刺萼龍葵PDS基因VIGS載體的構(gòu)建

王　旭,　王新果,　張朝賢,　黃紅娟,　魏守輝

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所, 北京　100193)

?

刺萼龍葵PDS基因VIGS載體的構(gòu)建

王旭,王新果,張朝賢,黃紅娟,魏守輝*

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所, 北京100193)

病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)是通過插入目的基因片段的重組病毒來抑制植物內(nèi)源基因表達(dá)的遺傳技術(shù),主要用于基因的功能分析。茄科植物刺萼龍葵(Solanumrostratum)是一種外來惡性雜草,研究證實,在農(nóng)桿菌GV3101介導(dǎo)下,刺萼龍葵的八氫番茄紅素脫氫酶(PDS)基因能被部分沉默,導(dǎo)致葉片和花朵出現(xiàn)白化表型。半定量RT-PCR檢測顯示,被侵染葉片和花朵的mRNA顯著降解。VIGS沉默體系的建立可適用于研究刺萼龍葵的部分功能基因,有助于深入了解其生長發(fā)育調(diào)控的分子機制。

刺萼龍葵;八氫番茄紅素脫氫酶;病毒誘導(dǎo)基因沉默;煙草脆裂病毒

基因沉默是生物體中特定基因由于種種原因不表達(dá)的現(xiàn)象,分為轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默(transcriptional gene silencing, TGS)和轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(post transcriptional gene silencing, PTGS),TGS發(fā)生在DNA水平,與目的基因啟動子區(qū)域的甲基化有關(guān);PTGS發(fā)生在RNA水平,由目的基因mRNA特異性降解引起。PTGS最早在植物中發(fā)現(xiàn),被稱為共抑制(co-suppression)[1-2],后來在真菌和動物中也發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象,分別被稱為基因消除(quelling)[3]和RNA干擾(RNA interference,RNAi)[4]。雖然RNA沉默在不同生物體中稱謂不同,但是他們卻有相似的作用機制。病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)是指攜帶植物目的基因的病毒在侵染植物體后誘導(dǎo)植物內(nèi)源靶基因沉默的現(xiàn)象,至今已經(jīng)建立了以RNA病毒、DNA病毒、衛(wèi)星病毒和DNA衛(wèi)星分子為載體的VIGS體系。這些病毒載體能在多種寄主植物包括擬南芥、番茄[5]、煙草[6]、辣椒[7]、馬鈴薯[8]上有效抑制功能基因的表達(dá),其中應(yīng)用VIGS技術(shù)在番茄中已經(jīng)驗證或鑒定了上百種基因,涉及生長發(fā)育、代謝調(diào)控、生物防御及非生物脅迫應(yīng)答等諸多方面。

刺萼龍葵是一種具有潛在重大危害的外來物種,為茄科茄屬的一年生草本植物,與番茄親緣關(guān)系較近。目前國內(nèi)的研究主要集中在其生物生態(tài)學(xué)特性[9]、風(fēng)險評估[10]、藥劑防控[11]、化學(xué)成分、生物活性[12]及不同地區(qū)表型變異[13]等方面,尚未深入研究刺萼龍葵的生理生態(tài)特征背后的分子機制,而這首先需要尋找并鑒定其相關(guān)的功能基因,但目前并沒有成功建立該植物的遺傳轉(zhuǎn)化體系。生物信息學(xué)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的缺乏嚴(yán)重影響了刺萼龍葵分子生物學(xué)研究的開展。VIGS技術(shù)耗時少,不需要進行遺傳轉(zhuǎn)化和組織培養(yǎng),加速了基因的功能分析。煙草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus, TRV)已被成功運用于番茄、煙草、馬鈴薯、茄子等茄科植物建立VIGS體系。刺萼龍葵也屬于茄科,這意味著TRV也能有效運用于該種植物建立VIGS技術(shù)體系。在不同的植物中建立VIGS體系,一般選用八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase, PDS)基因作為報告基因。PDS是類胡蘿卜素合成途徑的限速酶基因,主要在植物葉片、花朵和果實中表達(dá),當(dāng)類胡蘿卜素合成受阻時,植物會出現(xiàn)光漂白癥狀,表型肉眼容易觀測。本研究構(gòu)建了攜帶PDS片段的煙草脆裂病毒重組載體,通過農(nóng)桿菌成功侵染刺萼龍葵,旨在建立刺萼龍葵高效VIGS體系,為刺萼龍葵功能基因組學(xué)研究提供技術(shù)支撐。

