白樺BpMADS12基因啟動子的克隆及表達(dá)分析

楊　洋　王子佳　李慧玉　張瑞萍

(1.林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，黑龍江 哈爾濱 150040 2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆研究所，黑龍江 哈爾濱 150086)

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白樺BpMADS12基因啟動子的克隆及表達(dá)分析

楊洋1王子佳1李慧玉1張瑞萍2

(1.林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，黑龍江 哈爾濱 150040 2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆研究所，黑龍江 哈爾濱 150086)

為探究白樺BpMADS12基因的功能，克隆了BpMADS12基因上游1 750 bp啟動子序列，通過生物信息學(xué)對順式作用元件進(jìn)行分析，并利用農(nóng)桿菌花序浸染法將其遺傳轉(zhuǎn)化入擬南芥，然后通過β-葡萄糖苷酸酶(GUS)組織化學(xué)染色檢測BpMADS12啟動子的組織表達(dá)特性及干旱脅迫應(yīng)答。結(jié)果表明：BpMADS12啟動子序列中含有與開花、激素及干旱響應(yīng)等相關(guān)的順式作用元件；該啟動子在擬南芥中的表達(dá)模式呈現(xiàn)為在營養(yǎng)生長階段不表達(dá)，而進(jìn)入生殖生長階段后，在根、花葉、花瓣、雄蕊、雌蕊及種子等各個組織部位中均表達(dá)；PEG脅迫后處理組擬南芥中GUS表達(dá)量低于未處理組。研究顯示BpMADS12基因參與白樺的開花調(diào)節(jié)、激素應(yīng)答、脅迫響應(yīng)(干旱)等生物學(xué)過程，對生殖生長階段各組織器官的發(fā)育有一定的調(diào)控作用，且負(fù)調(diào)控干旱響應(yīng)途徑。

白樺；BpMADS12啟動子；順式作用元件；克?。槐磉_(dá)分析

MADS-box轉(zhuǎn)錄因子是生物界普遍存在的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，該家族分為2大類，第1類包含動物和真菌中的ARG80/SRF-like基因及植物中的M型MADS-box基因，第2類包含動物和真菌中的MEF2-like基因及植物中的MIKC-type基因。植物中典型的由MADS-box基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子含有高度保守的MADS結(jié)構(gòu)域，它包括1個半保守的I-結(jié)構(gòu)域、1個相對保守的K-結(jié)構(gòu)域和1個C-結(jié)構(gòu)域[1]。MADS-box基因在花器官形成、控制花期及成花轉(zhuǎn)變方面發(fā)揮著重要作用[2-3]。然而，隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)一些MADS-box基因在表皮毛、莖、葉、根等營養(yǎng)器官中表達(dá)并發(fā)揮著多樣的功能[4-9]。桉樹的ETL基因，屬于SOC1/TM3支系，有研究顯示該基因在營養(yǎng)器官和生殖器官中均有表達(dá)，尤其在根、莖、器官原基及雌雄花中[10]。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中，AGL11和AGL13在種子中有明顯的表達(dá)。在擬南芥的根中至少有50個MADS-box基因有表達(dá)[11-12],在其發(fā)育過程中AGL14通過PIN的轉(zhuǎn)錄調(diào)控來控制生長素的極性運(yùn)輸[13],GhMADS11在纖維中特異表達(dá)，在酵母中過表達(dá)GhMADS11可以促使細(xì)胞伸長[14]。這些結(jié)果顯示，MADS-box基因在植物的營養(yǎng)器官中有多種表達(dá)模式，可能與植物器官的生長發(fā)育過程有一定的調(diào)控作用[15]。

本研究克隆的白樺(Betulaplatyphylla)BpMADS12基因(GenBank Accession number: JF721399)屬于MADS-box基因家族SOC1/TM3亞族。通過PCR擴(kuò)增技術(shù)從白樺中得到BpMADS12啟動子序列，并對BpMADS12基因啟動子元件進(jìn)行分析。將克隆到的啟動子構(gòu)建到植物表達(dá)載體上，并用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥，對轉(zhuǎn)BpMADS12啟動子擬南芥及干旱脅迫后的轉(zhuǎn)BpMADS12啟動子擬南芥進(jìn)行GUS染色分析，研究BpMADS12啟動子的表達(dá)模式。

