家蠶血淋巴體外黑化觀察及相關黑色素合成催化酶基因

李田，張亮，申琦，趙威，李黎，呂銀，蔣貴兵，閆登峰，肖俊杰，陳萍

1 西南大學 生物技術學院，重慶 4007162 重慶市蠶業(yè)管理總站，重慶 400716

農(nóng)業(yè)生物技術

家蠶血淋巴體外黑化觀察及相關黑色素合成催化酶基因

李田1，張亮1，申琦1，趙威1，李黎1，呂銀1，蔣貴兵2，閆登峰1，肖俊杰1，陳萍1

1 西南大學 生物技術學院，重慶 400716
2 重慶市蠶業(yè)管理總站，重慶 400716

李田， 張亮， 申琦， 等. 家蠶血淋巴體外黑化觀察及相關黑色素合成催化酶基因. 生物工程學報， 2016， 32（8）: 1093-1103.

Li T， Zhang L， Shen Q， et al. In vitro observation of haemolymph melanization and melanin-related biosynthesis enzyme genes in silkworm， Bombyx mori. Chin J Biotech， 2016， 32（8）: 1093-1103.

觀察不同生長期家蠶幼蟲血淋巴在體外的黑化速度和對大腸桿菌生長的影響結(jié)果顯示，隨食桑生長幼蟲血淋巴的黑化速度逐漸變快，對大腸桿菌生長的抑制作用逐漸增強。RT-PCR實驗顯示，黑色素合成催化酶BmTan、BmPo-1、BmYellow-f和BmDdc等的基因在家蠶5 L 3 d血淋巴中表達量高，BmBlack、BmYellow 和BmPah等的基因也有明顯表達。qPCR分析顯示，黑化病蠶中Bmtan、Bmddc、Bmyellow、Bmebony和Bmblack，尤其Bmddc表達發(fā)生了顯著上調(diào)。與對照相比，Ddc酶的抑制劑能顯著抑制脂多糖對血淋巴的誘導黑化作用。用大腸桿菌注射家蠶幼蟲，血淋巴中多巴和多巴胺的含量明顯上升。這些表明家蠶幼蟲血淋巴黑化與防御免疫有關，Bmddc很可能在幼蟲血淋巴的免疫黑化中發(fā)揮作用。

家蠶血淋巴，黑化反應，黑色素合成催化酶，免疫應答

昆蟲是地球上最龐大的生物種群，分布于除深海外的各種自然環(huán)境中［1］，具有極強的環(huán)境適應能力和防御免疫能力。昆蟲為開放式血液循環(huán)，所有組織器官浸浴在血淋巴中，當外源物攻破昆蟲體壁這個物理屏障后，首先面對的是血淋巴，血淋巴是昆蟲免疫防衛(wèi)的重要組織。昆蟲免疫防御中常有黑化現(xiàn)象。黑色素形成過程中產(chǎn)生的自由氧 （ROI）、自由氮 （RNI） 以及醌類等多種有毒分子物質(zhì)，對核酸、蛋白質(zhì)和細胞膜等有破壞作用［2-3］。在昆蟲體內(nèi)被黑化的細菌置于固體培養(yǎng)基上幾乎不會生長［4］，注入煙草天蛾Manduca sexta體內(nèi)的熒光微球體被血淋巴黑化包裹［5］，用含大腸桿菌Escherichia coli或金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus的鎢絲針穿刺黑腹果蠅Drosophila melanogaster胸部，傷口處的細菌被黑化［6］。埃及伊蚊Aedes aegypti中發(fā)現(xiàn)的免疫黑化蛋白酶 （Immune melanization proteases，IMP-1和IMP-2） 可以通過調(diào)控血淋巴黑化來抑制病原物生長［7］。這些表明，黑化反應不僅是昆蟲免疫應答的一個伴隨現(xiàn)象，而且是昆蟲進行免疫防衛(wèi)的一種手段。

