脂溶性蟾毒配基的純化工藝研究

王艷華 段佳林 衛(wèi)國 朱艷榮 殷 英 郭 超 關(guān) 月 奚苗苗 文愛東 翁 琰

第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，陜西 西安 710032

藥物研究

脂溶性蟾毒配基的純化工藝研究

王艷華 段佳林 衛(wèi)國 朱艷榮 殷 英 郭 超 關(guān) 月 奚苗苗 文愛東 翁 琰*

第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，陜西 西安 710032

目的：研究從蟾酥中提取分離高純度蟾毒靈 （B）、華蟾酥毒基 （C）和脂蟾毒配基 （R）的純化工藝條件。方法：以三種蟾毒配基的總含量和轉(zhuǎn)移率為考察指標(biāo)，采用單因素考察法，結(jié)合蟾酥藥材的特點(diǎn)、化學(xué)成分及工藝成本等多方面的綜合因素，考察蟾酥藥材的提取、萃取及硅膠柱層析分離的具體工藝條件及參數(shù)。結(jié)果：蟾酥藥材經(jīng)10倍量（v/m）80%乙醇加熱回流1h，再用10倍量 （v/m）乙酸乙酯萃取3次，最后用硅膠柱層析進(jìn)行分離后，三種蟾毒配基的總含量可達(dá)92.26%，總轉(zhuǎn)移率為80.54%。結(jié)論：此法能很好地從蟾酥中分離純化蟾毒配基，大大提高了三個(gè)蟾毒配基的純度。

蟾毒配基；含量；轉(zhuǎn)移率；提?。惠腿。还枘z柱層析

蟾酥是我國的傳統(tǒng)中藥材，由蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍 （Bufo bufo gargarzinas Gantor）或黑眶蟾蜍（Bufo melanostictus Schneider）的皮膚腺及耳后腺分泌的白色漿液加工干燥而成［1］，具有興奮呼吸、致幻、鎮(zhèn)痛、強(qiáng)心、升壓、抗休克、局部麻醉、鎮(zhèn)咳、抗腫瘤等一系列的藥理活性［2］，其化學(xué)成分按溶解性能不同分為脂溶性和水溶性兩大類。雖然脂溶性成分僅占20%左右，但在發(fā)揮藥理活性方面卻起主導(dǎo)作用，其中又以蟾毒靈 （bufalin，B）、華蟾酥毒基 （cinobufagin，C）和脂蟾毒配基 （resibufogenin，R）含量較多、活性較強(qiáng)，且具有高效低毒的特點(diǎn)。目前蟾酥的提取工藝研究報(bào)道很多［3-6］，但對蟾毒靈、華蟾酥毒基和脂蟾毒配基進(jìn)行提取和純化并提高三種蟾毒配基混合物純度的研究并不多。研究以三種蟾毒配基的總含量和轉(zhuǎn)移率為考察指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)系統(tǒng)研究了蟾酥的提取純化工藝，旨在得到高純度的三種蟾毒配基混合物，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 日立 D-7000高效液相色譜儀（L-7100泵、L-7420紫外檢測器、L-7200自動(dòng)進(jìn)樣器，日本Hitachi公司）；HiQ sil C18色譜柱 （250 mm×4.6mm，5μm，日本KYATECH公司）；AT-130柱溫箱 （天 津 市 鑫 洲 科 技有 限 公 司）；FA1104N電子分析天平 （上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器（鞏義市英峪予華儀器廠）；FW-100高速萬能粉碎機(jī) （天津市泰斯特儀器有限公司）；DZ-1BC真空干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；玻璃柱（5 cm×90 cm，第四軍醫(yī)大學(xué)玻璃儀器制備室）。1.2 材料 蟾酥 （安徽省毫州市中藥飲片廠）；蟾毒靈對照品 （批號(hào)：1054-070211，中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程中心）；華蟾酥毒基對照品（批號(hào)：110803-200605）、脂蟾毒配基對照品（批號(hào)110718-200507）購自中國藥品生物制品檢定所；柱層析用硅膠 （100-140目，200-300目）、薄層層析用硅膠G（青島海洋化工廠）。甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 蟾毒配基的薄層色譜法鑒別 取蟾毒靈、華蟾酥毒基與脂蟾毒配基對照品，加甲醇分別制成每1mL含1mg的溶液，作為對照品溶液；再取蟾酥分離物細(xì)粉 12mg，加甲醇稀釋并定容至10mL量瓶中，搖勻，作為供試品溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2015版一部附錄VIB）試驗(yàn)，吸取上述溶液各 10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠 G薄層板上，以環(huán)己烷-三氯甲烷-丙酮 （4∶3∶3）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)。

