具有抗菌效應的聚羥基脂肪酸酯生物塑料的制備與功能表征

婁秋莉，馬一鳴，車雪梅，鐘瑾，孫小霞，張浩千

1 福建農(nóng)林大學 生命科學學院，福建 福州 3500022 藍晶 （北京） 生物科技有限公司，北京 1000843 中國科學院微生物研究所，北京 100101

工業(yè)生物技術

具有抗菌效應的聚羥基脂肪酸酯生物塑料的制備與功能表征

婁秋莉1，馬一鳴2，車雪梅2，鐘瑾3，孫小霞1，張浩千2

1 福建農(nóng)林大學 生命科學學院，福建 福州 350002
2 藍晶 （北京） 生物科技有限公司，北京 100084
3 中國科學院微生物研究所，北京 100101

婁秋莉， 馬一鳴， 車雪梅， 等. 具有抗菌效應的聚羥基脂肪酸酯生物塑料的制備與功能表征. 生物工程學報， 2016，32（8）: 1052-1059.

Lou QL， Ma YM， Che XM， et al. Preparation and characterization of polyhydroxyalkanoate bioplastics with antibacterial activity. Chin J Biotech， 2016， 32（8）: 1052-1059.

聚羥基脂肪酸酯 （Polyhydroxyalkanoates， PHAs） 作為一類新型的生物高分子材料，因其多樣的材料性質(zhì)與高度的生物可降解性日益受到關注。使用乳酸鏈球菌素 （Nisin），一種被公認為安全的天然食品防腐劑，制備了具有高效、持久抗菌效應的PHA塑料。首先采用溶劑澆鑄的方法將Nisin整合到正3-羥基丁酸-3羥基己酸共聚酯 （PHBHHx），一種具備高度生物相容性的PHA中，從而獲得了具有抗菌效應的PHBHHx薄膜。激光共聚焦顯微鏡觀察表明Nisin在PHBHHx中呈顆粒狀均勻分布。隨后以條件致病菌藤黃微球菌Micrococcus luteus為測試菌株，通過瓊脂擴散法，測定PHBHHx薄膜抗菌效應對Nisin含量的依賴關系；在液體培養(yǎng)條件下測量PHBHHx薄膜的Nisin釋放效果與抗菌效應。結果表明Nisin可從PHBHHx薄膜順利釋放且Nisin的含量高于25 μg/g時即表現(xiàn)出顯著的抑菌效果且可長時間維持。該研究為工業(yè)化生產(chǎn)具有抗菌效應的PHA奠定了重要的技術基礎，拓展了PHA在醫(yī)學和食品領域的應用潛力。

聚羥基脂肪酸酯，乳酸鏈球菌素，抑菌塑料，藤黃微球菌

隨著石油資源的不斷消耗和石化產(chǎn)品尤其是不可降解的傳統(tǒng)塑料所造成的白色污染日益嚴重，可天然降解的綠色生物塑料正在受到越來越多的關注［1］。不同于生產(chǎn)過程仍需化工縮聚反應的聚乳酸 （Polylactic acid，PLA），聚羥基脂肪酸酯 （Polyhydroxyalkanoates，PHAs） 作為1種新型的可降解生物塑料可由微生物利用可再生的生物質(zhì)原料進行全程的發(fā)酵生產(chǎn)，其環(huán)境污染指數(shù)低，更為環(huán)保［2-3］。更為重要的是，PHA種類繁多 （僅其單體就超過150種），化學性質(zhì)和材料性能差異極大，在不同的環(huán)境中均表現(xiàn)出很高的生物可降解性，其潛在的應用前景因此更為廣泛［4-5］。特別是在醫(yī)療和食品領域，聚 （3-羥基丁酸-3-羥基己酸酯）［6］和聚 （3-羥基丁酸酯-co-4-羥基丁酸酯） （Poly（3-hydroxybutyric acid-co-4-hydroxybutyric acid）， P（3HB-co-4HB））這兩種PHA因其極強的生物相容性和人體可植入性展現(xiàn)出極大的應用潛力，可用作手術縫合線、骨釘、人造骨骼、食品包裝等，其相關研究亟需展開［7-9］。