家蠶Bombyx mori是重要的經(jīng)濟昆蟲，也是研究鱗翅目的模式昆蟲，有關家蠶的免疫防御機制受到高度關注。在免疫黑化方面，許平震等［8］克隆鑒定出家蠶14個模式識別受體編碼基因，其中包括10個肽聚糖識別蛋白 （PGRP） 基因和4個β-葡聚糖識別蛋白 （βGRP） 基因。趙萍等［9］從家蠶基因組上共鑒定了 143個家蠶絲氨酸蛋白酶基因，80種絲氨酸蛋白酶抑制劑基因。最近徐曼等［10］認為Bm lz基因能夠通過誘導酚氧化酶原的表達增強血淋巴黑化作用。這些研究多集中于黑色素合成上游酚氧化酶原級聯(lián)反應及調(diào)控過程。對于黑色素合成下游相關催化酶基因的研究，在所有昆蟲中果蠅Drosophila研究的最為清楚［11］。2011年于紅松等［12］通過生物信息學方法從家蠶基因組中搜索到與果蠅同源的 9個黑色素合成途徑相關基因并進行了鑒定與分析。有研究證明家蠶黑色素代謝途徑上催化酶酪氨酸羥化酶 （Tyrosine hydroxylase，Th）、 N-β-丙酰多巴胺合成酶 （N-βalanyldopam ine synthetase，Ebony）、N-β-丙酰多巴胺水解酶 （N-β-alanyldopam ine hydrolase，Tan）、芳香烷基N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（Arylalkylam ine-N-acetyl transferase，Dat）、苯丙氨酸羥化酶 （Phenylalanine hydroxylase，Pah）和鳥苷三磷酸環(huán)化水解酶 （Guanosine triphosphate cyclohydrolase，GTPCH I） 等編碼基因的表達與體壁斑紋黑色素的形成及沉積相關［13-18］。本研究調(diào)查了不同生長期家蠶幼蟲血淋巴的黑化能力及其免疫防衛(wèi)能力，分析了黑色素合成催化酶基因及其編碼產(chǎn)物與家蠶血淋巴免疫的關系，為進一步全面揭示家蠶免疫防御機制提供更多的信息和基礎。

1　材料與方法

1.1供試材料

供試家蠶品種大造 （由本實驗室保存），幼蟲常規(guī)條件下用桑葉飼養(yǎng)。大腸桿菌為本實驗室保存菌種，實驗中使用的大腸桿菌為過夜活化的新鮮菌液 （OD600約為0.8）。

1.2總RNA的提取、cDNA合成及引物設計

參照Trizol （Invitrogen公司） 試劑盒說明書提取總RNA。將組織用液氮研磨后加入Trizol，室溫放置5 m in充分裂解后12 000 r/m in離心5 m in，取上清并加入200 μL氯仿振蕩混勻，放置10 m in后12 000 r/m in離心15 m in，吸取上層水相并加入 500 μL異丙醇混勻，室溫放置15 m in后12 000 r/m in離心10 m in，棄上清，RNA沉淀用75%乙醇洗滌2次，室溫晾干后用DEPC水溶解RNA沉淀，利用微量紫外分光光度計測定RNA濃度。利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶 （Promega公司），合成cDNA第一鏈［19］?；诩倚Q基因組數(shù)據(jù)庫設計引物，引物序列見表1，實驗用引物均由上海生物工程技術服務有限公司合成。

1.3RT-PCR分析

PCR反應條件：94 ℃預變性4 m in；94 ℃變性40 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，33個循環(huán)；72 ℃延伸10 m in，12 ℃保存。對PCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色觀察。

1.4熒光定量PCR檢測

利用家蠶轉(zhuǎn)錄起始因子4A基因（BGIBMGA003186） 作為內(nèi)參。熒光定量 PCR反應儀器為ABI7500Fast，反應體系為20 μL，熱啟動程序為95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，共40個循環(huán)。其中每個模板進行3次重復實驗，將獲得的數(shù)據(jù)采用 2-ΔΔCt法進行基因相對表達分析。

1.5HPLC測定多巴和多巴胺含量

多巴、多巴胺樣品制備：收集家蠶血淋巴并加入等體積鹽酸緩沖液。在4 ℃、10 000 r/m in條件下離心10 m in后取上清液煮沸10 min，冷卻后加入等體積氯仿并顛倒混勻，4 ℃、10 000 r/min離心15 m in，取上清液過濾 （0.22 μm濾膜） 后作為上機樣品。

