基于TLH重組蛋白單抗的磁性免疫層析試紙條構(gòu)建

劉瑩瑩，翁仕強(qiáng)，盧 瑛，趙 勇，潘迎捷（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海201306）

基于TLH重組蛋白單抗的磁性免疫層析試紙條構(gòu)建

劉瑩瑩，翁仕強(qiáng)，盧 瑛*，趙 勇，潘迎捷
（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海201306）

為了檢測(cè)不耐熱溶血毒素TLH，以His-TLH重組蛋白為抗原免疫BALB/c小鼠，利用雜交瘤技術(shù)制備TLH單克隆抗體，然后將純化后的單抗與磁珠偶聯(lián)制備免疫磁珠，以此免疫磁珠為標(biāo)記物構(gòu)建了TLH重組蛋白的磁性免疫層析檢測(cè)試紙條。結(jié)果表明，該磁性免疫層析試紙條實(shí)現(xiàn)了TLH重組蛋白的快速定性和定量檢測(cè)，具有快速、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高（檢測(cè)限12.5 ng/mL）等特點(diǎn)。本研究所構(gòu)建的磁性免疫層析試紙條為重組溶血毒素的快速鑒定、診斷和檢測(cè)提供了一種新途徑。

副溶血性弧菌；不耐熱溶血毒素；單克隆抗體；磁性免疫層析試紙條

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）是一種嗜鹽、革蘭氏陰性桿狀菌，廣泛分布于海洋環(huán)境和各種海產(chǎn)品中，食用污染該菌而又未經(jīng)良好加工處理的海產(chǎn)品會(huì)引發(fā)突發(fā)性食物中毒，可導(dǎo)致傷口感染、腸痙攣、敗血癥、腹瀉、頭痛和惡心等反應(yīng)［1-6］。副溶血性弧菌最重要的毒力因子是其產(chǎn)生的多種溶血毒素，主要有耐熱的直接溶血毒素（Thermostabledirect hemolysin，TDH），耐熱的直接相關(guān)溶血毒素（TDH-related hemolysin，TRH）和不耐熱溶血毒素（Thermolabile hemolysin，TLH）［7-8］。已有很多報(bào)道以 TDH和TRH為目標(biāo)對(duì)象開展了研究［9-11］，然而，并不是所有的VP中都含有這兩種溶血毒素。研究發(fā)現(xiàn)TLH廣泛存在于VP中，且tlh基因具有種屬特異性，因此，該基因可作為鑒定識(shí)別VP菌株的目標(biāo)基因［12-13］。

目前對(duì)TLH檢測(cè)的研究主要有兩種方式，一是建立tlh基因分子生物學(xué)和免疫學(xué)檢測(cè)方法［14-16］；二是克隆重組tlh基因，對(duì)其進(jìn)行原核表達(dá)［17-18］，盡管這些方法有較好的靈敏度和特異性，但是其均需要昂貴的儀器設(shè)備以及高技術(shù)操作，并且檢測(cè)時(shí)間較長。免疫層析技術(shù)是上世紀(jì)80年代初期發(fā)展起來的一種快速檢測(cè)技術(shù)，其基本原理是將生物分子附上標(biāo)志物，依賴標(biāo)志物的顏色或發(fā)出的光電磁等信號(hào)放大效應(yīng)進(jìn)而使得微觀免疫反應(yīng)的可被檢出或宏觀可視，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)目標(biāo)物質(zhì)的目的［19］。目前各種示蹤材料發(fā)展迅速，包括膠體金、稀土元素、熒光微球、量子點(diǎn)、磁珠等［20］。磁性免疫層析技術(shù)以免疫磁珠（Immunomagenetic beads，IMBs）作為標(biāo)記物，近年來，已有人類免疫缺陷病毒（HIV）、人血清Fe蛋白免疫磁珠快速檢測(cè)試劑盒等研究報(bào)道［21］。磁性免疫層析試紙條和其他試紙條最大的區(qū)別在于，可用磁信號(hào)閱讀儀對(duì)檢測(cè)線和質(zhì)控線上的磁信號(hào)進(jìn)行讀取，由于磁信號(hào)具有“穿透性”，儀器對(duì)磁信號(hào)的檢測(cè)不受膜厚度的影響，能夠檢測(cè)捕獲區(qū)域內(nèi)近100%的磁信號(hào)，且磁信號(hào)不易受生物材料干擾，因而其檢測(cè)靈敏度高，結(jié)果的判定更為準(zhǔn)確［22］。

