高效液相色譜串聯(lián)原子熒光法測定魚類甲基汞的兩種前處理方法比較與分析

李繼源，孔 佳，柯異蕓，肖新峰，包 斌*（上海海洋大學食品學院，上?！?306；上海食品研究所，上海　0035）

高效液相色譜串聯(lián)原子熒光法測定魚類甲基汞的兩種前處理方法比較與分析

李繼源1，孔 佳2，柯異蕓1，肖新峰1，包 斌1*
（1上海海洋大學食品學院，上海201306；2上海食品研究所，上海200235）

分別采用超聲波輔助提取和提取液提取方法對魚體中的甲基汞進行前處理，通過高效液相色譜串聯(lián)原子熒光法分析測定甲基汞含量。結果表明：兩種方法均可用于高效液相色譜串聯(lián)原子熒光法測定魚類甲基汞的前處理。超聲輔助提取和提取液提取的回收率分別為81%—95%和82%—101%；精密度分別為6.7%和5.6%；檢測限分別為33.5μg/kg和13.4μg/kg；兩種前處理方法測定FAPAS樣品得到的測定結果與定值吻合，準確度滿足分析要求。超聲波輔助提取相對提取液提取簡便、經濟性較好，而提取液提取相對超聲波輔助提取試驗耗時短、檢出限低，在對未知濃度甲基汞（痕量）進行測定時，提取液提取相對超聲波輔助提取更為可靠。

甲基汞；魚肉；高效液相色譜串聯(lián)原子熒光法；超聲波輔助提??；提取液提取

汞俗稱水銀，是地殼中唯一的液態(tài)金屬。在自然條件下，僅極少量汞以金屬態(tài)存在，大多以無機汞、甲基汞、乙基汞及其他有機化合物形式存在［1］。其中甲基汞是一種具有神經毒性的環(huán)境污染物，可侵犯中樞神經系統(tǒng)，造成語言和記憶能力障礙［2-3］，且其在體內具有易吸收、不易降解、難以排泄等特點［4］。人類活動造成水體汞污染，水中的無機汞可由微生物作用轉變成甲基汞，并在水生生物食物鏈不斷富集，當甲基汞在魚體內積累，就可能危害人類健康。國家標準GB 2762—2012和農業(yè)行業(yè)標準NY 5073—2006對食品中污染物限量規(guī)定：非食肉魚類水產品和食肉魚類水產品中甲基汞含量應分別不得大于0.5 mg/kg和1.0 mg/kg。對魚體內甲基汞含量測定的方法包括：原子吸收光度法［5］、原子熒光光譜分析法［6］、氣相色譜法［7］、高效液相色譜法［8］、液相聯(lián)用原子熒光（HPLC-AFS）和高效液相聯(lián)用電感耦合等離子體質譜（HPLC-ICP-MS）［9-10］等。國家標準GB/T 5009.17—2003規(guī)定采用氣相色譜法測定甲基汞，該方法靈敏度高，但前處理復雜，容易在前處理過程中損失［11］；中國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準（SN/T 3034—2011）規(guī)定采用高效液相色譜與原子熒光光譜聯(lián)用（HPLC-AFS）測定甲基汞，此方法具有靈敏度高、檢出限低、儀器使用成本低［12］等優(yōu)勢。

本研究采用超聲波輔助提取和提取液提取兩種方法提取魚肉中的甲基汞，其中超聲波輔助提取采用鹽酸配合超聲波進行提取，提取液提取參照出入境檢驗檢疫行業(yè)標準（SN/T 3034—2011），采用鹽酸-硫脲-氯化鉀混合液進行提取。超聲波輔助提取因提取效率高、提取溫度低、適應性廣、提取工藝運行成本低、操作簡單而適用；提取液提取因前處理較為簡單、回收率穩(wěn)定、靈敏、雜質干擾少而適用。目前，未見對高效液相串聯(lián)原子熒光分光光度法檢測魚肉中甲基汞的前處理方法進行比較分析的報道，本研究比較超聲波輔助提取和提取液提取對魚肉甲基汞含量測定的影響，以期為魚類體內甲基汞檢測提供方法依據。

1　材料與方法

1.1試劑

甲基汞標準溶液購自中國計量科學研究院；乙腈（色譜純）；氬氣（純度＞99.999%）、L-半胱氨酸、乙酸銨、鹽酸、氫氧化鈉、硼氫化鈉、氨水均為優(yōu)級純；試驗用水為去離子水。