1　材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

BpMADS12啟動子克隆材料取自東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種試驗(yàn)基地10年生已開花結(jié)實(shí)的白樺，擬南芥為哥倫比亞野生型。

DNA提取試劑盒和純化試劑盒購于天根生物技術(shù)公司；ExTaq聚合酶、T4連接酶、BamHI 內(nèi)切酶、SalI 內(nèi)切酶購于寶生物工程(大連)有限公司；農(nóng)桿菌EHA105 和pBI101載體均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2試驗(yàn)方法1.2.1BpMADS12基因啟動子克隆根據(jù)白樺基因組信息(已完成測序及拼接工作，尚未網(wǎng)上公布)，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增BpMADS12基因上游1 750 bp的基因組序列，引物由上海生工公司合成，上下游引物序列分別為: 5‘-GTACGTCGACAGAGAGGAGAGAGGAGAGAGG-3’(下劃線為SalI酶切位點(diǎn))；5‘- GTACGGATCCTACCTTCACAACAAGGTGAGG-3’(下劃線為BamHI酶切位點(diǎn))。以白樺總DNA為模板，20 μL PCR擴(kuò)增體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆BpMADS12基因啟動子，反應(yīng)體系如下：1×Ex Taq PCR Buffer，2.5 mmol/L dNTPs，DNA模板1 μL，上下游引物各為20 mmol/L，Ex Taq DNA 聚合酶2 U/μL，無菌水補(bǔ)足20 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。并進(jìn)行膠回收純化后備用。1.2.2BpMADS12基因啟動子順式作用元件預(yù)測為了研究BpMADS12基因的可能功能，使用在線順式作用元件預(yù)測軟件PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)和PlantCARE(http://bioinformatics. psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/)對該基因的啟動子序列進(jìn)行了分析[16-17]。

1.2.3植物表達(dá)載體構(gòu)建分別對BpMADS12啟動子膠回收產(chǎn)物和植物表達(dá)載體pBI101質(zhì)粒進(jìn)行BamHI和SalI雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。使用OMEGA純化試劑盒對得到的啟動子和載體的酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化后產(chǎn)物用T4 DNA連接酶16 ℃過夜連接，連接反應(yīng)完成后，通過熱擊法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Trans5α感受態(tài)細(xì)胞中。PCR檢測條帶位置正確的陽性克隆送往上海英俊生物公司測序。保存經(jīng)測序比對正確的重組質(zhì)粒，通過電擊法將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中，轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR驗(yàn)證后保存?zhèn)溆谩?.2.4轉(zhuǎn)化擬南芥及篩選根據(jù)Steven等[18]的花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥，培養(yǎng)農(nóng)桿菌菌液至OD600=1.0～1.2，室溫4 000 r/min離心10 min收集菌體，用轉(zhuǎn)化介質(zhì)(10 mmol/L 氯化鎂，5%蔗糖，200 μL/L Silwet-77)重懸菌體，侵染擬南芥花序30 s，避光24 h后將其置于正常光下培養(yǎng)，3 ～ 4周后可收獲種子。

收取浸花法轉(zhuǎn)化后的擬南芥種子在含50 mg/mL卡那霉素的選擇培養(yǎng)基選擇陽性克隆，并分單株移栽到基質(zhì)中，待其成熟后進(jìn)行PCR檢測，并收取種子，作為親本進(jìn)行自交并使用相同培養(yǎng)基篩選直至獲得純合子。播種，作為脅迫處理的材料。

1.2.5BpMADS12基因啟動子表達(dá)模式分析將純合的轉(zhuǎn)BpMADS12基因啟動子擬南芥種子播種，并從種子春化后1 、3 、5 、7 、15 、30 d進(jìn)行融合基因GUS染色，染色方法參見Li等[19]的研究，觀察BpMADS12基因啟動子的表達(dá)部位，拍照。

1.2.6轉(zhuǎn)BpMADS12基因擬南芥脅迫干旱處理分別選用3株野生型和轉(zhuǎn)BpMADS12 啟動子擬南芥,使用15 %的PEG處理進(jìn)行模擬干旱脅迫。處理3 d后取擬南芥各組織部位進(jìn)行GUS染色，染色方法同上。