2.2 蟾毒配基的含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：HiQ sil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；預(yù)柱：Fusion-RP 4 mm×3.0 mm；流動(dòng)相：乙腈 -0.5%磷酸二氫鉀溶液 （45∶55；pH：3.2）；流速：1mL/min；檢測波長：296nm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10μL；理論塔板數(shù)以蟾毒靈、華蟾酥毒基和脂蟾毒配基峰計(jì)算均不低于4000。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥至恒重的蟾毒靈與華蟾酥毒基對照品各3mg、脂蟾毒配基對照品5mg分別置10mL量瓶中，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得三種蟾毒配基單獨(dú)的對照品儲(chǔ)備液；分別精密量取1.0mL單獨(dú)的對照品儲(chǔ)備液，置同一個(gè)10mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得三種蟾毒配基混合的對照品儲(chǔ)備液；精密量取 1.5mL混合對照品儲(chǔ)備液，置5mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得理論上每 1mL分別含蟾毒靈與華蟾酥毒基9μg、脂蟾毒配基15μg的對照品溶液。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的考察 分別精密量取 “2.2.1”項(xiàng)下三種蟾毒配基混合的對照品儲(chǔ)備液 0.2、0.5、0.75、1.5、2.5mL置5mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻。分別精密吸取稀釋后的溶液及混合對照品儲(chǔ)備液10μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，以對照品溶液峰面積對濃度作圖，蟾毒靈、華蟾酥毒基和脂蟾毒配基的線性關(guān)系回歸方程分別為：A1=6287.7 C1-664.1，r1=0.9999；A2=6957.6 C2- 2102.2，r2=0.9997；A3= 6535.6 C3-2751.2，r3=0.9998。結(jié)果表明：蟾毒靈與華蟾酥毒基均在 1.2～30.0μg、脂蟾毒配基在 2.0～50.0μg范圍內(nèi)濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.4 供試品溶液的制備 精密稱定蟾酥提取物或萃取物細(xì)粉約25mg，置圓底燒失的重量，搖勻，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，分別精密量取2.0、1.5及0.5mL續(xù)濾液置10mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得。

分離物供試品溶液精密稱定蟾酥分離物 5mg 置10mL量瓶中，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取1.0mL置10mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾即得。

2.3 提取工藝的考察

2.3.1 提取溶劑的選擇 稱取小于60目的蟾酥藥材細(xì)粉 5g，分別采用 10倍量（v/m）的氯仿或70%、80%和90%乙醇加熱回流1h，放冷至室溫，抽濾，濾液蒸干，濾液干燥物及殘?jiān)谜婵崭稍锵涓稍?2h，按2.2項(xiàng)下方法測定提取物中蟾毒配基的含量。結(jié)果表明，隨著乙醇濃度的增大，提取物中蟾毒配基總含量從22.01%增加到30.18%，而轉(zhuǎn)移率從85.24%降到76.36%；使用索氏提取器以氯仿為溶劑進(jìn)行提取時(shí)，雖然干燥物中三種蟾毒配基的總含量可達(dá)到61.89%，但提取轉(zhuǎn)移率小于60%。綜合考慮，乙醇為中藥提取中最常用的溶劑，具有價(jià)廉、易得、安全、無毒、無污染等特點(diǎn)，因此本試驗(yàn)選擇80%乙醇為提取溶劑。

2.3.2 粉末粒度的確定 在試驗(yàn)操作中所采用的粉碎機(jī)可在短時(shí)間內(nèi)將藥材粉碎到粒徑小于60目，其中多數(shù)分布在80～100目，因此我們僅對60～80目，80～100目及小于100目的細(xì)粉進(jìn)行了考察。稱取這三種粒度的蟾酥藥材細(xì)粉各 5g，采用10倍量 （v/m）80%乙醇加熱回流 1h，放冷置室溫，抽濾，濾液蒸干，濾液干燥物置真空干燥箱干燥12h，按“2.2”項(xiàng)下方法測定提取物中三種蟾毒配基的含量。結(jié)果表明：三種蟾毒配基的總含量和總提取率沒有明顯差異，均在 27%和 84%左右。因此確定將蟾酥藥材粉碎到粒度小于60目。