表1　引物序列Tab le 1 Prim er sequences

HPLC測定條件：色譜柱為C18柱，流動相為甲醇-水 （體積比為8∶100），流速為0.8 m L/min。物質(zhì)檢測的激發(fā)波長為 280 nm，吸收波長為320 nm，檢測溫度為30 ℃。

標準曲線繪制：先制備質(zhì)量濃度為1 g/L母液，再將母液稀釋成不同濃度梯度后上機，根據(jù)濃度梯度和對應的峰面積做標準曲線。多巴和多巴胺標準品測得 R2值分別為 0.999和0.996，說明標準曲線的擬合度較好 （圖1），可以用于實驗測定。

多巴、多巴胺含量計算：采用峰保留值比較法和疊加法進行定性分析，利用外標法測峰面積對應標樣的回歸方程計算含量。

1.6大腸桿菌生長觀察

圖1　多巴 (A)、多巴胺 (B) 標準曲線Fig. 1 Dopa and Dopam ine standard curve. （A） Dopa. （B） Dopam ine.

在毛細針中將家蠶血淋巴與大腸桿菌新鮮菌液混合 6 h后通過無菌空氣盡可能把其中所有液體打出涂板，37 ℃人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，統(tǒng)計菌落數(shù)。每組實驗重復3次。

2　結(jié)果與分析

2.1不同齡期家蠶血淋巴體外黑化觀察

我們選取4齡第1天至5齡第6天的幼蟲來調(diào)查家蠶不同生長時期血淋巴黑化是否有差異，以及在不同保護溫度下血淋巴黑化是否有差異。觀察仍在毛細針中進行［20］，血淋巴體積為10 μL。

對于4齡期共4 d的血淋巴來說 （圖2A），體外放置0.5 h時均保持透明狀態(tài)；放置12 h時，4齡第1天 （4 L 1 d） 的血淋巴仍保持透明狀態(tài)，但4 L 2 d的血淋巴能在毛細針粗端看到顏色略微加深，且4 L 3 d和4 L 4 d的血淋巴能在毛細針粗端看到明顯黑褐色；放置24 h時，4 L 1 d的血淋巴就能看到毛細針粗端顏色加深，4 L 2 d、4 L 3 d和4 L 4 d的血淋巴有明顯的黑褐色，并有隨幼蟲食桑生長經(jīng)過時間增加黑化程度更強的趨勢。

對于5齡期共6個不同生長時間的幼蟲血淋巴，體外放置0.5 h時，除低溫4 ℃保持透明狀態(tài)外，在室溫和高溫37 ℃保護的毛細針粗端均出現(xiàn)明顯的黑褐色，且黑褐色隨幼蟲經(jīng)過時間增加逐漸加深并向毛細針細端擴展；放置12 h時，除5 L 1 d在4 ℃保護的血淋巴未見明顯變色外，其他樣品都有明顯的黑褐色，并有隨幼蟲食桑生長和樣品的保護溫度提高、血淋巴變黑程度越深范圍越廣的初步特征；放置24 h時，所有血淋巴樣品都見黑褐色，從5齡初到5齡盛食期以及5齡上蔟前，血淋巴黑化程度和黑化范圍隨幼蟲經(jīng)過時間逐步變得更深更廣，這個現(xiàn)象特征比前面更加明顯突出 （圖2B）。

圖 2 毛細針管內(nèi)不同齡期家蠶血淋巴黑化的過程觀察Fig. 2 M elanization of haemolymph using different instars of silkworm in the capillary w ith time. （A） Days 4th instar larvae haemolymph. （B） Days 5th instar larvae haemolymph. RT: room temperateure.

總之，血淋巴在毛細針中的黑化速度和程度與家蠶幼蟲不同生長時期以及保護溫度都有明顯關系。5齡期的血淋巴比4齡期的黑化快；同一齡期內(nèi)，齡初的血淋巴黑化較慢，齡末的血淋巴黑化較快；低溫 4 ℃保護的血淋巴變黑速度最慢，其次是室溫，37 ℃黑化最快。