2　結(jié)果與分析

2.1BpMADS12基因啟動子克隆

根據(jù)白樺基因組信息，以白樺總DNA為模板，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增BpMADS12基因啟動子區(qū)。通過瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示在1 750 bp擴(kuò)增出特異條帶(圖1)，與目的基因長度一致。通過測序進(jìn)一步證實(shí)為BpMADS12基因的啟動子。

2.2BpMADS12基因啟動子順式作用元件預(yù)測

通過PlantCARE及PLACE數(shù)據(jù)庫對白樺基因組DNA為模板克隆的1 750 bp啟動子序列進(jìn)行分析(圖2和表1)，該序列中除了含有啟動子的基本轉(zhuǎn)錄元件TATA-box、CAAT-box，還含有2個開花相關(guān)元件(POLLEN1LELAT52和GTGANTG10)，多個激素相關(guān)元件(ARR1AT，WRKY71OS，CGCGBOXAT，TCA-motif)，5個干旱響應(yīng)元件(MYB1AT，MYBCORE，MYCATRD22，MYB2CONSENSUSAT，MBS)，多個光響應(yīng)元件等。由此可以推測該基因可能參與到了白樺的開花調(diào)節(jié)，激素應(yīng)答，脅迫響應(yīng)(干旱)，光響應(yīng)等生物學(xué)過程中。

元件名元件序列拷貝數(shù)功能TATA-boxTATA46核心啟動元件CAAT-boxCAAT37啟動子增強(qiáng)區(qū)保守元件POLLEN1LELAT52AGAAA13花粉特異表達(dá)的順式作用元件 GTGANTG10GTGA6花粉特異表達(dá)的順式作用元件 circadianCAANNNNATC1生理周期調(diào)控元件GATA-boxGATA3光響應(yīng)元件ACEAAAACGTTTA1光響應(yīng)元件GA-motifAA(A/G)GA-(T/A)GA4光響應(yīng)元件部分序列GAG-motifAGAGAGT2光響應(yīng)元件部分序列TCT-motifTCTTAC3光響應(yīng)元件部分序列AE-boxAGAAACTT1光響應(yīng)元件部分序列AT1-MotifATTAATTTTACA1光響應(yīng)元件部分序列ARR1ATNGATT8細(xì)胞分裂素響應(yīng)元件WRKY71OSTGAC5赤霉素響應(yīng)元件CGCGBOXATVCGCGB1脫落酸和乙烯響應(yīng)元件TCA-motifCAGAAAAGGA1水楊酸響應(yīng)元件W-boxTTGACC1激素,傷害響應(yīng)元件DOFCOREZMAAAG9傷害響應(yīng)元件WBOXNTERF3TGACY3傷害響應(yīng)元件WBOXATNPR1TTGAC2傷害響應(yīng)元件MYBCORECNGTTR1干旱誘導(dǎo)相關(guān)的MYB結(jié)合位點(diǎn)MYB1ATWAACCA3干旱誘導(dǎo)相關(guān)的MYB結(jié)合位點(diǎn)MYCATRD22CACATG1干旱誘導(dǎo)相關(guān)的MYC結(jié)合位點(diǎn)MYB2CONSENSUSATYAACKG3干旱誘導(dǎo)相關(guān)的MYB結(jié)合位點(diǎn)MBS(T/C)AACTG3干旱誘導(dǎo)相關(guān)的MYB結(jié)合位點(diǎn)CCAAT-boxCCAAT3熱激信號響應(yīng)元件Skn-1-motifGTCAT2胚乳表達(dá)調(diào)節(jié)元件GCN4-motifCAAGCCA1胚乳表達(dá)調(diào)節(jié)元件5'UTRPy-rich延伸TTTCTTCTCT1高轉(zhuǎn)錄水平元件

2.3植物表達(dá)載體構(gòu)建

通過啟動子順式作用元件分析預(yù)測得知，獲得的BpMADS12啟動子片段既具有啟動子的核心元件又含有與開花、干旱、激素、光響應(yīng)相關(guān)的元件。為研究BpMADS12在植物體內(nèi)的表達(dá)模式，構(gòu)建BpMADS12啟動子與GUS報(bào)告基因融合的植物表達(dá)載體，PCR檢測結(jié)果見圖3。