1　材料和方法

1.1材料

刺萼龍葵種子于2013年11月采自北京市密云縣。TRV載體pTRV1、pTRV2及農(nóng)桿菌GV3101由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院提供。

1.2PDS基因片段的克隆

1.3病毒載體pTRV2-PDS構(gòu)建

煙草脆裂病毒是RNA病毒,由TRV1、TRV2兩條鏈組成。改造后的病毒包括pTRV1和pTRV2兩個獨立的質(zhì)粒結(jié)構(gòu),分別裝載TRV1和TRV2的遺傳信息。pTRV1質(zhì)粒上的運動蛋白促進病毒在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運;pTRV2攜帶目的基因。病毒載體構(gòu)建好后導(dǎo)入農(nóng)桿菌用于刺萼龍葵VIGS體系的建立。TRV載體的結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1　TRV-PDS病毒載體結(jié)構(gòu)Fig.1　Construction of TRV-PDS virus vector

切膠回收PCR產(chǎn)物,將目的基因片段與pTRV2病毒質(zhì)粒載體同時用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切,回收酶切產(chǎn)物后,用T4連接酶在16℃過夜連接,轉(zhuǎn)化DH5α,在含有卡那霉素(kanamycin,50 μg/mL)的抗性條件下篩選轉(zhuǎn)化子,提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒。病毒載體pTRV2-PDS通過凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101,在卡那霉素、慶大霉素(gentamicin)、利福平(rifampicin)(均為50 μg/mL)抗性條件下篩選轉(zhuǎn)化子。

1.4沉默體系的建立

分別培養(yǎng)含有pTRV2-PDS和pTRV1質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101,各取菌液1 mL加入20 mL的LB培養(yǎng)基(含慶大霉素、利福平和卡那霉素各50 μg/mL)中繼續(xù)擴大培養(yǎng)8 h,并加入0.5 mol/L的MES 200 μL,0.1 mol/L的乙酰丁香酮8 μL,28℃過夜培養(yǎng)。離心收集菌體后,加入侵染液(含10 mmol/L MgCl2,10 mmol/L MES,200 μmol/L乙酰丁香酮)懸浮菌體,調(diào)整菌液吸光度在2.0左右。將分別含有pTRV1、pTRV2-PDS的GV3101以1∶1的比例混合均勻,28℃振蕩培養(yǎng)3 h。陰性對照為含pTRV1、pTRV2(不含PDS)的GV3101混合菌液。以在溫室內(nèi)培養(yǎng)至2～4葉期的刺萼龍葵幼苗為待侵染材料,用一次性注射器對幼苗葉片及莖部進行注射侵染[14]。侵染后的植株置于20℃、濕度30%和光周期L∥D=16 h∥8 h的人工氣候室內(nèi)培養(yǎng),觀察刺萼龍葵的表型變化。

1.5半定量PCR反應(yīng)

分別從TRV-PDS和TRV侵染的刺萼龍葵葉片和花朵中提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄,以β-actin(登錄號為KT366001)為內(nèi)參基因,采用RT-PCR法對RNA進行半定量分析,所用引物為β-actinF1(5-GGAATGGTTAAGGCAGGATTTG-3′)和β-actinR1(5′-TTCATCACCCACATAGGCATC-3′)。在插入的目的基因外圍設(shè)計引物PDS-F1(5′-CTTATCATCAACATTCCGTGCTT-3′)和PDS-R1(5′-TCCTTAACACTTATCCCGTCT-3′)。根據(jù)半定量的需要,分別對PDS和β-actin基因進行24、27、30、35個循環(huán)的擴增。

