刺槐素的不同給藥時間對小鼠局灶性腦缺血的影響

補娟　趙宗峰　王慧琴　張曉玲　張艷君　吳衛(wèi)東

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刺槐素的不同給藥時間對小鼠局灶性腦缺血的影響

補娟趙宗峰王慧琴張曉玲張艷君吳衛(wèi)東

目的探討刺槐素在不同時間點給藥對小鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用，并分析刺槐素的治療時間窗。方法將36只雄性昆明小鼠隨機分為假手術組、缺血再灌注組、刺槐素(治療)組，治療組又根據不同給藥時間分為0、2、4、8 h 4個給藥組，每組各6只；采用線栓法制作大腦中動脈閉塞模型，治療組予缺血0、2 、4、8 h腹腔注射刺槐素(12.5 mg/kg)；再灌注后24 h進行神經功能評分，應用2,3,5-氯化三苯基四氮唑染色測定腦梗死體積。結果缺血0、2、4 h給藥組神經功能評分均顯著低于缺血再灌注組(p均<0.05)，8 h給藥組神經功能評分有改善，但無統(tǒng)計學意義(p=0.052)；不同時間給藥組間神經功能評分無統(tǒng)計學意義(p>0.5)。缺血再灌注組腦梗死體積為(65.18±5.96)mm3,與缺血再灌注組相比，缺血0 h[(22.15±3.02)mm3，p=0.000]，2 h[(28.61±4.19)mm3，p=0.000]，4 h[(49.8±4.08)mm3，p=0.000]給藥組腦梗死體積均顯著降低，8 h[(56.09±7.92)mm3，p=0.075]給藥組腦梗死體積有減小，但無統(tǒng)計學意義。結論在缺血早期應用刺槐素治療可有效改善神經功能評分，縮小腦梗死體積。

刺槐素腦缺血再灌注疾病模型動物小鼠

腦卒中(stroke)包括缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中約78%的腦卒中為缺血性卒中(ischemia stroke)，其具有較高發(fā)病率、較高病死率和較高致殘率的特點[1]。近年來雖然腦卒中的病理機制研究取得較大進展，但向臨床應用的有效轉化均未成功。腦卒中尚缺乏理想有效的治療藥物，組織纖維蛋白酶原激活劑(tissueplasminogen activator, tPA)依然是當前治療缺血性腦卒中的主要藥物。但是，tPA嚴格的有效治療時間窗及其不良反應等原因極大地限制了其在臨床的應用。因此，深入研究該病的發(fā)病機制、尋找有效的生物靶點、研發(fā)安全有效的治療藥物治療缺血性腦血管病具有重大的意義。

刺槐素(Acacetin)又稱刺槐黃素、金合歡素，屬黃酮類化合物，可從菊花、刺槐、雪蓮等多種植物中提取獲得[2-4]，其具有抗氧化作用和抗炎作用。目前，關于刺槐素的研究較少，主要集中在抗腫瘤作用的研究，最近的研究發(fā)現(xiàn)刺槐素對神經炎癥性疾病發(fā)揮神經保護作用。Sang Keun Ha[5]等發(fā)現(xiàn)刺槐素可抑制小膠質細胞的活化，抑制炎性因子的表達，從而對神經炎癥反應發(fā)揮保護作用。小膠質細胞介導的炎癥反應是腦缺血再灌注損傷的重要機制，因此推測刺槐素對腦缺血再灌注損傷具有保護作用。課題組前期應用氧-葡萄糖剝奪模型和局灶性腦缺血模型來探討不同劑量的刺槐素對腦缺血再灌注損傷的保護作用，體內外結果均證明刺槐素具有保護作用[6]。有效治療時間窗是許多神經保護藥物臨床轉化失敗的原因之一，關于刺槐素的有效治療時間窗尚不明確。本研究通過建立小鼠局灶性腦缺血模型，在缺血后不同時間點給予刺槐素治療，觀察再灌注24 h后小鼠腦神經功能評分和腦梗死體積，明確刺槐素對腦缺血再灌注損傷的有效治療時間窗。

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組

清潔級雄性昆明小鼠，體重(25±2)g，由新疆實驗動物研究中心提供(許可證號：SCXK(新)2011-0001)。用隨機數(shù)字法將小鼠分為假手術組、缺血再灌注組、刺槐素(治療)組，刺槐素(治療)組根據不同給藥時間分為缺血0、2、4、8 h 4個給藥組。假手術組僅分離頸內動脈，但不閉塞大腦中動脈，缺血時給予等體積刺槐素處理；缺血再灌注組缺血時腹腔注射等體積1%DMSO；治療組予設定時間點腹腔注射等體積刺槐素(藥物濃度統(tǒng)一為12.5 mg/kg，美國Sigma公司，溶于1%DMSO溶液)。

