(1. 新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局,烏魯木齊　830063; 2. 石河子大學(xué),石河子　832000)

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實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)瓜炭疽病菌

王翀1,張小菊1,張祥林1,張偉1,張瑜1,李亞偉1,孫燕飛2*

(1. 新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局,烏魯木齊830063; 2. 石河子大學(xué),石河子832000)

采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)建立了瓜炭疽病菌(Colletotrichumorbiculare)的檢測(cè)方法。根據(jù)瓜炭疽病菌甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因和谷氨酰胺合成酶(GS)基因序列,設(shè)計(jì)了該病菌特異性引物和TaqMan探針,并對(duì)所設(shè)計(jì)的引物和探針的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。采用本試驗(yàn)建立的實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)瓜上的其他菌株及近似菌株進(jìn)行檢測(cè),可將瓜炭疽病菌與其他病原菌區(qū)分開(kāi)。靈敏度試驗(yàn)表明,25 μL體系中只要有39.6 pg的核酸量就可以被檢測(cè)到,檢測(cè)靈敏度達(dá)到1.584 pg/μL,比普通PCR檢測(cè)靈敏度高100倍。同時(shí)對(duì)田間采集的病株和未知樣品進(jìn)行的檢測(cè)證明了引物和TaqMan探針的特異性。

實(shí)時(shí)熒光PCR;檢測(cè);瓜炭疽病菌

瓜炭疽病是瓜類作物上的重要病害,其病原菌為Colletotrichumorbiculare。該病危害嚴(yán)重,在貯運(yùn)期間可通過(guò)染病瓜繼續(xù)蔓延,造成西瓜和甜瓜采后腐爛變質(zhì),產(chǎn)量和品質(zhì)下降[1-2]。據(jù)報(bào)道,1978-1992年新疆塔城地區(qū)一般年份瓜炭疽病發(fā)病率都在20%以上,嚴(yán)重年份達(dá)100%,損失慘重。1990年在塔城地區(qū)的打瓜田因該病導(dǎo)致植株全部死亡,一無(wú)所收[3]。建立對(duì)瓜炭疽病菌的快速檢測(cè)技術(shù)對(duì)于瓜炭疽病的早期防治具有非常重要的意義。國(guó)內(nèi)外對(duì)瓜炭疽病菌的研究,主要集中在危害癥狀、病原菌生物學(xué)特性及生物防治方面,檢驗(yàn)方法主要是常規(guī)種子帶菌檢驗(yàn)。唐建輝等根據(jù)Colletotrichum屬24個(gè)種的ITS序列,利用RAPD和SCAR標(biāo)記,設(shè)計(jì)篩選出2對(duì)引物組成雙重PCR,能特異性鑒定出C.orbiculare[4]。目前國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道有關(guān)檢測(cè)該病菌的實(shí)時(shí)熒光PCR特異性引物和探針。本文依據(jù)瓜炭疽病菌GAPDH基因和GS基因序列,設(shè)計(jì)了2對(duì)特異性引物和2條TaqMan探針,建立了瓜炭疽病菌的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法,旨在實(shí)現(xiàn)瓜炭疽病菌的快速分子檢測(cè)。

1　材料與方法

1.1供試材料

表1所列的供試菌株用于本試驗(yàn)設(shè)計(jì)引物及探針的特異性檢測(cè),表2所列的西瓜病果、病葉、西甜瓜出口用種子及實(shí)驗(yàn)室自制帶菌種子為本研究建立的熒光PCR體系的待檢樣品。

帶菌種子制備:取50 g干凈的西瓜種子放入三角瓶中,經(jīng)高壓滅菌后,將PDA培養(yǎng)的瓜炭疽病菌菌塊放到瓶中,加入100 mL PDB,置于25 ℃培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)5～6 d,將該種子和另一份滅菌的西瓜種子按照1∶5的比例混合制成帶菌種子樣品。