乳酸鏈球菌素 （Nisin） 是由乳酸乳球菌Lactococcus lactis subsp. lactis產(chǎn)生的一種陽離子多肽，可以有效抑制多種引起食品腐敗和醫(yī)學感染的革蘭氏陽性菌［10-11］，對沙門氏菌Salmonella等部分革蘭氏陰性菌同樣有抑制效果［12］。Nisin可被人體腸道分泌的α-胰凝乳蛋白酶有效降解，因此對人體安全無毒，是目前唯一大規(guī)模商業(yè)化應用的高效天然防腐劑［10，13］，被廣泛應用于歐盟、中國、美國等多個國家和地區(qū)的食品行業(yè)中［14-15］。特別值得注意的是，除了作為食品防腐劑之外Nisin亦可被應用到多種材料中以達到抗菌效果。Qi等［16］利用PEG 1000 將Nisin穩(wěn)固結合到碳納米管上，從而使碳納米管具備了抗菌活性。Jin等［17］則將Nisin整合入聚乳酸 （PLA） 以生產(chǎn)具有抗菌效應的食品包裝袋。進一步研究表明，在帶有Nisin-PLA涂層的牛奶灌裝瓶中，李斯特菌Listeria monocytogenes的生長被顯著抑制，并且抑制效果在 4 ℃保存條件下可維持70 d［18］。

在本試驗中，我們首先利用溶劑澆鑄的方法將Nisin整合入PHA （PHBHHx），從而獲得了具有抗菌效應的PHBHHx薄膜；激光共聚焦顯微鏡的觀察表明Nisin在PHBHHx薄膜內(nèi)部呈顆粒狀均勻分布［19］；隨后的功能實驗表明，僅僅25 μg/g的Nisin濃度就足以使得PHBHHx薄膜對于典型條件致病菌——藤黃微球菌Micrococcus luteus NCIB 8166的生長起到顯著抑制，且抑制效果可長時間持續(xù)。本試驗成功使用乳酸鏈球菌素制備了具有高效、持久抗菌效應的PHA塑料，并且通過詳細的功能表征與顯微鏡觀察，為PHA生物塑料在醫(yī)學與食品領域的應用打下基礎。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株與試劑

用于抗菌效應檢測的菌株為藤黃微球菌M icrococcus luteus NCIB 8166。培養(yǎng)基為SI培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為 30 ℃，靜置或 200 r/m in。PHBHHx塑料粉料由北京藍晶生物科技有限公司提供。乳酸鏈球菌素 （Nisin） 樣品由中國科學院微生物研究所提供，純度為2.5%，剩余雜質(zhì)為無機鹽和蛋白粉。其余所需試劑均購自Sigma-A ldrich公司。

1.1.2含有Nisin的PHBHHx塑料薄膜

選取二氯甲烷作為溶劑澆鑄的溶劑；這是因為二氯甲烷具備化學惰性和高揮發(fā)性且已有工作表明PHA在二氯甲烷中可高效溶解［20］。稱取不同質(zhì)量梯度的Nisin，各自加入一份溶解了1 g PHBHHx粉料的15 m L二氯甲烷中；Nisin樣品的用量分別是0.01、0.1、1、4、16、64和256 mg，換算為 Nisin純凈物則為 0.25 μg、2.5 μg、25 μg、100 μg、400 μg、1.6 mg和6.4 mg（后文中Nisin濃度與用量皆指純凈物）。用磁棒攪拌直至 Nisin樣品粉末完全分散到聚合物溶液中，將混勻的溶液澆鑄到9 cm的玻璃培養(yǎng)皿中，通風櫥內(nèi)靜置24 h。待二氯甲烷完全揮發(fā)，PHBHHx成膜；塑料膜的厚度約1 mm，面積約為63.5 cm2，因此Nisin在薄膜中的分布濃度為（x×2.5%） μg/63.5 cm2即 （x×0.394） μg/cm2，x代表含有 Nisin的混合物樣品的質(zhì)量的數(shù)值 （以mg單位記）。用6 mm直徑的打孔器將塑料膜加工為圓形薄膜，保存在密閉容器中待用。

1.2方法

1.2.1利用瓊脂擴散法測試PHBHHx-Nisin薄膜的抑菌效應

將藤黃微球菌單克隆菌落接種到5 m L SI液體培養(yǎng)基中；30 ℃、200 r/m in條件下培養(yǎng)16 h，獲得種子液 （OD600=1.9）。取500 μL種子液加到50 m L SI固體培養(yǎng)基中，混勻以制備瓊脂擴散法所需的平板，每個平板含有約25 m L的SI固體培養(yǎng)基。將6 mm直徑的 PHBHHx-Nisin圓形薄膜平放在 SI固體培養(yǎng)基表面，每種 Nisin含量的薄膜有6個重復，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h；對照組為不含Nisin、等直徑的PHBHHx薄膜。用卡尺測量每個抑菌圈的大小并記錄。