1.2小鼠MCAO動物模型的建立

實驗環(huán)境中適應3 d，自由飲水。采用改良線栓法制作小鼠大腦中動脈栓塞模型[7]。腹腔注射1．5%的戊巴比妥鈉(德國進口分裝，北京化學試劑公司) 麻醉小鼠，仰臥位固定齒及四肢；行頸部正中縱行切口(5～6 mm)，依次鈍性分離及暴露右側頸總動脈、右側頸外動脈；暫時夾閉頸總動脈，結扎并凝斷頸外動脈遠心端，于頸外動脈殘端插入直徑0.22 mm的硅膠線栓(6023PK,Doccol Corp, CA, USA)至大腦中動脈；阻斷血流60 min后緩慢拔出線栓恢復血流再灌注。術中至小鼠蘇醒前維持體溫在37 ℃左右。

1.3神經功能評分

再灌注24 h后各組小鼠按照Longa[8]等的方法進行神經功能評分，評分標準為0分：無神經功能損傷癥狀或體征；1分：缺血對側前肢內收；2分：行走時向癱瘓側轉圈；3分：行走時向癱瘓側傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識喪失或死亡。1～3分為模型成功，0、4分及出現(xiàn)癲癇發(fā)作、取材時發(fā)現(xiàn)腦出血者均予剔除并隨機補充，保證每組小鼠數(shù)不變。

1.4腦梗死體積測定

缺血/再灌注24 h后處死小鼠，迅速斷頭取腦組織，放于-20 ℃冰箱快速冷凍按1 mm厚冠狀位切片，將切片放入1.5% TTC(美國Sigma公司)磷酸鹽緩沖液中，37 ℃恒溫箱孵育染色20 min，正常腦組織染成紅色，梗死灶為白色，然后將腦組織取出置于4%多聚甲醛(美國Gibco公司)中固定2 h；采用 Image pro plus6.0軟件測量各區(qū)面積，計算梗死灶體積為V=Σ(S1+S2) ·d/2。公式中V為總體積；S1和S2分別表示切片頭側和尾側面積；d為切片厚度。

1.5統(tǒng)計學分析

2　結　果

2.1刺槐素不同給藥時間對缺血再灌注損傷小鼠行為學評分的影響

再灌注后24 h缺血再灌注組和刺槐素不同時間給藥組均出現(xiàn)神經功能缺損，表現(xiàn)為左側肢體不同程度活動障礙、向左側轉圈等。與缺血再灌注組[(2.83±0.41)分]相比，缺血0 h給藥組[(1.5±0.55)分，P=0．004]、缺血2 h 給藥組[(1.67±0.52)分，P=0．016]、缺血4 h給藥組[(1.67±0.82)分，P=0．016]神經功能評分均顯著改善。缺血8 h給藥組[(1.83±0.75)分，P=0．052]神經功能有改善，但無統(tǒng)計學意義。不同時間給藥組間神經功能評分無統(tǒng)計學意義(p>0.5)(表1)。

表1　各組小鼠神經功能缺損評分比較±s,分)

注：與缺血再灌注組比較，*P<0.05

2.2刺槐素不同給藥時間對缺血再灌注損傷小鼠腦梗死體積的影響

缺血再灌注組腦梗死體積為[(65.18±5.96)mm3],與缺血再灌注組相比，缺血0 h[(22.15±3.02)mm3，p=0.000]，2 h[(28.61±4.19)mm3，p=0.000]，4 h[(49.8±4.08)mm3，p=0.000]給藥組腦梗死體積均顯著降低，8 h[(56.09±7.92)mm3，p=0.075]給藥組腦梗死體積有減小，但無統(tǒng)計學意義(圖1、表2)。

圖1各組小鼠腦梗死體積比較

表2　各組小鼠腦梗死體積比較，mm3)

注：與缺血再灌注組比較，*P<0.01

3　討　論

缺血性腦卒中病理生理機制復雜，目前的治療方法主要有溶栓治療和神經保護治療。以組織纖維蛋白溶酶原激活劑為代表的溶栓治療，由于過窄的時間治療窗和出血等嚴重的并發(fā)癥，并不能廣泛地應用于臨床。另一種神經保護治療方法旨在干預細胞缺血級聯(lián)反應，挽救缺血半暗帶區(qū)域尚有活力神經組織，改善臨床神經功能預后[9]。多年來，人們研究了上千種神經保護藥物，但臨床轉化均為失敗。僅有日本三菱制藥研發(fā)的自由基清除劑依達拉奉(MCI-186)2001年 4 月在日本被批準上市，但是依達拉奉的神經保護功效尚未得到主流學術界的認可[10]。因此，繼續(xù)尋找新的、安全有效的藥物仍是神經保護領域的熱點。

