一種利用堿裂解法快速篩選重組子的方法

呂　新，陳麗華，李玥仁

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所；精密儀器農(nóng)業(yè)測試重點(diǎn)公共實(shí)驗(yàn)室　350003)

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一種利用堿裂解法快速篩選重組子的方法

呂新，陳麗華，李玥仁

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所；精密儀器農(nóng)業(yè)測試重點(diǎn)公共實(shí)驗(yàn)室350003)

根據(jù)堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的原理，利用堿裂解法快速篩選到重組子，該方法快迅、準(zhǔn)確，可應(yīng)用于基因克隆中的重組菌落快迅檢測。

堿裂解法；重組子；快速；篩選

基因克隆是現(xiàn)代分子生物學(xué)中一種重要的技術(shù)手段。在基因克隆中，目的基因和載體在體外連接形成重組DNA質(zhì)粒后，將重組DNA質(zhì)粒和感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞相混合，使重組DNA質(zhì)粒進(jìn)入大腸桿菌中，實(shí)現(xiàn)重組DNA質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，并在含有抗生素的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上形成重組子菌落。目前，篩選重組子主要采用遺傳表型檢測法、限制性酶切法和菌落PCR法，但在實(shí)際操作中均存在不盡人意的地方。在遺傳表型檢測過程中，α互補(bǔ)檢測中必須加入的呈色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷(x-gal)和誘導(dǎo)劑異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)價(jià)格昂貴，大量篩選勢必增加實(shí)驗(yàn)成本；限制性酶切法需對(duì)數(shù)10個(gè)菌落進(jìn)行培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切檢測，非常費(fèi)力，甚至使用限制性酶切法常找不到適合用2種或2種以上限制性內(nèi)切酶的緩沖液，必須分步進(jìn)行酶切反應(yīng)；菌落PCR法反應(yīng)易受環(huán)境污染造成假陽性，反應(yīng)條件不合適易造成假陰性，且若沒有可以利用的引物，還需合成引物。鑒于上述問題，筆者在堿裂解法提取質(zhì)粒DNA方法的基礎(chǔ)上[1]，研究出一種操作簡便、方法快速、結(jié)果可靠的重組子快速篩選方法。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株與載體pBluescriptSK(+)質(zhì)粒(3.0 kb，Amp抗性)，DH5α。外源插入片段0.7 kb和1.0 kb，由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所克隆完成。

1.1.2試劑與儀器試劑：Tris、EDTA、RNaseA、SDS、NaOH、溴酚藍(lán)、蔗糖。儀器：電泳儀及電源(北京六一儀器廠)。LB固體培養(yǎng)基、液體均按常規(guī)方法配制。

1.2方法

插入片段的連接、轉(zhuǎn)化按薩姆布魯克等[8]的方法進(jìn)行，37℃倒置培養(yǎng)過夜，待菌落在LB平板上生長至2～3 mm時(shí)，按如下步驟操作：取8 μL懸浮液(50 mmol/L Tris pH 8.0、10 mmol/LEDTA、0.1 mg/mL RNaseA、0.1%溴酚藍(lán))加入到1.5 mL離心管中，再在超凈臺(tái)內(nèi)用10 μL槍頭隨機(jī)挑取LB平板上10個(gè)待檢測菌落，在懸浮液中用移液槍反復(fù)吹打混勻，然后加入8 μL裂解液(200 mmol/L NaOH、0.5%SDS、20%蔗糖)，輕柔吹打混勻，避免產(chǎn)生過多氣泡(容易變得黏稠)，室溫放置3 min，最后取10 μL裂解產(chǎn)物，在1%瓊脂糖凝膠上、110 V電壓下電泳30 min后，使用凝膠成像儀對(duì)瓊脂糖凝膠拍照，根據(jù)質(zhì)粒DNA在瓊脂糖凝膠電泳時(shí)遷移距離的差異，判斷是否為重組子菌落。

2　結(jié)果與分析

2.1快速檢測結(jié)果分析

待檢測重組子菌落質(zhì)粒DNA在瓊脂糖電泳后顯色，可觀察到4條不同電泳位置的DNA條帶，其中第2個(gè)條帶在重組菌落與非重組菌落間存在明顯的位置差異，其他3個(gè)條帶不存在位置差異。由于重組菌落帶有700 bp或1000 bp的插入片段，其質(zhì)粒DNA與非重組質(zhì)粒DNA片段相比較大，在相同時(shí)間的瓊脂糖電泳時(shí)遷移的速率較慢，導(dǎo)致2種不同質(zhì)粒DNA間的位置差異(圖1、圖2)。