2.3.3 提取回流時(shí)間的確定 稱取小于60目的蟾酥藥材細(xì)粉5g，采用10倍量 （v/m）80%乙醇分別加熱回流0.5、1、2h，放冷至室溫，抽濾，濾液蒸干，濾液干燥物置真空干燥箱干燥 12h，按2.2項(xiàng)下方法測定提取物中三種蟾毒配基的含量。結(jié)果表明：當(dāng)提取時(shí)間小于1h時(shí)，提取物中三種蟾毒配基的純度及轉(zhuǎn)移率較低，但超過1h時(shí)，又均未有明顯增加。因此確定回流時(shí)間為1h。

2.3.4 提取工藝驗(yàn)證 實(shí)驗(yàn)將蟾酥藥材粉碎到粒徑小于60目，稱取此細(xì)粉三份，每份5g，采用10倍量 （v/m）80%乙醇加熱回流1h，放至室溫后，抽濾，濾液蒸干，濾液干燥物置真空干燥箱干燥12h后，按 “2.2”項(xiàng)下方法測定干燥物中指標(biāo)性成份的含量及轉(zhuǎn)移率。結(jié)果見表1。

表1 蟾酥提取物的含量及轉(zhuǎn)移率Tab.1 Content and transfer rateof chansu′s first extracts

2.4 萃取工藝的考察

2.4.1 萃取溶劑的選擇 稱取蟾酥醇提物5g，加入10倍量 （v/m）的蒸餾水超聲混懸后，再分別用10倍量 （v/m）的乙醚、氯仿或乙酸乙酯萃取 3次，合并有機(jī)層并將其蒸干，所得干燥物置真空干燥箱干燥12h后，按 “2.2”項(xiàng)下方法測定萃取物中指標(biāo)性成份的含量及轉(zhuǎn)移率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：對提取物使用乙醚、氯仿或乙酸乙酯等極性較小的溶劑萃取后，蟾毒配基的總含量提高了近一倍，均在55%左右，但乙醚和氯仿的萃取轉(zhuǎn)移率均小于80%，而乙酸乙酯可達(dá)到90%以上。加之使用乙醚極易發(fā)生乳化現(xiàn)象，同時(shí)考慮到溶劑的毒性，最終選擇乙酸乙酯作為萃取溶劑，進(jìn)一步考察其用量。

2.4.2 萃取溶劑用量的考察 稱取蟾酥醇提物 5g，加入10倍量 （v/m）的蒸餾水超聲混懸后，再分別用5、10、20倍量 （v/m）的乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)層并將其蒸干，所得干燥物置真空干燥箱干燥12h后，按 “2.2”項(xiàng)下方法測定萃取物中指標(biāo)性成份的含量及轉(zhuǎn)移率。結(jié)果表明：使用不同用量的乙酸乙酯均能有效地對指標(biāo)性成分進(jìn)行萃取，但在操作中使用五倍量的蒸餾水混懸醇提物較困難，固狀物不能充分混懸，操作不便，同時(shí)考慮到節(jié)省溶劑，最終選用10倍量的乙酸乙酯進(jìn)行萃取。

2.4.3萃取工藝驗(yàn)證 實(shí)驗(yàn)稱取蟾酥醇提物 20g，加入10倍量 （v/m）的蒸餾水超聲混懸后，再分別用10倍量 （v/m）的乙酸乙酯萃取 3次，合并有機(jī)層并將其蒸干，所得干燥物置真空干燥箱干燥12h后，按“2.2”項(xiàng)下方法測定萃取物中指標(biāo)性成份的含量及轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表2。