學者在尋找新的神經保護藥物的同時，也在審視以往基礎實驗和臨床試驗中的不足，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)人們都重視復雜的機制研究，而缺乏系統(tǒng)的臨床前研究，如給藥方式、藥物的量效關系、藥物的治療時間窗、性別、年齡對藥物效果的影響等。前期我們研究了刺槐素的劑量效應，但刺槐素的有效時間窗尚不明確。本研究采用單次給藥方式，給藥時間分別設定在缺血開始后 0、2、4、8 h，并在缺血24 h后進行神經功能評分和腦梗死體積測定，結果顯示刺槐素具有良好的治療時間窗，在缺血4 h給藥仍能有效地改善神經功能評分，減少腦梗死體積；在缺血8 h給藥神經功能評分和腦梗死體積仍有減少趨勢。嚙齒類動物腦缺血模型中所展示的治療時間窗在一定程度上能夠預示藥物在人體上的時間窗[11]。刺槐素4h的有效治療時間窗已接近臨床實際應用的時間窗，揭示刺槐素可作為一種潛在的神經保護藥物。

本研究僅探討了刺槐素對腦缺血再灌注損傷的時間窗問題，以后將進一步探討應用局灶性腦缺血模型，刺槐素對不同性別和年齡小鼠的治療效果以及刺槐素發(fā)揮神經保護作用的機制研究。

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[2]Uehara A,Nakata M,Kitajima J,et al.Internal and external flavonoids from the leaves of Japanese Chrysanthemum species (Asteraceae)[J].Biochem Syst Ecol,2012,41(1):142-149.

[3]Nigel C,Peter C,Geoffrey C,et al.Flavonoid glycosides of the black locust tree,Robinia pseudoacacia(Leguminosae)[J].Phytochemistry,2010,71(4):479-486.

[4]Li GR,Wang HB,Qin GW,et al.Acacetin, a natural flavone, selectively inhibits human atrial repolarization Potassium currents and prevents atrial fibrillation in dogs[J].Circulation,2008,117(19):2449-2457.

[5]Ha SK,Moon E,Lee P,et al.Acacetin attenuates neuroinflammation via regulation the response to LPS stimuli in vitro and in vivo[Z],2012:24.

[6]補娟.朱沂,胡剛等.刺槐素在SH-SY5Y細胞氧一葡萄糖剝奪和小鼠腦缺血再灌注中的神經保護作用[J].國際腦血管病雜志,2013,21(1):47-50.

[7]Uluc K MA,Baskaya MK.Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat[Z],2011.

[8]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[9]葉瑞東.人參皂苷Rd治療急性缺血性腦卒中的臨床前研究[D].西安:第四軍醫(yī)大學,2012.

[10]Shinohara Y, Saito I, Kobayashi S, et al.Edaravone (radical scavenger) versus sodium ozagrel (antiplatelet agent) in acute noncardioembolic ischemic stroke (EDO trial)[J]. Cerebrovasc Dis. 2009;27(5):485-492.

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(2016-04-12收稿)

Time dependent effect of acacetin on ischemia and reperfusion injury in mice

BuJuan,ZhaoZongfeng,WangHuiqin,etal.

People'sHospitalofXinjiangUygurAutonomousRegion,Urumqi830001

ObjectiveTo investigate the neuroprotective effects of Acacetin in Mice after cerebral ischemia and reperfusion when it was administered at different time points and analyze acacetin therapeutic time window.MethodsIntraluminal suture method was used to develop reversible middle cerebral artery occlusion (MACO). 36 male Kunming mice are randomly divided into sham group, ischemia-reperfusion group, ischemia-reperfusion therapy group.The therapy group according to different drug administration time is divided into: 0 h, 2 h, 4 h, 8 h 4 groups(n=6 in each group).The mice in ischemia-reperfusion therapy group were injected intraperitoneally at 0,2, 4, 8 hours after MACO(12.5 mg/kg ). The neurological function score was evaluated at 24 hours after reperfusion. Cerebral infarct volume was determined by 2，3，5-triphenyl tetrazolium staining.ResultsThe neurological function score in the groups of 0 h,2 h,4 h were lower than that in the ischemia-reperfusion group(allp<0.05), The neurological function score in 8 h group has no statistical significance. There was no significant difference among the groups which administered at different time points. The infarct volume in the groups of 0h ,2 h,4 h was(22.15±3.02)mm3，(28.61±4.19)mm3,(49.8±4.08)mm3, which was significantly smaller than that in the ischemia-reperfusion group(65.18±5.96)mm3, (allp<0.05).There Was no significant difference between the 8h group and ischemia-reperfusion group.ConclusionAcacetin can improve neurological function score and reduce the infarct volume in cerebral ischemia early stage.

AcacetinBrain ischemiaReperfusion injuryDisease modelsAnimalMice

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學基金(2010211A56)

830001烏魯木齊，新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院臨床醫(yī)學研究中心[補娟趙宗峰王慧琴張曉玲張艷君吳衛(wèi)東(通信作者)]

R743

A

1007-0478(2016)04-0263-04

10.3969/j.issn.1007-0478.2016.04.012