1.2主要儀器及試劑

主要儀器包括:Hitachi高速離心機(jī),ND1000核酸檢測(cè)儀,TY-C型多功能電泳儀,通用凝膠成像系統(tǒng)(Intas Gel Jet Imager),Eppendorf多重控溫?zé)晒釶CR儀,7300 Real-Time PCR System (美國(guó)ABI公司)。所用PCR試劑購(gòu)于大連寶生物公司、核酸提取試劑盒等均購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司;引物和探針均由鼎國(guó)生物工程公司合成。

1.3病原菌培養(yǎng)和處理

供試菌株在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)2～3 d,取菌落邊緣處菌絲接到PDB中振蕩培養(yǎng)3～4 d,收集菌絲,用Miracloth膜過(guò)濾,用無(wú)菌水洗滌后待水分揮發(fā)干,用液氮研磨成粉狀,待用。

1.4DNA提取

利用北京天根生化科技有限公司新型植物基因組DNA提取試劑盒(DP305-03)提取病菌總DNA和植株、種子基因組DNA。

1.5TaqMan引物和探針設(shè)計(jì)

從GenBank查詢所有瓜炭疽病菌的相關(guān)序列,經(jīng)過(guò)大量的網(wǎng)上BLAST比對(duì)和聚類分析,發(fā)現(xiàn)無(wú)法僅僅通過(guò)一個(gè)基因把瓜炭疽病菌和其他近似病原菌區(qū)別開(kāi),但是通過(guò)GAPDH和GS基因聯(lián)合檢測(cè),能夠把瓜炭疽病菌與其他炭疽菌近似菌株及瓜上其他病原菌完全區(qū)別開(kāi),所以本研究針對(duì)這2個(gè)功能基因設(shè)計(jì)2對(duì)引物和2條探針進(jìn)行檢測(cè)。

1.6實(shí)時(shí)熒光PCR及反應(yīng)體系參數(shù)的優(yōu)化

使用編號(hào)ATCC14724的瓜炭疽病菌菌株DNA對(duì)擴(kuò)增GAPDH和GS基因的關(guān)鍵性參數(shù)退火溫度和Mg2+濃度進(jìn)行優(yōu)化。

退火溫度優(yōu)化采用25 μL反應(yīng)體系:10×buffer 2.5 μL,25 mmol/L Mg2+2 μL, 2.5 mmol/L dNTPs 0.5 μL,5 U/μLTaqMan聚合酶0.2 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,TaqMan探針(10 μmol/L) 0.5 μL,模板DNA 0.5～2 μL,用滅菌水補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s,設(shè)定退火溫度(55.2, 55.4, 56, 56.8, 57.9, 59.1, 60.4, 61.4, 62.6, 63.5, 64, 64.1 ℃)下1 min,40個(gè)循環(huán)。退火溫度的優(yōu)化在Eppendorf熒光PCR儀上完成。

在確定最佳退火溫度后進(jìn)行Mg2+濃度優(yōu)化,濃度優(yōu)化采用7300 Real-Time PCR System,Mg2+濃度設(shè)置為0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 mmol/L,共8個(gè)不同濃度處理。反應(yīng)體系中其他成分用量同退火溫度優(yōu)化體系。

1.7靈敏度檢測(cè)

以編號(hào)ATCC14724的瓜炭疽病菌菌株DNA為模板,確定該方法所能檢測(cè)的最低核酸量,起始DNA濃度為19.8 ng/μL,按10倍梯度依次稀釋為:1.98 ng/μL、198 pg/μL、19.8 pg/μL、1.98 pg/μL、198 fg/μL、19.8 fg/μL、1.98 fg/μL,加樣量均為2 μL,對(duì)應(yīng)的核酸量為:39.6 ng、3.96 ng、396 pg、39.6 pg、3.96 pg、396 fg、39.6 fg、3.96 fg,采用實(shí)時(shí)熒光PCR進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)將熒光PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.8引物和探針特異性檢測(cè)