1.2儀器與設備

AFS-9800雙道原子熒光光度計、汞空心陰極燈、SAP-20形態(tài)分析儀（北京吉天儀器有限公司）、C18分析柱（150 mm×4.6 mm，3.5μm，waterssunfire）、電子天平、組織勻漿機、超聲波清洗器、渦旋振蕩器、臺式高速離心機、pH計。

1.3方法

1.3.1樣品前處理

1.3.1.1超聲波輔助提取

切取魚肉組織經勻漿器勻漿后，準確稱取樣品0.5g（精確至0.0001g），置于15 mL離心管中，加入10 mL 5 mol/L HCl提取試劑，密封放置過夜。在室溫下超聲提取60 min后，7 000 r/min離心10 min。取2.00 mL上清液于離心管中并用NaOH調節(jié)pH至2—8，加入0.2 mL L-半胱氨酸溶液定容至5 mL，7 000 r/min離心10 min，取上清液過0.45μm微孔濾膜過濾，濾液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2提取液提取

切取魚肉組織經勻漿器勻漿后，準確稱取樣品0.5g（精確至0.0001g），加入2.00 mL的提取液（質量分數10%HCl溶液+1%硫脲+0.15%KCl溶液），混合3 min，7 000 r/min離心10 min后取上清液，沉淀中加入2.00 mL提取液再提取1次，合并2次上清液，用氨水調節(jié)pH至2—8，7 000 r/min離心10 min后取上清液，保存待用。用5 mL甲醇和5 mL純水活化C18小柱，上清液通過C18小柱上樣，再用4 mL流動相兩次洗脫，接收樣品流出液和洗脫液，最后用流動相定容至10 mL，經0.45μm微孔濾膜過濾，濾液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2色譜條件、原子熒光儀條件和形態(tài)分析預處理裝置條件

色譜條件：色譜柱為C18柱（150 mm×4.6 mm，3.5μm，watersunfire）；流動相為5%乙腈 +4.62g/L乙酸銨+1.2g/L半胱氨酸，流速1.0 mL/min；柱溫為30℃；進樣量為100μL；泵轉速為60 r/min。

原子熒光儀條件：總電流30 mA、負高壓 280 V、載氣為高純氬氣，流速300 mL/min、屏蔽氣流速500 mL/min。

形態(tài)分析預處理裝置條件：開啟紫外燈；還原劑為0.5%KOH和2%KBH4溶液；載流為質量分數7% HCl溶液。

1.3.3標準曲線的繪制

吸取相應的標準儲備液，用流動相稀釋成含甲基汞質量濃度為5μg/L、10μg/L、20μg/L、60μg/L的標準工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。以峰面積為縱坐標、甲基汞質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

2　結果與分析

2.1儀器條件選擇

2.1.1流動相的優(yōu)化

試驗分別采用5%乙腈+4.62g/L乙酸銨+1.2g/L L-半胱氨酸和3%乙腈+4.62g/L乙酸銨+ 1.2g/L L-半胱氨酸作為流動相。乙腈對于汞與絡合劑生成的絡合物有較好的溶解性，流動相中含有乙腈能避免色譜峰的拖尾和變寬。乙腈的含量對分析物的保留時間影響較大，試驗對3%乙腈和5%乙腈形成的色譜圖進行比較，乙酸銨和L-半胱氨酸濃度不變。如圖1所示，隨著乙腈濃度升高，甲基汞保留時間縮短，峰形更尖銳對稱，所以采用5%乙腈比較合適。

圖1　流動相中不同濃度乙腈的甲基汞色譜圖Fig.1　Chromatogram of methyl mercury in mobile phase withdifferent concentrations of acetonitrile

2.1.2原子熒光光譜條件的確定

將負光電倍增管負高壓設置為270 V、280 V、290 V、300 V進行比較，發(fā)現(xiàn)基線隨著電壓的升高而升高，但考慮到儀器靈敏度及使用條件限制，選用光電倍增管負高壓為280 V作為試驗條件；汞空心陰極燈電流選用30 mA，當電流增強到30 mA后，信號強度基本不變。隨著使用時間的延長，電流升高會造成汞燈的老化，影響儀器的靈敏度，故選擇30 mA作為汞燈電流；載氣流速300 mL/min、屏蔽氣流速500 mL/min。