2.2不同齡期家蠶血淋巴對大腸桿菌生長的影響

為了探究家蠶血淋巴黑化作用的強弱與其殺滅外源微生物的能力是否相關，我們根據(jù)前面不同生長期幼蟲血淋巴的體外黑化觀察實驗，分別選取4 L 3 d和5 L 6 d兩個齡期的幼蟲血淋巴進行實驗。用7.5 μL血淋巴與2.5 μL大腸桿菌混合6 h后，觀察大腸桿菌生長狀況。同等條件下用7.5 μL PBS緩沖液 （pH 7.4） 代替家蠶血淋巴作對照。大腸桿菌與4 L 3 d幼蟲血淋巴混合反應6 h后，平均菌落數(shù)為32個，與5 L 6 d家蠶血淋巴混合后平均菌落數(shù)為 8個，與 PBS混合 （對照） 后的平均菌落數(shù)為51個。大腸桿菌與家蠶血淋巴混合后生長受到抑制，菌落數(shù)目明顯減少，達到統(tǒng)計學上的顯著性；黑化較強的5 L 6 d家蠶血淋巴對大腸桿菌生長的抑制作用比黑化較弱的4 L 1 d血淋巴的抑制作用更強、效果更好，它們之間的差異達到統(tǒng)計學上的極顯著水平。結(jié)果如圖 3所示。這些暗示家蠶幼蟲血淋巴的黑化作用與防御免疫作用有關。

2.3血淋巴中黑色素合成相關催化酶基因表達分析

圖 3 不同齡期家蠶血淋巴對體外培養(yǎng)大腸桿菌增殖的影響Fig. 3 Influence of haemolymph using different instars of silkworm on the proliferation of Escherichia coli cultured in vitro. （A） The statistical analysis on the bacteria colonies between 4 L 3 d instar larvae haemolymph and 5 L 6 d instar larvae haemolymph. *P＜0.05， **P＜0.01 and ***P＜0.001. （B） Direct-view ing the bacteria colonies.

圖4　黑色素合成相關催化酶基因在5 L 3 d家蠶血淋巴中的表達模式Fig. 4 Expression pattern of enzyme genes related to melanin biosynthesis in 5 L 3 d instar larvae haemolymph.

黑色素合成需要多個步驟、多個酶參與一系列催化反應，其中各個步驟的催化酶是黑色素合成的關鍵。家蠶造血器官功能發(fā)揮在5 L 3 d有一個高峰［21］。我們用RT-PCR分析5 L 3 d家蠶血淋巴中目前已報道的與黑色素合成相關的 Bmpah、Bmth、Bmblack、Bmyellow、Bmyellow-f、Bmdat1、Bmebony、Bmtan、Bmpo-1和Bmddc等10個基因的表達量。結(jié)果顯示 （圖 4），Bmtan （283 bp）、Bmpo-1 （500 bp）、Bmyellow-f （549 bp） 和Bmddc （663 bp） 等4個基因在正常血淋巴中均有高量表達，Bmblack （487 bp）、Bmyellow （464 bp） 和Bmpah （566 bp） 等 3個基因有清楚的擴增帶，未發(fā)現(xiàn)Bmth、Bmebony和Bmdat1等3個基因明顯的擴增帶。

2.4黑色素合成催化酶基因在黑化病蠶與正常蠶之間的表達差異分析

被蠅蛆寄生的家蠶，體壁上都有一個病原物進入體腔的黑色創(chuàng)口 （圖5A）。發(fā)病嚴重的幼蟲通體透出黑褐色，體腔內(nèi)所有組織器官浸浴在黑褐色體液中，有腐爛趨勢，容易斷離。

為了探究黑化病蠶與黑色素合成催化酶基因是否有關，我們選取 5齡相同生長期的健康幼蟲 （熟蠶） 和被蠅蛆寄生通體透出黑褐色的幼蟲 （圖5B），用q-PCR比較相關黑色素合成催化酶基因的表達差異。結(jié)果顯示，Bmpah、Bmth、Bmblack、Bmddc、Bmyellow和Bmebony等6個基因在兩種蠶體中的表達量均發(fā)生明顯變化。除Bmpah在黑化病蠶中的表達量減少外，其余5個基因的表達水平在黑化病蠶中顯著增加，尤其是Bmddc表達發(fā)生顯著上調(diào)，表明黑化的病蠶能夠引起黑色素代謝相關基因表達量的變化。

圖5　正常上蔟蠶和黑化病蠶圖Fig. 5 Normal and black disease silkworm larval. （A）The early stage of silkworm being bit by flies. （B） The later stage of silkworm being bit by flies. The red arrow refers to flies bites.