采用優(yōu)化的反應(yīng)體系，以表1所列的供試菌株DNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè),驗(yàn)證所設(shè)計(jì)的擴(kuò)增GAPDH和GS基因引物和探針的特異性。

1.9實(shí)時(shí)熒光PCR應(yīng)用于樣品檢測(cè)

采用本研究建立的實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)田間采集的瓜炭疽病菌病果、病葉、西甜瓜出口用種子及自制帶菌種子樣品(表2)進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)病組織、種子樣品經(jīng)液氮研磨后用試劑盒提取基因組DNA,采用建立的實(shí)時(shí)熒光PCR體系檢測(cè)。

2　結(jié)果與分析

2.1引物與探針

根據(jù)GenBank中瓜炭疽病菌的GAPDH基因和GS基因相關(guān)序列,設(shè)計(jì)得到擴(kuò)增瓜炭疽病GAPDH基因和GS基因的特異性引物和TaqMan探針。GAPDH-3:5′-CCCTTCATTGAGACCAAGT-3′;GAPDH-4:5′-GTACTTGAGCATGTAGGCCT-3′;GAPDH-p:5′-CCGGGATCTCTGGCATTACG-3′,產(chǎn)物大小234 bp。GS-3:5′-TTCGTTCTCGAACACGAT-3′;GS-4:5′-GAGACATGACGACCTTGTTC-3′;GS-p: 5′-TGCACGTCTGGTCCAGTTCTGT-3′,產(chǎn)物大小209 bp。

表1　供試菌株的病原名稱、寄主和來(lái)源Table 1　Names, hosts and sources of the strains used in the study

表2　供試樣品及來(lái)源Table 2　Tested sample used in the study

2.2實(shí)時(shí)熒光PCR條件優(yōu)化

對(duì)PCR中的關(guān)鍵性條件Tm值和Mg2+濃度進(jìn)行優(yōu)化,確定獲得最大ΔRn值和最小循環(huán)閾值(Ct)的Tm值和Mg2+濃度。

結(jié)果表明,在建立的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系中,擴(kuò)增GAPDH基因的最佳退火溫度為57.9 ℃;Mg2+濃度為3.5 mmol/L;擴(kuò)增GS基因的最佳退火溫度為56 ℃;Mg2+濃度為3 mmol/L。

2.3檢測(cè)靈敏度

以不同濃度的瓜炭疽病菌菌株DNA為模板,按照優(yōu)化后的體系進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè),結(jié)果表明病菌DNA濃度越大Ct值越小,25 μL體系中有39.6 pg(10-3)的核酸量,雖然信號(hào)非常弱,但依然可以被檢測(cè)到(圖1～4),說(shuō)明實(shí)時(shí)熒光PCR方法所能夠檢測(cè)的最低DNA濃度為1.584 pg/μL。實(shí)時(shí)熒光PCR方法的產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè),在10-1稀釋倍數(shù)下還可以看到條帶,但是10-2已無(wú)可識(shí)別條帶(圖5～6)。說(shuō)明實(shí)時(shí)熒光PCR方法較常規(guī)PCR后電泳方法的檢測(cè)靈敏度高100倍。

2.4引物和探針特異性檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)表1中所列的14個(gè)供試菌株進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,瓜炭疽病菌的8個(gè)菌株都檢測(cè)到熒光,Ct值均小于30,采用GAPDH基因檢測(cè)時(shí),Colletotrichumlindemuthianum沒(méi)有熒光信號(hào),但是采用GS基因檢測(cè)時(shí)，除8個(gè)瓜炭疽病菌菌株外，C.lindemuthianum也出現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào),瓜上的其他病原菌和其他菌株均不產(chǎn)生熒光,因此設(shè)計(jì)的2對(duì)引物和探針共同檢測(cè)才能有效地將瓜炭疽病菌與其他病原菌區(qū)分開(kāi)來(lái)(圖7～8),說(shuō)明上述引物和TaqMan探針有很強(qiáng)的特異性。