本研究利用實(shí)驗(yàn)室已建立的His-TLH重組融合表達(dá)體系及其誘導(dǎo)表達(dá)方法，將分離純化后的His-TLH重組蛋白免疫小鼠，制備了純度較高、特異性良好的單克隆抗體，利用TLH單抗與磁性納米材料偶聯(lián)制備了免疫磁珠；并以此免疫磁珠為標(biāo)記物構(gòu)建了TLH重組蛋白的磁性免疫層析檢測(cè)試紙條，探討了TLH單抗在定性和定量檢測(cè)TLH重組蛋白方面的應(yīng)用可行性，為今后進(jìn)一步建立快速簡(jiǎn)便的VP現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4—6周齡BALB/c小鼠購自西普爾必凱公司；小鼠骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0-Ag14購自上海麥莎公司。

1.1.2實(shí)驗(yàn)菌株 副溶血性弧菌ATCC 33846購自中國科學(xué)院微生物研究所。

1.1.3主要試劑耗材 氧化硅納米磁珠（100 nm）購自上海奧潤微納新材料科技有限公司；硼酸，四硼酸鈉，Tween-20，牛血清白蛋白（BSA），購自上海生工；辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記羊抗鼠IgG，鄰苯二胺（OPD）片劑購自SIGMA公司；胎牛血清（FBS）、HAT、降植烷、抗體亞類鑒定試劑盒購自SIGMA公司；細(xì)胞培養(yǎng)所用耗材均購自CRONING公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自GIBCO公司；蛋白脫鹽柱、IgG抗體純化柱購自GE公司。NHS，EDC購自上海延長生化科技發(fā)展有限公司；MES購自Alafa公司；硝酸纖維素膜，樣品墊，結(jié)合墊，吸水紙購自上海捷寧生物科技有限公司；磁性分析儀購自美國Magna Bioscience公司。

1.2His-TLH重組蛋白的單抗制備、純化及其性能表征

1.2.1單克隆抗體的制備 His-TLH重組融合表達(dá)體系的構(gòu)建及其誘導(dǎo)表達(dá)參照翁仕強(qiáng)等［18］實(shí)驗(yàn)室的方法并運(yùn)用割膠回收法［23］進(jìn)行重組蛋白的純化。單抗的制備采取何勇琴［24］的方法進(jìn)行，以純化的His-TLH為抗原對(duì)4—6周齡雌性BALB/c小鼠分別進(jìn)行2次腹腔免疫和1次尾靜脈強(qiáng)化免疫?？乖⑸淞糠謩e為30μg和15μg。靜脈注射后第三天將免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0按照K?hler等［25］建立的方法進(jìn)行細(xì)胞融合。采用RPMI-FCS-HAT培養(yǎng)基進(jìn)行陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選，取篩選得到的細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行ELISA檢測(cè)，陽性雜交瘤細(xì)胞株通過無限稀釋法［26］進(jìn)行細(xì)胞克隆。

1.2.2His-TLH單抗的大量制備與純化 選用雌性BALB/c小鼠，采用常規(guī)小鼠腹水法大量制備TLH單抗。所得腹水于37℃放置1 h后4℃過夜保存，然后20 min離心（4℃，3 000 r/min），所得上清液用50%硫酸銨進(jìn)行富集，然后利用IgG抗體親和層析柱進(jìn)行純化，得到TLH單克隆抗體。運(yùn)用IsoQuickTM Kit for Mouse Monoclonal Isotyping試劑盒鑒定單抗的亞類型。