圖2　還原劑KBH4濃度對甲基汞響應值的影響Fig.2　Effect of reducing agent KBH4concentration on the response value of methyl mercury

2.1.3還原劑的選擇

試驗前將原子熒光光譜儀調至最佳狀態(tài)，優(yōu)化氫化物反應條件，本試驗采用0.3%、0.5%、1%、2%、3%的KBH4和0.5%的NaOH作為還原劑，其余條件不變。如圖2所示，當硼氫化鉀濃度為3%時，甲基汞的響應值最大，但硼氫化鉀濃度2%與3%相差不大，從節(jié)約試驗原料的角度考慮，采用2%硼氫化鉀作為還原劑。

2.1.4氧化方式的選擇

色譜分離后的甲基汞復合物首先需要柱后氧化，與氧化劑混合后進入紫外消解系統(tǒng)，在紫外線的照射下甲基汞被氧化轉化為無機汞。中國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準（SN/T 3034—2011）及部分學者一般使用K2S2O8和KOH/NaOH混合溶液作為氧化劑［13-14］，本試驗采用高強度的紫外消解裝置，從而使用水替代K2S2O8和KOH/NaOH混合溶液的氧化劑，結果見圖3。通過比較可知，氧化方式用強紫外照射代替氧化劑為K2S2O8和KOH/NaOH的混合溶液，所得峰形與后者相近，且峰形尖銳對稱，無拖尾和變寬。因為本試驗所采用的形態(tài)分析儀配備高強度的紫外消解裝置，所以可以采用水替代 K2S2O8和KOH/NaOH混合溶液的氧化劑。

2.1.5蠕動泵轉速優(yōu)化

蠕動泵轉速可影響還原劑與載流的流量從而對氫化物的生成造成直接影響。本研究采用還原劑0.5%NaOH+2%KBH4、載流為7%HCl。通過固定還原劑濃度，改變蠕動泵轉速來研究對氫化物生成的影響。用甲基汞標準溶液進樣，轉速分別設置為30 r/min、40 r/min、50 r/min、60 r/min、70 r/min、80 r/min。由圖4可知，轉速為60 r/min時，甲基汞標準溶液響應的峰面積和峰高均達到最大，故選擇60 r/min為蠕動泵轉速。

圖3　不同氧化方式對甲基汞響應值的影響Fig.3　Effect ofdifferent oxidation methods on the response value of methyl mercury

圖4　蠕動泵轉速對氫化物產生的影響Fig.4　Effect of the rotationspeed of peristaltic pump on hydridegeneration

2.2方法檢出限與線性范圍

配置質量濃度為2μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、40μg/L、60μg/L的甲基汞標準溶液，在上述條件下測定并計算，以質量濃度作為橫坐標、峰面積作為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程為y=17 141x-38 067，相關系數為r2=0.9994，甲基汞在0—60μg/L質量濃度范圍內呈良好的線性關系。

在上述條件下，以儀器性噪比S/N=3計算，甲基汞的儀器最低檢出限為0.67μg/L，按照樣品前處理的濃縮倍數關系及最低回收率得出超聲波輔助提取的檢出限為33.5μg/kg，提取液提取的檢出限為13.4μg/kg。通過比較可知，兩種前處理方法測定低濃度含量甲基汞時，采用提取液提取略優(yōu)于超聲波輔助提取。

2.3精密度及加標回收試驗

選取草魚作為試驗材料，分別加入10μg/L、20μg/L、50μg/L 3個濃度的甲基汞標準溶液，進行精密度和加標回收試驗，每個水平6個重復，按照上述兩種前處理方法進行提取、凈化、測定，用外標法計算方法的回收率。同時選取大黃魚作為原料，重復測定6次，驗證精密度。

如表1、表2所示，在10μg/L、20μg/L、50μg/L 3個加標水平下，超聲波輔助提取回收率為81%—95%，RSD%為3.83%—4.10%；提取液提取回收率為82%—101%，RSD%為3.70%—6.82%。超聲波輔助提取測定大黃魚樣品RSD%為6.70%，提取液提取測定大黃魚樣品 RSD%為5.60%。通過比較可知，兩種前處理方法回收率及精密度相差不大，且均滿足試驗要求，因此兩種前處理方法均可用于測定魚肉中的甲基汞。