1.2.2Nisin在PHBHHx薄膜中的物理分布

將直徑6 mm的PHBHHx-Nisin薄膜固定在載玻片上，Nisin的濃度分別為 100 μg/g和25 μg/g。PHBHHx-NaCl薄膜和PHBHHx薄膜分別作為對照組；PHBHHx-NaCl薄膜中的NaCl濃度為0.975 mg/g （與25 μg/g Nisin含量的膜片所對應的非Nisin量相同）。采用Leica TCS SP2激光共聚焦顯微鏡，層掃觀察 Nisin的分布情況。Nisin在425 nm波長的激發(fā)光 （EX） 下可發(fā)出475 nm波長 （EM） 的自發(fā)熒光［17］。

1.2.3液體培養(yǎng)條件下測量PHBHHx-Nisin的抑菌效應

獲得種子液的方法同瓊脂擴散法。所用Nisin的濃度為100、25和2.5 μg/g。將種子液稀釋104倍，即每毫升稀釋過的菌液約含105個菌落形成單位 （Colony-form ing unit，CFU），加入3片加工好的PHBHHx-Nisin薄膜到5 m L SI液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/m in培養(yǎng)。每隔一段時間取樣，從培養(yǎng)液中取出200 μL菌液測量OD600，根據(jù)OD600數(shù)值用新鮮的SI培養(yǎng)基將取出樣品進行不同倍數(shù)的稀釋后涂板，30 ℃靜置培養(yǎng)20 h后計算活菌數(shù)目得出統(tǒng)計結果。每種Nisin含量的薄膜進行3次實驗重復，對照組為不含Nisin的PHBHHx薄膜和不含Nisin的紙片。

2　結果與分析

2.1瓊脂擴散法測定PHBHHx-Nisin薄膜的抑菌效應

藤黃微球菌是一種廣泛分布于空氣、土壤、水及動植物表面的條件致病菌，被用作抑菌素（如 Nisin） 的指示菌株［21-22］。使用紙片和不含Nisin的PHBHHx薄膜的對照組并沒有抑菌效應（圖1A和圖1B的0 μg/g），說明抑菌效應的來源正是Nisin。Nisin含量達到25 μg/g以上時表現(xiàn)出穩(wěn)定大小的抑菌圈 （圖 1A）；Nisin含量在2.5 μg/g及以下時的抑菌效果則不穩(wěn)定 （圖1B）；這暗示Nisin在PHBHHx薄膜內(nèi)部的分布并不均勻，因此Nisin濃度越低則抑菌效果平行性越差。隨著Nisin濃度的增加，PHBHHx薄膜抑菌效果顯著增強，詳細統(tǒng)計的變化趨勢見圖2。

圖1　瓊脂擴散法測量含有乳酸鏈球菌素的PHBHHx膜片的抑菌效應Fig. 1 Antibacterial activity of Nisin-embedded PHBHHx films quantified using agar diffusion method. （A）Inhibition of M icrococcus luteus （NCIB 8166） grow th using PHBHHx films containing Nisin at six different concentrations （0， 25， 100， 400， 1 600， and 6 400 μg/g， respectively）. （B） The inhibitory effect of PHBHHx films containing Nisin at three different concentrations （0， 0.25， and 2.5 μg/g， respectively）. The diameter of the films is 6 mm.

2.2Nisin在PHBHHx薄膜中的物理分布

圖3展示了100 μg/g和25 μg/g兩種Nisin濃度的PHBHHx薄膜的顯微成像結果。圖中的綠色亮點即為Nisin蛋白質(zhì)顆粒的自發(fā)熒光，直徑約10-70 μm，密度隨摻入的Nisin濃度增加而增大。圖中直徑較大的暗色斑點可能是隨Nisin一起摻入的無機鹽等雜質(zhì)：僅向PHBHHx中摻入NaCl即可使其具有相同的顯微特征 （結果未列出）。

圖2　PHBHHx膜片抗菌效應對Nisin含量的依賴關系Fig. 2 Nisin-dependent antibacterial activity of PHBHHx films. The Nisin concentrations are 0.25， 2.5，25， 100， 400， 1 600 and 6 400 μg/g， respectively. Error bars represent the standard deviation of the mean from six separate tests.