1.2.3酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA） 本研究采用間接ELISA法進(jìn)行小鼠抗血清的效價(jià)檢測(cè)和雜交瘤細(xì)胞的篩選。首先以10μg/mL的TLH重組蛋白為抗原包被酶標(biāo)板，100μL/孔；然后每孔加入150μL PBS（pH 7.4）溶液洗滌3次后，加入250μL封閉液（含2%BSA的PBS），37℃反應(yīng)1.5 h后用PBS洗滌三次；隨后加入100μL的抗血清稀釋液或雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作為一抗，37℃反應(yīng)1 h；經(jīng)PBS洗滌后加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗（1∶10 000），100μL/孔，37℃反應(yīng)1 h；然后加入100μL的OPD底物顯色液，室溫反應(yīng)10—30 min；最后每孔加入50μL終止液（2 mol/L H2SO4），用酶標(biāo)儀測(cè)量490 nm的吸光值。

1.2.4單克隆抗體的特異性檢測(cè) 首先以本研究室構(gòu)建并表達(dá)獲得的His-TLH、His-TDH、His-TRH、His-ALGL為抗原，雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗的ELISA法分析所得單抗對(duì)其他重組蛋白的特異性反應(yīng)。其次用競(jìng)爭(zhēng)ELISA法探討了單抗對(duì)TLH重組蛋白的特異性反應(yīng)。即1∶1 000稀釋后，取100μL分別與400μL不同濃度（1 300 mg/mL、130 mg/mL、13 mg/mL、6.5 mg/mL、1.3 mg/mL、0.13 mg/mL、0.013 mg/mL）的TLH重組蛋白在垂直混合儀上反應(yīng)45 min，然后將該混合反應(yīng)液作一抗100μL/孔。以100μL TLH單抗加400μL PBS作為對(duì)照樣本，其余部分操作同間接ELISA法。

1.3TLH重組蛋白的磁性免疫層析檢測(cè)

1.3.1免疫磁珠的制備 免疫磁珠的制備參照黃韻儀等［27］的方法進(jìn)行。先用EDC和NHS活化磁珠上的羧基，然后加入一定量的His-TLH抗體與磁珠偶聯(lián)，經(jīng)活化緩沖液（10 mmol/L MES，0.05%（v/v）Tween-20，pH 5.0）和偶聯(lián)緩沖液（5 mmol/L BS，0.05%（v/v）Tween-20，pH 9.0）洗滌后，最后加入BSA對(duì)磁珠上未偶聯(lián)抗體的位點(diǎn)進(jìn)行封閉，封閉后放入保存液中保存待用。

1.3.2免疫層析試紙條的制備 按照PVC板、硝酸纖維素膜、結(jié)合墊、樣品墊、吸水紙的順序依次組裝試紙條，T線噴涂300 mg/L His-TLH，C線噴涂1 mg/mL的羊抗鼠IgG，30℃烘干后在硝酸纖維素膜上貼上覆膜，將組裝完成的試紙條進(jìn)行切割，每條寬0.5 cm，于干燥處保存［28］。

1.3.3試紙條的特異性檢測(cè) 于結(jié)合墊上添加5μL免疫磁珠，然后分別加100μL（0.5g/L）的His-TLH、His-TDH和His-ALGL于樣品墊上，對(duì)照組加等量0.01 mol/L PBS。待液體完全跑到吸水紙頂端后，將試紙條與卡槽組裝，放入磁性分析儀檢測(cè)T線、C線磁信號(hào)。

1.3.4磁性免疫層析試紙條對(duì)TLH重組蛋白的定量分析 5μL免疫磁珠加在結(jié)合墊上，然后樣品墊上分別加100μL系列梯度稀釋的His-TLH（0.01—50μg的His-TLH），對(duì)照組添加100μL的10 mmol/L PBS。待液體完全跑到吸水紙頂端后，將試紙條與卡槽組裝，放入磁性分析儀檢測(cè)T線、C線磁信號(hào)。