圖 6 黑化病蠶中黑色素合成相關催化酶基因的表達分析Fig. 6 Effects of black disease silkworm on the relative expression of enzyme genes related to melanin biosynthesis. *P＜0.05， **P＜0.01 and ***P＜0.001，compared to the relative expression in normal silkworm.

2.5多巴脫羧酶 (Ddc) 抑制劑對血淋巴黑化的影響

多巴脫羧酶 （Ddc） 基因在5 L 3 d家蠶血淋巴中高量表達，在黑化病蠶中相比正常蠶體表達上調(diào)極顯著。為了探究 Ddc是否在家蠶血淋巴黑化中發(fā)揮催化作用，我們用 Ddc酶活性的特異抑制劑卡比多巴 （大連美侖） 來進行實驗。革蘭氏陰性菌胞壁主要成分脂多糖 （LPS，Sigma） 能夠迅速誘導家蠶體外血淋巴發(fā)生黑化反應［20］。用5 L 3 d家蠶血淋巴7.5 μL與2.5 μL卡比多巴 （10 mg/m L，PBS為溶劑） 及2.5 μL LPS （1 mg/m L） 混合，PBS代替卡比多巴作為對照。觀察記錄時間點為混合后0、0.5、24 h。

由圖7中我們可以看出0 h時兩組毛細針中血淋巴呈透明狀，幾分鐘后PBS組毛細針粗端能看到顏色稍有加深，0.5 h后LPS誘導血淋巴明顯變黑，而加入卡比多巴的毛細針在0.5 h才見粗端血淋巴顏色有微弱加深，在24 h時PBS組整個毛細針管中血淋巴變?yōu)楹诤稚⒅饾u向細端延伸，而加入卡比多巴的血淋巴在24 h時呈黃色，整個過程中沒有出現(xiàn)血淋巴黑化現(xiàn)象。表明卡比多巴能夠抑制家蠶血淋巴黑化作用，即Ddc與家蠶血淋巴黑化作用有關。

2.6血淋巴中多巴 (Dopa) 和多巴胺(Dopam ine)含量

Ddc是使Dopa轉(zhuǎn)化成Dopam ine的重要催化酶［22］。Dopa和Dopam ine是黑色素合成的重要前驅(qū)物，對微生物的生長具有抑制作用［20］。用5 μL大腸桿菌注射5 L 3 d家蠶，然后用HPLC檢測幼蟲血淋巴中Dopa和Dopam ine含量，檢測時間為注射后6 h和24 h。以PBS代替大腸桿菌注射幼蟲為對照。每組重復3次，Dopa和Dopam ine含量是3次結(jié)果的平均。

圖7　卡比多巴對家蠶血淋巴黑化的影響Fig. 7 Influence of carbidopa on melanization of silkworm haemolymph.

圖8　多巴和多巴胺的色譜圖Fig. 8 Chromatograms of Dopa and Dopam ine. （A） The standards. （B） The experimental group.

圖 9 大腸桿菌感染后血淋巴中多巴和多巴胺含量檢測Fig. 9 Dopa and Dopam ine content detection in silkworm haemolymph induced by Escherichia coli. （A） Dopa. （B） Dopam ine.

正常條件下家蠶體內(nèi) Dopa含量遠遠高于Dopamine含量。未注射 （對照組） 時家蠶體內(nèi)Dopa和Dopam ine含量保持穩(wěn)定；注射PBS后6 h，Dopa和Dopam ine含量均明顯降低，且24 h時基本恢復正常水平；注射大腸桿菌后6 h相比PBS組來說，Dopa含量升高了88.5%，Dopam ine含量升高了2.3倍，24 h時Dopam ine含量恢復正常而Dopa含量相比PBS組降低了59.0%。