2.2優(yōu)缺點(diǎn)分析

目前對(duì)于重組子菌落的篩選主要采用遺傳表型檢測法、限制性酶切法和菌落PCR法。本方法與上述3種方法比較，具有如下優(yōu)點(diǎn)：①檢測方法迅速，只要簡單3步，可以在1 h內(nèi)完成并獲得結(jié)果；②結(jié)果可靠，根據(jù)重組質(zhì)粒DNA與非重組質(zhì)粒DNA片段大小差異來區(qū)分，有效避免PCR法檢測出現(xiàn)假陽性和假陰性的問題[2]；③操作簡單，不要求特殊儀器設(shè)備，只需1個(gè)瓊脂糖電泳儀即可，一般的分子生物學(xué)研究室均具備；④成本低廉，不需要昂貴的X-gal和IPTG試劑[3-7]，可大幅減少檢測成本。

但本方法也具有一定的局限性，如插入片段必須大于200 bp，才能在1%瓊脂糖電泳時(shí)觀察到重組子質(zhì)粒DNA與非重組質(zhì)粒DNA之間明顯的滯后現(xiàn)象；無法直接判斷插入片段方向。

3　小結(jié)

本方法根據(jù)堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的原理，將待檢測重組子菌落懸浮在懸浮液，在裂解液提供的堿性環(huán)境下快速裂解待檢測菌落，并釋放質(zhì)粒DNA。由于重組質(zhì)粒DNA片段較大，在瓊脂糖凝膠電泳時(shí)遷移速度較慢，而非重組質(zhì)粒DNA片段較小，在瓊脂糖凝膠電泳時(shí)遷移速度較快，因此可根據(jù)質(zhì)粒DNA在瓊脂糖凝膠電泳時(shí)遷移距離的差異，判斷是否為重組子菌落。

懸浮液中Tris為質(zhì)粒DNA釋放時(shí)提供穩(wěn)定的pH緩沖環(huán)境；EDTA可以螯合重金屬離子，并抑制DNA酶活性；RNaseA可去除質(zhì)粒DNA中的RNA污染；溴酚藍(lán)在電泳檢測時(shí)起條帶指示作用。裂解液中NaOH為質(zhì)粒DNA釋放時(shí)提供堿性環(huán)境，同時(shí)NaOH和SDS能裂解菌體細(xì)胞壁、在細(xì)胞膜上穿孔，釋放細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒DNA；蔗糖可增加比重，濃縮質(zhì)粒DNA，使點(diǎn)樣后的質(zhì)粒DNA能夠沉于點(diǎn)樣孔中。

此技術(shù)操作簡便、方法快速，能在1 h內(nèi)完成待檢測菌落的檢測和判斷，且檢測過程中不需要x-gal和IPTG等昂貴試劑，結(jié)果的準(zhǔn)確性高于PCR法，檢測時(shí)間比常規(guī)限制性酶切法大幅減少?？蓱?yīng)用于基因克隆中重組菌落快速檢測，特別是在大量篩選重組菌落時(shí)將大幅減少篩選的時(shí)間和檢測成本。

[1]BIRNBOIM H C,DOLY J.A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA[J].Nucleic Acids Res,1979,7(6):1513-1523.

[2]田麗春，黃光瑞，陳亮，等.一種快捷可靠的大腸桿菌重組質(zhì)粒篩選方法[J]. 湖北大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2008(2):202-204.

[3]ITOH M,CARNINCI P,NAGAOKA：S,et al.Simple and rapid preparation of plasmid template by a filtration method using microtiter filter plates[J].Nucleic Acids Res，1997,25(6):1315-1316.

[4]張桂敏，劉振，李春華，等.一種簡便快速篩選重組子的方法[J].湖北大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2005(3):280-281.

[5]崔錦，李林珂，馬向東.一種簡便快速篩選重組子的方法[J].生物技術(shù),2005(6):46-47.

[6]羅文永，陳建偉，劉彥卓，等.快速鑒定陽性重組質(zhì)粒方法的改進(jìn)試驗(yàn)[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2004(2):9-10.

[7]CHOWDHURY E H,AKAIKE T.Rapid isolation of high quality， multimeric plasmid DNA using zwitterionic detergent[J].Journal of biotechnology,2005,119(4):343-347.

[8]薩姆布魯克，魯塞爾，培堂.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].北京：科學(xué)出版社,2002.

(責(zé)任編輯：林蕓菁)

A rapid screening method of recombinant methods by using alkaline lysis

LV Xin, CHEN Li-hua, LI Yue-ren

(InstituteofAgriculturalQualityStandardsandTestingTechnologyofFujianAcademyofAgriculturalSciences;PrecisionInstrumentKeyPublicLaboratoryforAgricultureTest,FujianProvince350003)

According to the principle of alkaline lysis method for extracting plasmid DNA, the recombinants were rapidly screened by using the alkaline lysis method, which is quick and accurate and can be applied in rapid detection of recombinant bacterial colonies in gene cloning.

Alkaline lysis method; recombinant; fast; screening

2016-04-25

呂新，男，1980年生，助理研究員。

李玥仁，男，1966年生，研究員(E-mail:yuerenli@yeah.net)。

福建省公益類青年科研項(xiàng)目(2014R1025-5)。

10.13651/j.cnki.fjnykj.2016.05.005