2　結(jié)果與分析

2.1His-TLH單克隆抗體的制備與純化

三次免疫后，免疫小鼠血清效價(jià)達(dá)到1∶17 500。細(xì)胞融合后10d計(jì)算得平均融合率為21.9%。有融合細(xì)胞的孔經(jīng)ELISA檢測(cè)，得到1個(gè)陽性細(xì)胞孔TLH-DB2。然后經(jīng)過三次克隆篩選，最終得到1株TLH抗體細(xì)胞株。篩選完成的抗體細(xì)胞株培養(yǎng)上清經(jīng)抗體亞類鑒定試劑盒鑒定，結(jié)果為IgG1，K輕鏈。腹水先后經(jīng)50%硫銨和IgG抗體親和層析柱純化后，樣品純化結(jié)果顯示，只出現(xiàn)重鏈和輕鏈兩條帶，因此，得到的His-TLH單抗純度比較高。

2.2單克隆抗體的特異性表征

由表1可知，His-TLH抗體對(duì)His-TLH抗原具有特異性反應(yīng)，對(duì)His-TDH、His-TRH、His-ALGL均無交叉反應(yīng)。

表1　TLH-DB2抗體的間接　ELISA分析結(jié)果Table 1　Result of indirect ELISA of TLH-DB2 antibody

圖1　TLH-DB2競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線Fig.1　Competitive inhibition curve of TLH-DB2

競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)果如圖1所示，隨著His-TLH重組蛋白競(jìng)爭(zhēng)抗原量的增加，OD490值逐漸下降，當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)抗原量在適宜范圍內(nèi)時(shí)，OD490值呈線性變化，線性區(qū)間為1.3—10 mg/mL。

2.3磁性免疫層析試紙條的特異性檢測(cè)

由圖2可知，His-TDH、His-ALGL陰性樣品與空白PBS的T線顏色深度相當(dāng)，經(jīng)檢測(cè)，磁信號(hào)值皆超過1 000，而His-TLH組的T線肉眼不可見，檢測(cè)所得磁信號(hào)值低于100。由此可見，His-TLH的競(jìng)爭(zhēng)性免疫試紙條對(duì)組氨酸和TDH均無交叉反應(yīng)，對(duì)TLH具有較好的特異性反應(yīng)。

2.4 磁性免疫層析試紙條對(duì)His-TLH重組蛋白的定量分析

由圖3可以看出，隨著His-TLH重組蛋白濃度的減少，T線顏色逐漸加深。取陰性T線磁信號(hào)與樣品T線磁信號(hào)的差值為縱坐標(biāo)，His-TLH濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)建立TLH蛋白的定量曲線（圖4）。從肉眼觀察，該方法的定性檢測(cè)限在30 mg/L，利用磁信號(hào)分析儀進(jìn)行定量分析，其定量檢測(cè)線性范圍為0.01—50μg/mL，根據(jù)定量曲線以3倍空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算His-TLH的理論定量檢測(cè)限為12.5 ng/mL，比定性靈敏度提高了2 000多倍。

圖2　試紙條的特異性檢測(cè)結(jié)果Fig.2　Result ofspecificdetection by immunochromatographic teststrip

圖3　磁性免疫層析試紙條定量檢測(cè)　TLH重組蛋白Fig.3　Quantitativelydetecting TLH recombinant protein by MITS

圖4　TLH重組蛋白磁性免疫層析試紙條定量曲線Fig.4　Quantitative curve of TLH recombinant protein by MITS