2.4轉(zhuǎn)化擬南芥及篩選

通過浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥，暗處理24 h后，移到長日照(16 h光照，8 h黑暗)培養(yǎng)室培養(yǎng)，待成熟后收取種子，在選擇培養(yǎng)基上篩選獲得陽性單株，播種后，待其長出8 ～ 10片真葉時撕取1 ～ 2片葉子提取DNA作為模板，使用BpMADS12基因啟動子特異性引物進(jìn)行PCR檢測。結(jié)果顯示,所獲得的4個陽性單株總DNA為模板的PCR產(chǎn)物于1.0 %的瓊脂糖凝膠上電泳，均在1 750 bp左右出現(xiàn)特異條帶(圖4)，這與BpMADS12基因啟動子片段大小一致。證明BpMADS12基因啟動子成功整合到了擬南芥基因組中并能穩(wěn)定表達(dá),可以作為后續(xù)研究的材料。

2.5BpMADS12基因啟動子表達(dá)模式

將純合的轉(zhuǎn)BpMADS12基因啟動子擬南芥種子播種，并從種子春化后開始分階段進(jìn)行融合基因GUS染色，從而了解該基因的表達(dá)模式，見圖5。從圖5中可以看出，BpMADS12基因在擬南芥中的表達(dá)模式呈現(xiàn)為在營養(yǎng)生長階段不表達(dá)(1、3、5、7、15 d)，而進(jìn)入生殖生長階段后，花瓣，雄蕊、雌蕊及種子等生殖器官及根、花葉等營養(yǎng)器官中均表達(dá)(30 d)。

2.6轉(zhuǎn)BpMADS12基因啟動子擬南芥的耐旱性

通過預(yù)測發(fā)現(xiàn)BpMADS12基因啟動子序列中含有5個與干旱誘導(dǎo)相關(guān)的MYB(MYC)結(jié)合位點(diǎn)元件，所以對轉(zhuǎn)BpMADS12基因啟動子擬南芥進(jìn)行了干旱脅迫處理。根據(jù)BpMADS12基因啟動子的表達(dá)模式，選取開花結(jié)實(shí)期進(jìn)行干旱處理。用15 %的PEG處理3 d后取轉(zhuǎn)BpMADS12擬南芥各組織部位進(jìn)行GUS染色,結(jié)果見圖6。結(jié)果顯示，脅迫后未處理組擬南芥中GUS表達(dá)量高于15 %PEG處理擬南芥，可能是該基因在干旱響應(yīng)途徑中起著負(fù)調(diào)控作用，有待進(jìn)一步研究。

3　結(jié)論與討論

BpMADS12是MADS-box基因家族SOC1/TM3亞族的一員[20]。SOC1/TM3亞族基因在植物各營養(yǎng)組織器官中均發(fā)揮著作用。SOC1亞族基因AGL19在莖中表達(dá)，通過春化作用途徑促進(jìn)植物開花[21]。桉樹(Eucalyptusspp.)ETL基因(AGL14/AGL19同源基因)主要在幼根維管及根分生組織中表達(dá)，在器官原基、莖分生組織和生殖器官中也有表達(dá)[10,22]。楊樹(Populusspp.)的MADS-box5(PTM5)在正分化的初生、次生木質(zhì)部及韌皮部有表達(dá)[15]。現(xiàn)在已知的轉(zhuǎn)SOC1基因的擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryza.sativa)、玉米(Zeamays)、小麥(Triticumaestivum)、大豆(Glycinemax)、榛子(Corylus heterophylla)等與非轉(zhuǎn)基因植株相比花期提前[23-30]。但雜種山楊(Populusdavidiana)中FPF1對花期沒有任何影響，卻在木材形成過程中發(fā)揮了重要作用。以上研究說明SOC1/TM3亞族基因在不同物種中存在功能分歧。在本研究中，通過組織化學(xué)染色分析得知BpMADS12啟動子在擬南芥中的表達(dá)模式呈現(xiàn)為在營養(yǎng)生長階段不表達(dá)，而在生殖生長階段的各個組織部位中均表達(dá),說明BpMADS12基因?qū)ι成L階段各組織器官的生長發(fā)育有一定的調(diào)控作用。