圖1　不同DNA濃度對(duì)GAPDH基因檢測(cè)體系的影響Fig.1　Influences of different DNA concentrations on GAPDH gene detection system

圖2　GAPDH基因不同模板濃度下的Ct值Fig.2　Ct values at different DNA concentrations for GAPDH gene

2.5樣品檢測(cè)

使用本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的2對(duì)引物和探針對(duì)田間采集的具有瓜炭疽病癥狀的西瓜病果、病葉、實(shí)驗(yàn)室自制西瓜帶菌種子、4批出口用西甜瓜種子進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,田間采集樣品、實(shí)驗(yàn)室自制帶菌種子中檢測(cè)到瓜炭疽病菌(圖9a～b),供試的4批西甜瓜種子中沒(méi)有檢測(cè)到熒光信號(hào),常規(guī)分離培養(yǎng)的方法也沒(méi)有分離到病原菌,證明這4批種子中不含有瓜炭疽病菌,兩種方法的檢測(cè)結(jié)果一致。

圖4　GS基因不同模板濃度下的Ct值Fig.4　Ct values at different DNA concentrations for GS gene

圖5　GAPDH基因?qū)崟r(shí)熒光PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.5　Agarose gel electrophoresis of real-time PCR-amplified products of GAPDH gene

3　討論

GenBank中報(bào)道的瓜炭疽病菌序列很多,有ITS、β-tubulin (TUB2)、chitin synthase 1 gene(CHS1)、

histone H3 gene (HIS3)、glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene (GAPDH)、actin gene (ACT)、glutamine synthase gene (GS)等,為設(shè)計(jì)特異性引物和探針提供了充足的信息。但是經(jīng)過(guò)大量的網(wǎng)上BLAST比對(duì),從已經(jīng)公布的瓜炭疽病菌的序列中很難找到突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)探針,最終找到GAPDH基因和GS基因,但是僅僅單獨(dú)檢測(cè)GAPDH基因或GS基因不能確定病原菌為瓜炭疽病菌,必須對(duì)GAPDH基因和GS基因一起檢測(cè),才能夠把瓜炭疽病菌與其他近似病原菌完全區(qū)別開(kāi)來(lái),所以本研究針對(duì)這兩個(gè)功能基因設(shè)計(jì)兩對(duì)引物和兩條探針進(jìn)行檢測(cè)。

圖6　GS基因?qū)崟r(shí)熒光PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.6　Agarose gel electrophoresis of quantitative real-time PCR-amplified products of GS gene

圖7　基于GAPDH基因的病原菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)Fig.7　Detection of different pathogen strains using quantitative real-time PCR based on GAPDH gene

圖8　基于GS基因的病原菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)Fig.8　Detection of different pathogen strains using quantitative real-time PCR based on GS gene

圖9　基于GAPDH和GS基因的感病樣品實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)Fig.9　Detection of sample infected by Colletotrichum orbiculare using quantitative real-time PCR based on GAPDH and GS gene

本研究選擇瓜炭疽病菌甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因和谷氨酰胺合成酶(GS)基因序列設(shè)計(jì)引物和探針,通過(guò)對(duì)侵染瓜類作物的瓜炭疽病菌和其他5種病原菌的檢測(cè)研究,表明該方法具有良好的特異性、穩(wěn)定性和靈敏性。本研究首次對(duì)瓜炭疽病菌進(jìn)行了較為系統(tǒng)、深入的分子檢測(cè)技術(shù)的研究；建立了快速、準(zhǔn)確、靈敏的瓜炭疽病菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)；成功地設(shè)計(jì)出了針對(duì)瓜炭疽病菌，具有穩(wěn)定點(diǎn)突變的特異性引物對(duì)GAPDH-3、GAPDH-4和TaqMan探針GAPDH-p、GS-3、GS-4和TaqMan探針GS-p,通過(guò)對(duì)熒光反應(yīng)體系中的退火溫度、Mg2+兩個(gè)關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化確定了最佳值,建立了實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法,確定GAPDH最佳退火溫度為57.9 ℃，Mg2+濃度為3.5 mmol/L。GS最佳退火溫度為56 ℃，Mg2+濃度為3 mmol/L。