2.3PHBHHx薄膜中Nisin的釋放情況

圖3　激光共聚焦顯微鏡觀察Nisin顆粒在PHBHHx膜片內(nèi)部的物理分布Fig. 3 The distribution of Nisin particles in PHBHHx matrices imaged by confocal laser m icroscopy in cross-section view. The green dots are Nisin particles. （A） 25 μg/g Nisin. （B） 100 μg/g Nisin.

根據(jù)瓊脂擴散法的實驗測量結果，選取 4 種 Nisin濃度 （100、25、2.5、0.25 μg/g） 的PHBHH x薄膜做液體培養(yǎng)抑菌實驗。將PHBHHx-Nisin薄膜加到藤黃微球菌生長所需的SI液體培養(yǎng)基中進行細菌培養(yǎng)，在特定時間點取樣后用新鮮SI培養(yǎng)液將樣品稀釋不同的倍數(shù)后涂板，30 ℃靜置培養(yǎng)20 h，統(tǒng)計平板上的活菌數(shù)目。結果圖4所示，對照組 （加入了不含Nisin的PHBHHx薄膜的培養(yǎng)基） 在培養(yǎng)22 h時達到穩(wěn)定期 （約8.8 log CFU/m L）。含有2.5 μg/g PHBHHx-Nisin薄膜的樣品中，菌的密度在早期生長中急速下降約 3個數(shù)量級，原因可能是大量菌體被薄膜釋放的Nisin殺死；但由于含量不高的Nisin被耗盡，少數(shù)幸存的活菌導致8 h后菌體密度迅速上升，在22 h也達到了穩(wěn)定期 （圖4）。25 μg/g與100 μg/g的PHBHHx-Nisin薄膜所在培養(yǎng)液沒有出現(xiàn)藤黃微球菌菌體復蘇的現(xiàn)象，說明薄膜釋放的 Nisin可以在細菌生長早期就將其完全殺滅 （圖 4）。這些結果證明了分布在薄膜中的 Nisin可以被順利釋放出來且抑菌效應能得到長時間的維持。

圖 4 液體培養(yǎng)條件下 PHBHHx-Nisin膜片的抗菌活性隨時間的變化Fig. 4 Inhibitory effect of PHBHHx-Nisin on the grow th of Micrococcus luteus in liquid media. Note that when Nisin concentration is higher than 25 μg/g，the bacterial grow th was inhibited throughout the incubation time， so the corresponding curves overlap w ith the horizontal axis. Error bars represent the standard deviation of the mean from three separate tests.

3　討論

本研究首次將 Nisin經(jīng)過溶劑澆鑄的方法嵌入到PHBHHx中，使得PHBHHx具有抗菌活性，其生產(chǎn)方法簡便，極易應用于工業(yè)放大。當前國內(nèi)外的同類研究將目光集中在 PLA和PBS系列的生物塑料上，而針對性能更為多樣化、生物降解性與相容性更高的PHA系列的工作則是空白。為了進一步說明本文方法對于PHA系列的通用性，我們采用另外 3種 PHA （PHB、PHBV、P3HB4HB） 分別制備了PHB-Nisin、PHBV-Nisin與P3HB4HB-Nisin共3種抗菌PHA材料，并進行了瓊脂擴散法實驗。實驗結果表明，雖然不同的材料間表現(xiàn)出一定的差異，但3種含有Nisin的PHA材料均呈現(xiàn)出靈敏的、顯著的抗菌活性 （結果未列出）。

Nisin可以通過共價和非共價的方式整合到其他介質(zhì)中?？紤]到Nisin需要被充分釋放才能最大程度發(fā)揮抑菌活性，因此我們選擇溶劑澆鑄這一非共價結合的方法將 Nisin整合到 PHA中。本研究中 Nisin以“不溶顆粒”的形式混在PHA中；實驗結果也表明利用此種方法，在5 m L液體培養(yǎng)基中僅僅 0.33 μg的 Nisin （換算為Nisin濃度則為 0.07 μg/m L） 就足以抑制細菌的生長；這是截止到目前已報道的抑菌活性最高的抗菌塑料。