2　結(jié)果和分析

2.1PDS基因片段的克隆與分析

將克隆得到的498 bp的刺萼龍葵PDS基因片段,與番茄的PDS片段對比,兩者同源性在95%以上,可用以構(gòu)建病毒載體。采用RT-PCR擴增出的PDS基因序列瓊脂糖凝膠電泳檢測表明,在500 bp處出現(xiàn)了清晰的擴增帶(圖2)。

圖2　PDS基因片段的PCR擴增結(jié)果Fig.2　PCR amplification results of PDS fragments

2.2刺萼龍葵基因沉默載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

將PCR產(chǎn)物與pTRV2分別用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切,酶切片段經(jīng)過連接得到pTRV2-PDS,轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α,挑取單克隆搖菌,提取質(zhì)粒進行PCR檢測和雙酶切檢測,結(jié)果顯示,以pTRV2-PDS為模板的擴增產(chǎn)物在約500 bp處存在目的條帶,而以空質(zhì)粒為模板則沒有擴增出目的條帶;對重組質(zhì)粒雙酶切,得到大小約500 bp目的條帶(圖3),說明pTRV2-PDS基因沉默載體構(gòu)建成功。將重組質(zhì)粒載體pTRV2-PDS轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101,挑取陽性克隆用于侵染刺萼龍葵。

2.3侵染接種與光漂白表型觀察

以在溫室中培養(yǎng)至2～4葉期的刺萼龍葵幼苗為試驗材料,用不帶針頭的注射器通過壓迫的方式將含有病毒載體的農(nóng)桿菌注入刺萼龍葵植株內(nèi),可先輕微摩擦制造傷口,再將菌液注射到刺萼龍葵葉片背部和幼根處。以不含PDS的pTRV2空載體侵染作為陰性對照。葉片經(jīng)注射侵染后可觀察到明顯的圓形痕跡,葉面充滿液體。侵染15 d后,發(fā)現(xiàn)接種重組pTRV2-PDS病毒載體的植株葉片有光漂白現(xiàn)象,侵染20 d后,光漂白現(xiàn)象逐漸擴展至其他葉片,30 d以后,部分花瓣也顯現(xiàn)了白化癥狀(圖4)。

圖3　pTRV2-PDS基因沉默載體的鑒定Fig.3　Identification of the recombinant pTRV2-PDS vector for gene silencing

2.4PDS基因的RT-PCR半定量分析

采用RT-PCR半定量方法檢測PDS基因的沉默效果(圖5),內(nèi)參基因β-actin在對照和沉默樣品中的擴增趨勢一致,說明對照和沉默的刺萼龍葵樣品的RNA定量準(zhǔn)確。與刺萼龍葵對照葉片和花朵相比,被侵染的葉片與花朵中PDS基因表達(dá)量顯著降低。在分子水平上說明刺萼龍葵VIGS體系構(gòu)建成功。

3　討論

VIGS技術(shù)的成功,需要選擇合適的載體、大小適當(dāng)?shù)牟迦肫巍⒏咝У那秩痉椒ㄒ约斑m宜的培養(yǎng)條件。首先,在應(yīng)用該技術(shù)時,所選擇的病毒載體應(yīng)對試驗植物有較好的侵染性、不被發(fā)病癥狀干擾,最好能在寄主植物中產(chǎn)生系統(tǒng)的沉默效果。插入的目的基因片段大小會影響沉默效率,片段過大會限制病毒載體在植株體內(nèi)的移動[14],插入的片段至少要與目的基因有23 bp完全相同[6],通常插入片段的長度控制在200～1 300 bp范圍內(nèi)最好[15]。VIGS載體的導(dǎo)入方法,除了農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,還有機械接種和金屬離子轟擊,但是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法因其簡便、高效、工作量少、成本相對低廉等優(yōu)點應(yīng)用更加普遍?；虺聊遣《痉敝撑c植物生長雙向互作的結(jié)果,兩者都受到環(huán)境條件的影響,其中溫度是最重要的影響因子。傅達(dá)奇等證實被侵染的番茄幼苗在低溫逆境條件下生長,沉默表型會持續(xù)至花和果實的發(fā)育[16],Szittya等發(fā)現(xiàn)溫度在24℃以下將抑制植物對蘭花環(huán)斑病毒的基因沉默[17],而TRV病毒對本氏煙的沉默適溫在25℃[15]。