3　討論

不同生長期家蠶幼蟲的血淋巴在體外黑化的速度不同：5齡幼蟲血淋巴比4齡的黑化速度快，同一齡期內(nèi)末齡幼蟲血淋巴比齡初幼蟲血淋巴黑化快。4 L 3 d和5 L 6 d的幼蟲血淋巴對大腸桿菌生長均有抑制作用，其中5 L 6 d的幼蟲血淋巴抑制作用比4 L 3 d更強。這些表明隨家蠶幼蟲食桑生長，血淋巴黑化速度變快，其防御免疫能力變強。這與先前認為家蠶幼蟲對病原物的抵抗能力隨生長發(fā)育增強的主要原因是由于體重的增加稀釋了病原物而引起的觀點［23］不一致。

家蠶幼蟲生長發(fā)育到5齡第3天，其造血器官功能發(fā)揮達到頂峰，此時血淋巴中基因的表達情況與血淋巴功能的發(fā)揮可能具有聯(lián)系。RT-PCR實驗顯示，黑色素合成催化酶Bm Tan、BmPo-1、BmYellow-f和BmDdc等的基因在家蠶5 L 3 d血淋巴中有較高的表達，Bm Black、BmYellow和BmPah等的基因在5 L 3 d血淋巴中也有明顯表達。差異分析顯示，黑化病蠶中Bm tan、Bmddc、Bmyellow、Bmebony和Bmblack，尤其Bmddc表達發(fā)生了顯著上調(diào)。這些基因在其他昆蟲的免疫黑化研究中也有報道，如苯丙氨酸羥化酶基因 （pah） 和 ddc在埃及伊蚊 Ae. Aegypti和騷擾阿蚊Armigeres subalbatus［24-25］、酪氨酸羥化酶基因 （th） 在甜菜夜蛾Spodoptera exigua［26］、N-β丙酰多巴胺合成酶基因 （ebony）和 ddc在地中海實蠅 Ceratitis capitata［27-28］、ebony在擬步行蟲Tenebrio molitor［27］等。

Ddc酶的抑制劑能顯著抑制LPS對血淋巴的誘導黑化作用，說明 Ddc酶與家蠶血淋巴免疫黑化作用有關。BmDdc定位于家蠶BmN細胞中靠近核周圍的細胞質(zhì)中［29］。地中海實蠅中的ddc參與先天免疫反應，調(diào)控血細胞的吞噬、小結(jié)和黑化作用［28］。結(jié)合Bmddc在家蠶5 L 3 d血淋巴中高量表達以及在黑化病蠶中表達顯著上調(diào)，我們認為，Bmddc在家蠶血淋巴的免疫黑化中扮演了重要角色。

Dopa和 Dopam ine是黑色素合成的重要前體物質(zhì)，能有效抑制大腸桿菌的生長［20］。當大腸桿菌注射家蠶后6 h，這兩種物質(zhì)在血淋巴中的含量明顯上升，暗示這兩種物質(zhì)與幼蟲血淋巴免疫相關。當侵染24 h后，Dopam ine含量恢復正常，而Dopa含量明顯低于正常。我們猜測：當家蠶血淋巴受到浸染時，免疫應答系統(tǒng)啟動黑色素合成，Dopa和 Dopam ine作為合成黑色素的重要原料被大量生產(chǎn)，導致含量上升；隨著體內(nèi)病原物減少，血淋巴的免疫應答機制逐漸停止，最終恢復常態(tài)，由于在黑色素合成中Dopa比 Dopam ine有更多的消耗途徑，致使侵染24 h后血淋巴中Dopa含量還未恢復常態(tài)。

REFERENCES

［1］ Lu XF， Yang XY， Cheng JQ， et al. Progresses in insect antimicrobial peptides. Acta Pharm Sin，1999， 34（2）: 156-160 （in Chinese）.

盧曉風， 楊星勇， 程驚秋， 等. 昆蟲抗菌肽及其研究進展. 藥學學報， 1999， 34（2）: 156-160.

［2］ Nappi AJ， Christensen BM. Melanogenesis and associated cytotoxic reactions: applications to insect innate immunity. Insect Biochem Mol Biol，2005， 35（5）: 443-459.

［3］ Herrera-Ortíz A， Lanz-Mendoza H， Martínez-Barnetche J， et al. Plasmodium berghei ookinetes induce nitric oxide production in Anopheles pseudopunctipennis m idguts cultured in vitro. Insect Biochem Mol Biol， 2004， 34（9）: 893-901.