通過啟動子順式作用元件分析預(yù)測得知，獲得的BpMADS12啟動子序列除了含有啟動子的核心元件外，還含有一些激素響應(yīng)元件，如細(xì)胞分裂素調(diào)節(jié)相關(guān)元件ARR1AT[31]；核心序列為TGAC的WRKY710S元件，響應(yīng)赤霉素信號途徑[32]；水楊酸響應(yīng)元件TCA-motif。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)過表達(dá)BpMADS12白樺中激素合成及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑差異基因顯著富集(under review),在其他物種中也發(fā)現(xiàn)MADS-box家族基因參與激素信號調(diào)控;OsMADS29通過影響細(xì)胞分裂素合成途徑調(diào)控種子發(fā)育[33]。OsMADS1敲除后的水稻，其生長素合成、極性分布和一些信號因子都受到影響[34-35]。這些結(jié)果均說明,MADS-box蛋白通過激素信號影響植物的生長發(fā)育。

BpMADS12啟動子序列中含有5個干旱誘導(dǎo)相關(guān)元件，通過PEG脅迫后處理組擬南芥中表達(dá)量低于未處理組，說明該基因在干旱響應(yīng)途徑中起著負(fù)調(diào)控作用。在擬南芥中研究發(fā)現(xiàn)SOC1基因參與逆境過程。微陣列分析尋找下游擬南芥SOC1的靶基因鑒定了的多條冷誘導(dǎo)基因，例如COR基因，在它的啟動子區(qū)域和CRT/DRE連接因子(CBFs)區(qū)域。CHIP試驗(yàn)證實(shí)了SOC1能夠直接作用于CBF基因的啟動子，這意味著SOC1參與冷應(yīng)答途徑[36]。

啟動子順式作用元件分析為揭示白樺BpMADS12基因的功能提供了方向，對于該基因功能的深入研究需要實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步揭示。

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(責(zé)任編輯張坤)

Cloning and Expression Analysis of BpMADS12 Promoter fromBetulaplatyphylla

Yang Yang1, Wang Zijia1, Li Huiyu1，Zhang Ruiping2

(1.State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding (Northeast Forestry University), Harbin Heilongjiang 150040, China 2.Soybean Reasearch Institute,Heilongjiang Academy of Agricaltural Sciences,Harbin Heilongjiang 150086,China)

To characterize the function ofBpMADS12, a 1 750 bp flanking sequence upstream of the translation initiation codon was cloned, and several putative cis-regulatory elements were deciphered from the promoter sequence ofBpMADS12 using PLACE and PlantCARE web tools, and constructed into vector pBI101, and was transferred intoArabidopsisthaliana, then investigated the expression pattern and drought stress response via histechemical GUS staining. The results showed that flowering, multiple hormone-responsive and drought-responsive elements were predicted in the promoter region. Histechemical GUS staining showed that theBpMADS12 promoter expressed in all tissues and organs during reproductive phase, such as roots, floral leaves, petals, stamens, pistils, seeds, and so on, instead of vegetative phase; and the GUS expression was down-regulated in transgeneticArabidopsisthalianaafter PEG stress. In conclusion,BpMADS12 participates in biological processes of flowering, hormone response, drought stress response, and regulates the development of all tissues and organs during the generative growth phase to some extent, and drought responsive pathway negatively.

Betulaplatyphylla;BpMADS12 promoter; cis-elements analysis; clone; expression analysis

2015-08-06

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計(jì)劃課題(2012BAD21B02)資助;哈爾濱市應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)項(xiàng)目(2013RFXYJ082)資助。

李慧玉(1978—)，女，博士，副教授。研究方向：林木遺傳育種。Email：lihuiyu0519@aliyun.com。

10.11929/j.issn.2095-1914.2016.01.002

S718.46

A

2095-1914(2016)01-0009-07

第1作者：楊洋(1991—)，女，碩士生。研究方向：林木遺傳育種。Email：929118066@qq.com。