圖4　被病毒載體侵染后刺萼龍葵葉片和花朵的光漂白癥狀Fig.4　Photobleaching of Solanum rostratum after inoculation

圖5　刺萼龍葵PDS基因沉默的RT-PCR分析Fig.5　RT-PCR analysis of the effect of VIGS on expression of PDS gene in Solanum rostratum

通過半定量PCR、實時熒光定量PCR以及Northern Blot等分子生物學(xué)方法可以檢測目的基因的沉默效率。無論采用何種方法,引物序列必須設(shè)計在插入片段以外的目的基因區(qū)域,即僅將內(nèi)源性表達(dá)的mRNA作為檢測對象,以避免載體攜帶片段擴增時對檢測結(jié)果造成的干擾[18-19]。其中,實時熒光定量PCR可快速檢測且靈敏度高,但有報道提出即使將引物設(shè)計在插入片段以外,實時熒光定量PCR的檢測結(jié)果也不理想,這種方法的檢測片段一般在100 bp左右,而沉默過程可能恰好降解產(chǎn)生此種片段[20]。

刺萼龍葵是一種入侵植物,目前已從初始發(fā)生地遼寧快速向南、向西擴散,明確其定殖擴散的分子調(diào)控機制是有效控制其危害蔓延的基礎(chǔ)。VIGS作為基因鑒定和功能研究的工具,有一定的優(yōu)勢。在未獲取全長序列的情況下即可進行VIGS分析,VIGS可以某一個片段為對象進行功能鑒定,也可以cDNA文庫為對象進行目的基因篩選分析,這克服了刺萼龍葵基因組信息未知的障礙。VIGS分析方法可應(yīng)用于刺萼龍葵功能基因的分析[21]、與馬鈴薯甲蟲的互作研究[22-24]及逆境脅迫研究[25-26]等方面。

[1]Napoli C, Lemieux C, Jorgensen R.Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans [J]. The Plant Cell, 1990, 2(4): 279-289.

[2]van der Krol A R, Mur L A, Beld M, et al. Flavonoid genes in petunia: addition of a limited number of gene copies may lead to a suppression of gene expression [J]. The Plant Cell, 1990, 2(4): 291-299.

[3]Romano N, Macino G.Quelling: transient inactivation of gene expression inNeurosporacrassaby transformation with homologous sequences [J]. Molecular Microbiology, 1992, 6(22): 3343-3353.

[4]Fire A, Xu Siqun, Montgomery M K, et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA inCaenorhabditiselegans[J]. Nature, 1998, 391(6669): 806-811.

[5]Liu Yule, Schiff M, Dinesh-Kumar S P.Virus-induced gene silencing in tomato [J]. The Plant Journal, 2002, 31(6): 777-786.

[6]Kumagai M H, Donson J, della-Cioppa G, et al. Cytoplasmic inhibition of carotenoid biosynthesis with virus-derived RNA [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1995, 92(5): 1679-1683.

[7]Kao K N, Michayluk M R.A method for high-frequency intergeneric fusion of plant protoplasts [J]. Planta, 1974, 115(4): 355-367.

[8]Brigneti G, Martín-Hernández A M, Jin Hailing, et al. Virus-induced gene silencing inSolanumspecies [J]. The Plant Journal, 2004, 39(2): 264-272.

[9]張延菊, 曲波, 劉更林, 等. 外來入侵有害植物刺萼龍葵 (SolanumrostratumDunal.) 幼苗的形態(tài)學(xué)特征初步研究[J]. 種子, 2010(3): 51-55.

[10]高芳, 徐馳, 周云龍. 外來植物刺萼龍葵潛在危險性評估及其防治對策[J]. 北京師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2005, 41(4): 420-424.

[11]張少逸, 魏守輝, 張朝賢, 等. 刺萼龍葵種子休眠和萌發(fā)特性研究進展[J]. 雜草科學(xué), 2011, 29(2): 5-9.

[12]郭章碧, 張國良, 付衛(wèi)東, 等. 外來入侵植物刺萼龍葵的研究概況及展望[J]. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2011, 42(3): 460-464.