［4］ Leem JY， Nishimura C， Kurata S， et al. Purification and characterization of N-β-A lanyl-5-S-glutathionyl-3， 4-dihydroxyphenylalanine， a novel antibacterial substance of Sarcophaga peregrina （Flesh Fly）. J Biol Chem， 1996， 271（23）: 13573-13577.

［5］ Ling EJ， Yu XQ. Prophenoloxidase binds to the surface of hemocytes and is involved in hemocyte melanization in Manduca sexta. Insect Biochem M ol Biol， 2005， 35（12）: 1356-1366.

［6］ Tang HP. Regulation and function of the melanization reaction in Drosophila. Fly， 2009，3（1）: 105-111.

［7］ Zou Z， Shin SW， A lvarez KS， et al. Distinct melanization pathways in the mosquito Aedes aegypti. Immunity， 2010， 32（1）: 41-53.

［8］ Xu PZ， Zhang MR， Cheng TC， et al. Molecular cloning and expression profile analysis genes encoding pattern recognition receptors PGRP and βGRP in the silkworm， Bombyx mori. Sci Sericult，2010， 36（3）: 383-390 （in Chinese）.

許平震， 張美蓉， 程廷才， 等. 家蠶模式識別受體 PGRP、βGRP編碼基因的克隆鑒定及表達譜分析. 蠶業(yè)科學， 2010， 36（3）: 383-390.

［9］ Zhao P， Dong ZM， Duan J， et al. Genome-w ide identification and immune response analysis of serine protease inhibitor genes in the silkworm，Bombyx mori. PLoS ONE， 2012， 7（2）: e31168.

［10］ Xu M， Wang X， Tan J， et al. A novel Lozenge gene in silkworm， Bombyx mori regulates the melanization response of hemolymph. Dev Comp Immunol， 2015， 53（1）: 191-198.

［11］ W ittkopp PJ， Carroll SB， Kopp A. Evolution in black and white: genetic control of pigment patterns in Drosophila. Trends Genet， 2003， 19（9）: 495-504.

［12］ Yu HS， Shen YH， Yuan GX， et al. Evidence of selection at melanin synthesis pathway loci during silkworm domestication. Mol Biol Evol， 2011，28（6）: 1785-1799.

［13］ Liu C， Yamamoto K， Cheng TC， et al. Repression of tyrosine hydroxylase is responsible for the sex-linked chocolate mutation of the silkworm，Bombyx mori. Proc Natl Acad Sci USA， 2010，107（29）: 12980-12985.

［14］ Futahashi R， Sato J， M eng Y， et al. yellow and ebony are the responsible genes for the larval color mutants of the silkworm Bombyx mori. Genetics，2008， 180（4）: 1995-2005.

［15］ Futahashi R， Banno Y， Fujiwara H. Caterpillar color patterns are determ ined by a two-phase melanin gene prepatterning process: new evidence from tan and laccase2. Evol Dev， 2010， 12（2）: 157-167.

［16］ Dai FY， Qiao L， Tong XL， et al. M utations of an arylalkylam ine-N-acetyltransferase， Bm-iAANAT，are responsible for silkworm melanism mutant. J Biol Chem， 2010， 285（25）: 19553-19560.

［17］ Chen P， Li L， Wang JY， et al. BmPAH catalyzes the initial melanin biosynthetic step in Bombyx mori. PLos ONE， 2013， 8（8）: e71984.

［18］ Chen P， Wang JY， Li HY， et al. Role of GTP-CHI links PAH and TH in melanin synthesis in silkworm， Bombyx mori. Gene， 2015， 567（2）: 138-145.

［19］ Biosciences Q. Compositions and methods for cDNA synthesis: US， 08420324. 2013-04-16.

［20］ Li T， Jiang GB， Lv Y， et al. In vitro induction of Bombyx mori haemolymph melanization by three types of m icrobes and their cell wall ingredients. Sci Sericult， 2015， 41（2）: 278-285 （in Chinese）.

李田， 蔣貴兵， 呂銀， 等. 3種微生物及其胞壁物質(zhì)體外誘導家蠶血液黑化反應的觀察. 蠶業(yè)科學， 2015， 41（2）: 278-285.