表2 蟾酥萃取物的含量及轉(zhuǎn)移率Tab.2 Content and transfer rateof chansu′s second extracts

2.5 硅膠柱層析工藝的考察

2.5.1 柱層析條件 自制玻璃 （D-5cm，H-8 cm），玻璃柱 （5cm×90cm），層析用硅膠，展開劑：環(huán)己烷、丙酮、三氯甲烷。

2.5.2 硅膠柱裝柱及層析分離 稱取 250g硅膠（200～300目），用環(huán)己烷分散均勻后，裝柱并沉降過夜。稱取蟾酥萃取物10g溶于150mL氯仿與甲醇（1∶1）中，濾去不溶物，將澄清液邊加邊攪拌于50g硅膠 （100～140目）中拌樣，放置待完全干燥后，裝入已經(jīng)沉降一晚的硅膠柱頂，上面再加入保護(hù)硅膠和無水硫酸鈉。洗脫時(shí)，先用環(huán)己烷：丙酮（10∶1）洗脫3個(gè)體積，再用環(huán)己烷：丙酮 （5∶1）洗脫5個(gè)體積，然后用丙酮洗脫3個(gè)體積，最后用甲醇洗脫至目標(biāo)成分消失。洗脫過程中，分段收集餾分，利用減壓蒸餾對餾分進(jìn)行濃縮，并用薄層色譜法對濃縮物進(jìn)行鑒別。由鑒別結(jié)果可知伴隨第二個(gè)黃色帶洗脫下來時(shí)，開始得到的白色固體即為指標(biāo)成分。分離結(jié)束后合并經(jīng)分析較純的蟾毒靈、華蟾酥毒基和脂蟾毒配基，并對合并物按 “2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行定量分析，結(jié)果見表3。

表3 蟾酥分離物的含量及轉(zhuǎn)移率Tab.3 Content and transfer rateof chansu′s separated products

3 討論

3.1 提取方法的確定 國內(nèi)雖有多篇文獻(xiàn)報(bào)道了蟾酥中蟾毒配基的提取方法，但多數(shù)是為了分離少量試驗(yàn)樣品，因此考慮不是很全面，存在著各種問題。研究綜合文獻(xiàn)的優(yōu)缺點(diǎn)，使用回流提取法以乙醇為溶劑對蟾酥中脂溶性成分進(jìn)行提取。

該法簡便，省時(shí)，溶劑用量較少，同時(shí)使用萃取工藝對蟾毒配基進(jìn)行富集，最終萃取物中三種目標(biāo)化合物的純度和在50%以上，轉(zhuǎn)移率在90%以上，為工業(yè)化放大奠定了一定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

3.2 純化工藝的選擇 蟾毒靈、華蟾酥毒基及脂蟾毒配基屬于強(qiáng)心苷成分，極性較小不適合用大孔樹脂來分離。若將這三種蟾毒配基的純品于環(huán)己烷 -丙酮中用中性氧化鋁吸著，經(jīng)1～3d即起吸附劑副反應(yīng)，綜合比較使用硅膠柱分離效果較好［7］。研究使用濕柱層析法，進(jìn)行梯度洗脫，可一次性將三種蟾毒配基從萃取物中進(jìn)行分離，最終蟾酥分離物中三種蟾毒配基的含量和達(dá)到了92.26%，轉(zhuǎn)移率為 80.54%。在實(shí)驗(yàn)室工藝放大過程中，可適量增加上樣量，減少分離硅膠的使用，多次層析分離后可將每根層析柱的少量交叉部分合并，再次上柱層析分離，可使純化效率提高同時(shí)也保證了蟾毒配基的轉(zhuǎn)移率。

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Study on the purification technology of high purity of liposoluble bufadienolides

WANG Yanhua DUAN Jialin WEIGuo ZHU Yanrong YIN Ying GUO Chao
GUAN Yue XI Miaomiao WEN Aidong WENG Yan*
Department of Pharmacy，Xijing Hospital，F(xiàn)ourth Military Medical University，Xi'an 710032，China

Objective To study on the purification technology of Chansu in order to obtain the high purity ofbufalin（B），cinobufagin（C）and resibufogenin（R）.Methods The single factor investigation method，combining with comprehensive factors such as the characteristics of raw material，chemical composition and technological cost was used to investigate the detailed conditions and parameters of extraction，separation and silica gel column chromatographyltechnologies with the content and the transfer rate of three bufadienolides as index.Results The final separated products contained a high purity of 92.26% for a sum of B，C and R and a high total transfer rate of80.54%after the raw materials were separated by 10-fold（v/m）80%ethanol reflux extraction for 1h，10-fold（v/ m）ethyl acetate extraction for3 times and loaded on silica gel columnchromatography.Conclusion Bufadienolides could be well separated from the raw material of Chansu，and the purityof bufadienolides could be greatly improved with this method.

bufadienolides；content；transfer rate；extraction；separation；silica gel column chromatography

R284.2

A

1007-8517（2016）13-0015-03

2016.05.03）

國家自然科學(xué)基金 （81303264）。

王艷華 （1987-），女，碩士，藥師，主要從事中藥新制劑的研究與開發(fā)。E-mail：645301987@qq.com

翁琰，藥師，博士。E-mail：mejean12021984@aliyun.com