[13]陳天翌, 劉增輝, 婁安如. 刺萼龍葵種群在中國不同分布地區(qū)的表型變異[J]. 植物生態(tài)學(xué)報, 2013, 37(4): 344-353.

[14]Burch-Smith T M, Anderson J C, Martin G B, et al. Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants [J]. The Plant Journal, 2004, 39(5): 734-746.

[15]Liu Enwu, Page J E.Optimized cDNA libraries for virus-induced gene silencing (VIGS) using tobacco rattle virus [J]. Plant Methods, 2008, 4(5): 1-13.

[16]傅達(dá)奇. 番茄中病毒誘導(dǎo)基因沉默體系的建立及LeEIN2基因功能分析[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué), 2005.

[17]Szittya G, Silhavy D, Molnár A, et al. Low temperature inhibits RNA silencing-mediated defence by the control of siRNA generation [J]. The EMBO Journal, 2003, 22(3): 633-640.

[18]Jupin I. A protocol for VIGS inArabidopsisthalianausing a one-step TYMV-derived vector [M]∥Annette Becker. Virus-induced gene silencing. Humana Press, 2013: 197-210.

[19]Spitzer-Rimon B, Cna’ani A, Vainstein A.Virus-aided gene expression and silencing using TRV for functional analysis of floral scent-related genes [M]∥Annette Becker. Virus-induced gene silencing. Humana Press, 2013: 139-148.

[20]Geuten K, Viaene T, Vekemans D, et al. Analysis of developmental control genes using virus-induced gene silencing [M]∥Annette Becker.Virus-induced gene silencing. Humana Press, 2013: 61-69.

[21]張松煥, 郭惠明, 裴熙祥, 等. 紫莖澤蘭類黃酮3′-羥化酶在煙草中的表達(dá)[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 42(12): 4182-4186.

[22]Zheng Sijun, Snoeren T A L, Hogewoning S W, et al. Disruption of plant carotenoid biosynthesis through virus-induced gene silencing affects oviposition behaviour of the butterflyPierisrapae[J]. New Phytologist, 2010, 186(3): 733-745.

[23]Bhattarai K K, Li Qi, Liu Yule, et al. TheMi-1-mediated pest resistance requiresHsp90 andSgt1 [J]. Plant Physiology, 2007, 144(1): 312-323.

[24]Kandoth P K, Ranf S, Pancholi S S, et al. Tomato MAPKs LeMPK1, LeMPK2, and LeMPK3 function in the systemin-mediated defense response against herbivorous insects [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2007, 104(29): 12205-12210.

[25]Senthil-Kumar M, Gowda H V R, Hema R, et al. Virus-induced gene silencing and its application in characterizing genes involved in water-deficit-stress tolerance [J]. Journal of Plant Physiology, 2008, 165(13): 1404-1421.

[26]Marzin S, Mihaly R, Pauk J, et al. A transient assay system for the assessment of cell-autonomous gene function in dehydration-stressed barley [J]. Journal of Experimental Botany, 2008, 59(12): 3359-3369.

(責(zé)任編輯：楊明麗)

VIGS vector construction of PDS gene in Solanum rostratum

Wang Xu,Wang Xinguo,Zhang Chaoxian,Huang Hongjuan,Wei Shouhui

(Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing100193,China)

Virus-induced gene silencing (VIGS) has recently been exploited as a genetic technique involving recombinant viruses with a target gene fragment insert to knock down expression of endogenous target genes and thereby analyze its gene functions.Solanumrostratum(Solanaceae) is an invasive alien species. In this study, the expression of phytoene desaturase (PDS) ofS.rostratum, mediated byAgrobacteriumGV3101, was partly inhibited and some leaves and flowers showed obvious photobleaching after being infected. RT-PCR of the target gene further confirmed the knockdown of PDS.In conclusion, VIGS can be applied to gene function analysis ofS.rostratumto explore molecular mechanism of growth and development.

Solanumrostratum;phytoene desaturase;virus-induced gene silencing;Tobaccorattlevirus

2015-08-18

2015-09-10

國家自然科學(xué)基金(31171867)

E-mail: shwei@ippcaas.cn

S 451

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.04.022