表1　草魚添加甲基汞標準溶液回收率及精密度測定結果Table 1　Results of recovery and precision of thestandardsolution of methyl mercury ingrass carp　μg·L-1

表2　大黃魚中甲基汞精密度試驗結果（n=6）Table 2　The test results of methyl mercury precision in large yellow croaker

2.4方法準確性

使用兩種前處理方法測定冷凍干燥的FAPAS罐裝魚肉樣品（T07189）中的甲基汞含量，結果見表3。超聲波輔助提取法測定的值為給定值的（96.5±1.3）%，提取液提取法測定的值為給定值的（96.3± 1.3）%。兩種前處理方法得到的測定結果與定值吻合，準確度滿足分析要求。

表3　不同提取方法準確性對比（n=6）Table 3　Accuracy comparison ofdifferent extraction methods

2.5實際樣品測定

用兩種前處理方法分別處理上海市市售6種魚，并進行甲基汞含量測定，結果見表4。兩種前處理方法均測出待測海水魚樣品中的甲基汞，2種淡水魚均未檢出甲基汞，且兩種方法檢測結果差異不顯著，說明兩種前處理方法均可用于實際樣品的檢測。根據GB 2762—2012食品中污染物限量規(guī)定，我國將肉食性魚類及其制品甲基汞含量限定在≤1 000μg/kg范圍內，水產動物及其制品中甲基汞含量限定在≤500μg/kg，以上所測水產品甲基汞含量均低于國家標準。

表4　樣品中甲基汞含量的測定結果（n=6）Table 4　Determination results of the content of methyl mercury in thesamples

3　結論

本試驗采用超聲波輔助提取和提取液提取兩種前處理方法對樣品進行前處理，隨后用高效液相色譜串聯(lián)原子熒光光度計測定魚肉中的甲基汞含量。試驗中采用5%乙腈-4.62g/L乙酸銨-1.2g/L L-半胱氨酸作為流動相，用反相C18柱分離，采用強紫外氧化方式取代K2S2O8和KOH/NaOH混合溶液，發(fā)現(xiàn)兩種前處理方法均能夠滿足試驗需要。在原子熒光光譜優(yōu)化條件下進行測定，結果表明：兩種前處理方法加標回收率、檢出限、精密度等指標均能滿足試驗要求，雜質干擾少，適用于魚類中該類物質檢測分析。超聲波輔助提取相對于提取液提取，因為不需要消耗C18小柱，所以在處理大批量樣品時試驗成本低，且前處理步驟相對提取液提取更為簡便。但在對未知濃度甲基汞（痕量）進行測定時，因為提取液提取檢出限比超聲波輔助提取更低，采用提取液提取相對超聲波輔助提取更為可靠。

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（責任編輯：閆其濤）

Comparison and analysis of two pretreatment methods fordetermination of methyl mercury in fish by HPLC-AFS

LI Ji-yuan1，KONG Jia2，KE Yi-yun1，XIAO Xin-feng1，BAO Bin1*
（College of Foodscience and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；Shanghai Food Research Institute，Shanghai 200235，China）

Two pretreatment methods，ultrasonic-aid extraction andsolvent extraction，fordetermination of methyl-mercury in fish by high performance liquid chromatography coupled with atomic fluorescencespectrometry （HPLC-AFS）were compared and analyzed.The resultsshowed that both pretreatment methods were qualified for the methyl mercurydetermination ofdifferent fishsamples by HPLC-AFS.The recovery，precision anddetection limit of ultrasonic assisted extraction andsolvent extraction were 81%—95%and 82%—101%，6.7%and 5.6%，33.5μg/kg and 13.4μg/kg，respectively.Thedetermination results of FAPASsamples by the two pretreatment methods were consistent with the fixed value，and the accuracy wassatisfied.Ultrasonic assisted extraction was moresimple and economic thansolvent extraction，whilesolvent extraction wasshort timeconsuming and had lowerdetection limit.Solvent extraction is more reliable indetermination of unknown concentration（trace quantity）of methyl mercury.

Methyl mercury；Fish tissue；HPLC-AFS；Ultrasonic assisted extraction；Solvent extraction

TS254.7

A

1000-3924（2016）04-081-06

2015-05-12

李繼源（1988—），男，在讀碩士，研究方向：食品重金屬風險評估

，E-mail：bbao@shou.edu.cn