驗證 PHA-Nisin薄膜在液體培養(yǎng)條件下的抑菌情況時我們觀察到，25 μg/g和 100 μg/g Nisin含量的 PHA薄膜在藤黃微球菌生長初期就沒有了生長跡象。然而，當 Nisin的含量為2.5 μg/g時，在生長前8 h活菌數(shù)急劇下降后，菌體密度反而出現(xiàn)復蘇現(xiàn)象。這說明此時被釋放到液體中的Nisin尚不足以殺滅全部的菌體，且后續(xù)釋放乏力。因此，2.5 μg/g的Nisin含量對于液體培養(yǎng)條件下的抑菌來說是不夠的。關于固體與液體之間的抑菌濃度差別，有兩個潛在的影響因素：一是Nisin的擴散方式不同，在液體振蕩的條件下Nisin比在固體平板上更容易擴散稀釋；二是不同的生長條件導致細菌的代謝物不同，而后者會顯著影響Nisin的活性［23］。

Nisin是由 34個氨基酸組成的、硫醚鍵形成 5個內(nèi)環(huán)的短肽，常為二聚體或四聚體［24］。Nisin作為食品防腐劑的實踐經(jīng)驗表明其在偏酸性條件下保存時間長，高壓處理后活性保持良好，在合適的條件下甚至可以忍受一定程度的高溫。前人報道，在pH 5-7時，經(jīng)歷巴氏消毒后Nisin可保持至少80%的活性［10］。在偏酸性條件下，常規(guī)高壓蒸汽滅菌后Nisin的活性仍能保持 50%以上；一些 Nisin突變體甚至可以忍受100 ℃及以上的高溫處理10 m in而保持80%抑菌活性［25］。這些物理條件符合工業(yè)實踐中PHA的加工窗口，因此抗菌PHA塑料的工業(yè)生產(chǎn)過程Nisin的降解失活很可能不是難題。

本研究為工業(yè)化生產(chǎn)具有抗菌效應的生物可降解塑料PHA提供了重要參考。特別值得注意的是，這里使用Nisin這一被公認為安全食品防腐劑的天然產(chǎn)物作為抗菌成分，可以有效遏制食品腐敗菌和條件致病菌的生長。因此抗菌PHA塑料在醫(yī)學和食品領域可預見的應用范圍相當可觀，包括食品包裝袋、飲水機接口、電冰箱內(nèi)置塑料等等。

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（本文責編 郝麗芳）

November 17， 2015； Accepted: February 1， 2016

Preparation and characterization of polyhydroxyalkanoate biop lastics w ith antibacterial activity

Qiu li Lou1, Yim ing M a2, Xuem ei Che2, Jin Zhong3, Xiaoxia Sun1, and Haoqian Zhang2

1 College of Life Sciences， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350002， Fujian， China
2 BluePHA (Beijing) Co.， Ltd， Beijing 100084， China
3 Institute of Microbiology， Chinese Academy of Sciences， Beijing 100101， China

Polyhydroxyalkanoates （PHAs）， as a novel class of biopolymer， are attracting more attention due to their diverse material properties and environment-independent biodegradability. Here we report the preparation of PHA exhibiting efficient antibacterial activity by embedding Nisin， a food additive generally recognized as safe， into poly（3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate） （PHBHHx）， a type of PHA w ith high biocompatibility. We first prepared Nisin-containing PHBHHx films using solvent casting method. Confocal laser scanning m icroscopy analysis showed that a well-mixed integrated structure of the films w ith an even distribution of the Nisin particles in the PHBHHx matrices. Then the antim icrobial activity of PHBHHx/Nisin films against M icrococcus luteus was quantified on agar plate by measuring the size of inhibition zone. Cultivation in liquid media further confirmed the releasing of Nisin from the films and the long-time antibacterial activity. Results showed that the threshold of Nisin concentration for long-time and effective inhibition against bacteria grow th is 25 μg/g. These results altogether establish a technological foundation for the application of PHA in biomedicine and food industry.

polyhydroxyalkanoate， Nisin， antibacterial plastics， M icrococcus luteus

Corresponding authors: Xiaoxia Sun. Tel: +86-591-83789367； E-mail: joesxiaox@163.com Haoqian Zhang. Tel: +86-10-62757544； E-mail: zhanghaoqian@bluepha.com