利用該方法對(duì)14株供試菌株進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè),結(jié)果表明本研究所設(shè)計(jì)的引物和探針能檢測(cè)出瓜炭疽病菌菌株,而其他病原菌的菌株和空白對(duì)照均未檢測(cè)到熒光信號(hào),表明該引物和探針對(duì)瓜炭疽病菌具有很高的特異性;該對(duì)引物和探針具較高的靈敏度,能夠達(dá)到1.584 pg/μL,可見(jiàn)本研究建立的實(shí)時(shí)熒光PCR方法保證了不同樣品間檢測(cè)結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性。整個(gè)PCR檢測(cè)時(shí)間大約40 min,與普通PCR相比,極大地縮短了檢測(cè)的時(shí)間,同時(shí)無(wú)需后續(xù)的電泳檢測(cè)。應(yīng)用本研究建立的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)田間采集樣品和種子混菌樣品進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)出陽(yáng)性樣品,此結(jié)果與分離檢測(cè)結(jié)果一致。

瓜炭疽病菌長(zhǎng)距離傳播主要依靠感病的植株、病殘?bào)w以及受侵染的種子等植物性材料。目前國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道有關(guān)檢測(cè)該病菌的熒光PCR特異性引物和探針。目前瓜炭疽病菌的檢驗(yàn)方法主要是常規(guī)種子帶菌檢驗(yàn)。這種方法經(jīng)驗(yàn)性較強(qiáng),瓜炭疽病菌和其他近似病原菌在形態(tài)上較難區(qū)分。因此建立針對(duì)瓜炭疽病菌的快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法至關(guān)重要。

本研究中所采用的瓜炭疽病菌為菌株、田間發(fā)病樣品或人為混合樣品,因?yàn)椴杉臉悠贩N類有限,沒(méi)有進(jìn)行更系統(tǒng)的驗(yàn)證,需要在后續(xù)試驗(yàn)中加以驗(yàn)證。

在進(jìn)行序列比對(duì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)檢測(cè)GAPDH基因,無(wú)法區(qū)別Colletotrichumspinosum和Colletotrichummalvarum,單獨(dú)檢測(cè)GS基因，無(wú)法區(qū)別Colletotrichummalvarum、Colletotrichumtrifolii和Colletotrichumlindemuthianum,由于收集菌株數(shù)量有限,有的菌株無(wú)法進(jìn)行驗(yàn)證。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Detection ofColletotrichumorbiculareby the real-time PCR

Wang Chong1,Zhang Xiaoju1,Zhang Xianglin1,Zhang Wei1,Zhang Yu1,Li Yawei1,Sun Yanfei2

(1. Xinjiang Entry & Exit Inspection and Quarantine Bureau, Urumqi830063, China;2. Shihezi University, Shihezi832000, China)

The detection ofColletotrichumorbiculareby real-time PCR was established.The specific primers andTaqMan probes were designed according to glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)gene and glutamine synthase(GS)gene sequences inC.orbiculare, and the reaction conditions were optimized.C.orbicularecould be detected from other strains in melon and other similar strains by real-time PCR. The sensitivity test indicated that 39.6 pg DNA could be detected in 25 μL reaction system. The real-time PCR sensitivity could reach to 1.584 pg/μL, 100 times more sensitive than ordinary PCR. The primers andTaqman probe were shown to be specific by detecting infected plants sampled in the field and unknown samples.

real-time PCR;detection;Colletotrichumorbiculare

2015-01-07

2015-04-06

國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局科研計(jì)劃項(xiàng)目(2013IK287, 2011IK168); 國(guó)家科技部質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201310091)

E-mail:81711308@qq.com

S 436.5

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.02.023

致謝：感謝新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院楊渡研究員和韓盛博士為本研究提供菌株。