3　討論

微生物檢測(cè)的方法主要包括傳統(tǒng)培養(yǎng)法、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)法等［29］。免疫學(xué)方法由于其準(zhǔn)確、可靠、快速、特異、成本低的特點(diǎn)，適合于大批樣品的快速篩選和檢測(cè)，具有廣泛的應(yīng)用前景。而在免疫學(xué)檢測(cè)方法開發(fā)中，高度特異性的單抗是關(guān)鍵要素之一。

基于TLH在VP中存在的廣泛性和種屬特異性，本研究嘗試了以重組蛋白His-TLH為抗原制備獲得了TLH的單克隆細(xì)胞株（TLH-DB2細(xì)胞株），研究發(fā)現(xiàn)TLH-DB2單抗對(duì)TLH重組蛋白具有高特異性反應(yīng)。采用His-TLH特異性單抗和磁性納米材料構(gòu)建的免疫磁珠，本研究構(gòu)建了基于His-TLH的競(jìng)爭(zhēng)性免疫層析試紙條。初步性能表征表明His-TLH單抗可以特異性檢測(cè)His-TLH重組蛋白，并可快速簡(jiǎn)便地進(jìn)行定量檢測(cè)（檢測(cè)限為0.0125 mg/L）。對(duì)水產(chǎn)品過敏原的檢測(cè)表明磁性免疫層析法穩(wěn)定性強(qiáng)，其磁信號(hào)在25℃條件下保存2年變化率 ＜10%［30］，且該方法操作簡(jiǎn)便，定性檢測(cè)在5—10 min左右，定量檢測(cè)約30 min，因而可作為分子生物學(xué)工具，應(yīng)用于重組溶血毒素的鑒定或檢測(cè)等研究領(lǐng)域。

本研究所獲TLH單抗對(duì)TLH重組蛋白表現(xiàn)出較高的特異性，可作為分子生物學(xué)檢測(cè)工具，如對(duì)重組溶血毒素進(jìn)行定性或定量檢測(cè)。此外，本研究中建立的免疫層析試紙條檢測(cè)方法是在為進(jìn)行任何優(yōu)化條件下的一種應(yīng)用探討，今后可通過優(yōu)化抗體偶聯(lián)量、層析體系等來提高其檢測(cè)靈敏度，為開發(fā)重組溶血毒素的快速診斷和檢測(cè)提供支撐。

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（責(zé)任編輯：程智強(qiáng)）

Establishment of magnetic immunochromatographic teststrip based on monoclonal antibody against recombinant protein TLH

LIU Ying-ying，WENGshi-qiang，LU Ying*，ZHAO Yong，PAN Ying-jie
（Shanghai Engineering Research Center of Aquatic Products Processing&Preservation，College of Foodscience&Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

In order todetect thermolabile hemolysin（TLH），the recombinant protein His-TLH was used to immunize a BALB/c mouse，the monoclonal antibody（MAb）against recombinant protein TLH was prepared by hybridoma technique，and then the purified MAb was conjugated with magnetic beads to prepare immunomagnetic beads（IMBs），thus a magnetic immunochromatographic teststrip（MITS）being established by taking the IMBs as labels for His-TLH.The test resultshowed that the MITS could be used for qualitative and quantitative assay of recombinant protein TLH，havingsuch advantages assimplicity，rapidity and highsensitivity（thedetection limit：12.5 ng/mL）.Thedeveloped MITS in thisstudy also provides a new means of rapid identification，diagnosis anddetection of recombination hemolysin.

Vibrio parahaemolyticus；Thermolabile hemolysin；Monoclonal antibody；Magnetic immunochromatographic teststrip

R446.6

A

1000-3924（2016）04-076-05

2015-06-01

上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目［滬農(nóng)科攻字（2009）第6-1號(hào)?；上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)部分地方院校能力建設(shè)項(xiàng)目（11310501100）；上海市科委工程中心能力提升項(xiàng)目（16DZ2280300）

劉瑩瑩（1989—），女，在讀碩士，研究方向：食品生物技術(shù)。E-mail：liuyingying0112@163.com

，Tel：021-61900503，E-mail：y-lu@shou.edu.cn