［21］ Tan J， Xu M， Zhang K， et al. Characterization of hemocytes proliferation in larval silkworm， Bombyx mori. J Insect Physiol， 2013， 59（6）: 595-603.

［22］ Trf W. The genetics of biogenic am ine metabolism，sclerotization， and melanization in Drosophila melanogaster. Adv Genet， 1987， 24: 127-222.

［23］ Xiang ZH. Silkworm's Heredity and Breeding. Beijing: China Agricultural Press， 1991: 228-243 （in Chinese）.

向仲懷. 家蠶遺傳育種學. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社， 1991: 228-243.

［24］ Infanger LC， Rocheleau TA， Bartholomay LC， et al. The role of phenylalanine hydroxylase in melanotic encapsulation of filarial worms in two species of mosquitoes. Insect Biochem M ol Biol，2004， 34（12）: 1329-1338.

［25］ Liu CT， Hou RF， Ashida M， et al. Effects of inhibitors of serine protease， phenoloxidase and dopa decarboxylase on the melanization of Dirofilaria immitis microfilariae w ith Armigeres subalbatus haemolymph in vitro. Parasitology，1997， 115（Pt 1）: 57-68.

［26］ Liu SS， Wang M， Li XC. Overexpression of tyrosine hydroxylase and dopa decarboxylase associated w ith pupal melanization in Spodoptera exigua. Sci Rep， 2015， 5: 11273.

［27］ Schachter J， Pérez MM， Quesada-A llué LA. The role of N-β-alanyldopam ine synthase in the innate immune response of two insects. J Insect Physiol，2007， 53（11）: 1188-1197.

［28］ Sideri M， Tsakas S， Markoutsa E， et al. Innate immunity in insects: surface-associated dopa decarboxylase-dependent pathways regulate phagocytosis， nodulation and melanization in medfly haemocytes. Immunology， 2008， 123（4）: 528-537.

［29］ Wang MX， Cai ZZ， Lu Y， et al. Expression and functions of dopa decarboxylase in the silkworm，Bombyx mori was regulated by molting hormone. Mol Biol Rep， 2013， 40（6）: 4115-4122.

（本文責編 郝麗芳）

November 25， 2015； Accepted: February 17， 2016

Ping Chen. Tel/Fax: +86-23-68250084； E-mail: chenping1918@swu.edu.cn

In vitro observation of haemolym ph melanization and melanin-related biosynthesis enzyme genes in silkworm, Bombyx mori

Tian Li1, Liang Zhang1, Qi Shen1, Wei Zhao1, Li Li1, Yin Lü1, Guibing Jiang2, Dengfeng Yan1, Junjie Xiao1, and Ping Chen1

1 College of Biotechnology， Southwest University， Chongqing 400716， China
2 Sericulture Management Station of Chongqing， Chongqing 400716， China

The observation statistics suggested that the haemolymph melanization speed of larvae became fast and the grow th inhibition of Escherichia coli was strong as the quantities of feeding on mulberry leaves increased. The RT-PCR result showed that the mRNA expressions of melanin biosynthesis enzyme Bm Tan， BmPo-1， BmYellow-f and BmDdc were high in the haemolyph of 5 L 3 d larvae. The q PCR analysis showed Bmtan， Bmddc， Bmyellow， Bmebony and Bmblack， especially Bmddc expression were significantly higher in black disease larvae than in normal larvae. Compared w ith control， Ddc inhibitors drastically inhibited the lipopolysaccharide-induced haemolymph melanization. In addition， the content of Dopa and Dopam ine markedly rose after E. coli injection. These indicated that haemolymph melanization was linked to immune defenses and Bmddc may play a role in melanization response of haemolymph immune in silkworm.

haemolymph of Bombyx mori， melanization， melanin biosynthesis enzyme， immune response

Supported by: Natural Science Fundation of Chongqing （No. 2013jjB80004）， Graduate Student Innovative Research Projects of Chongqing （No. CYS14048）， National Special Fund for Silk Development of Chongqing in 2015.

重慶市自然科學基金重點項目 （No. 2013jjB80004），重慶市研究生科研創(chuàng)新項目 （No. CYS14048），重慶市2015國家繭絲綢發(fā)展專項資金資助。

網(wǎng)絡出版時間：2016-03-07 網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20160307.1410.004.html