復雜性狀遺傳CC小鼠
——腫瘤研究新平臺

李克娟，高　苒

(北京協和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，北京100021)

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復雜性狀遺傳CC小鼠
——腫瘤研究新平臺

李克娟，高苒

(北京協和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，北京100021)

癌癥是由于機體細胞失去正常調控過度增殖而引發(fā)的一系列復雜性狀疾病的統(tǒng)稱，其本質上是一種基因疾病。用于傳統(tǒng)腫瘤小鼠模型的重組近交(RI)品系由于只起源于兩個近交祖系，因此規(guī)模小且等位基因多樣性較少，在統(tǒng)計功效上存在局限性。復雜性狀遺傳(Collaborative Cross mice, CC)小鼠是由來自八個原始種系近交產生的數百種基因型不同的小鼠品系，能夠體現不同小鼠亞種的遺傳學變異，具有高遺傳多樣性，大種群規(guī)模等重要特征。它可以模擬人類復雜性狀疾病中不同人群對病因或治療方法個體易感性的差異，為促進復雜性狀疾病易感基因篩查、基因功能發(fā)現等方面的研究提供了一個更好的研究工具與信息平臺。本文就CC小鼠在醫(yī)學應用中的研究現狀、挑戰(zhàn)性與局限性、以及其在腫瘤研究中的應用前景進行綜述。

復雜性狀遺傳小鼠(CC小鼠)；遺傳多樣性；個體易感性；腫瘤

癌癥是由于多種致癌因素激活原癌基因或(和)滅活腫瘤抑制因子，使細胞發(fā)生轉化并無限增殖的一類基因組疾病的統(tǒng)稱[1]。癌癥已成為世界范圍內高發(fā)病率和高死亡率的主要原因之一。根據世界衛(wèi)生組織(WHO)2014年發(fā)布的數據顯示，2012年全世界共新增1400萬癌癥病例并有820萬人死亡[2]。其中，中國新增307萬癌癥患者并造成約220萬人死亡，分別占全球總量的21.9%和26.8%。據Siegel[3]最新研究報道，種族對腫瘤的發(fā)病率具有非常顯著的影響。在所有癌癥種類中，黑色人均比白色人種擁有更高的癌癥發(fā)病率和死亡率(腎癌的死亡率除外)，幾乎是亞太裔人種的2倍。此外，性別對癌癥的發(fā)病率也有顯著影響，與女性相比男性的泌尿系統(tǒng)癌癥發(fā)病率和死亡率均是女性的2倍左右。大量流行病學研究與臨床觀察表明大部分癌癥(約90%～95%)都是由環(huán)境因素導致的[4]，其余的5%～10%則是由遺傳因素導致的[5]。但是對于相同的致癌風險為什么有些人更加易感仍然是一個謎。另一方面，為什么有些腫瘤患者對同一藥物表現出更好的敏感性或者對治療方案表現出更好的治療效果，對此臨床上也沒有給出科學的解釋。例如，我們知道白血病是一種常見的惡性程度極高的腫瘤，曾經一度是被認為是一種“無藥可救”的疾病。隨著2012年第一例白血病患者的治愈，免疫療法CAR-T給白血病患者帶來了希望，但是同樣是白血病患者，CAR-T療法卻也不能達到100%的治愈效果，而白血病臨床分型非常復雜，如何在這些分型中找到針對CAR-T療法有效的分型對于白血病的治療是否成功尤為重要。為此在第15屆愛丁堡全球小鼠基因峰會上，美國橡樹嶺國家實驗室(Oak Ridge National Laboratory)提出了復雜性狀遺傳(Collaborative Cross，CC)小鼠育種計劃，并建立了復雜性狀聯盟(Complex Trait Consortium，CTC)組織[6]，用于選擇培育一種更適用于研究復雜性狀或復雜病因疾病的研究工具，以模擬人群基因多樣性進行復雜形狀的相關研究[7]。

1　CC小鼠

CC小鼠的理念背后是為了充分開發(fā)RI小鼠的潛能，并將這種潛能發(fā)揮到極致。眾所周知，RI小鼠是由兩個無關高質近交系進行雜交，用其F2代進行全同胞兄妹交配20代以上而育成的新近交系，其近交系數達98.6%以上。RI具有雙親近交系特性和重組后新近交品系特性，大大推動了遺傳學，腫瘤學，免疫學和行為學等學科的發(fā)展。RI小鼠因為其具備來源清楚，個體間均一性高，組織相容性高，重復性好等優(yōu)點，到目前為止已成為腫瘤病因學，腫瘤藥理學等研究的理想和經典模型并且被廣泛應用。但是RI小鼠由于受到遺傳多樣性(genetic variability)與映射能力(mapping power)的局限也存在很多不足。遺傳多樣性的不足是因為RI小鼠僅由兩個親本品系雜交而來，并且這些親本品系往往起源于共同的祖系，更加限制了遺傳多樣化。而映射能力取決于測試過程中可以獲取的品系。常用的基因片段的分辨率通常在2～4 cM(～ 4至8 Mb)，但是傳統(tǒng)的RI小鼠在后基因組時代不足以提供有效的候選基因進行分析。第一個問題可以通過使用8個原始品系，其中包含來自不同大陸的野生型品系，來代替原來的2個親本品系來解決。第二個問題則可以通過產生大量的RI品系來解決。CC小鼠的概念的提出正好彌補了這些不足，所選的8個原始品系使得CC小鼠的遺傳多樣性最大化，其中包括三種剛剛完成基因組測序的實驗用近交系：A/J，C57BL/6J和129S1/SvImJ，以及來自日本和新西蘭被用作自身免疫與肥胖模型的兩個品系NOD/LtJ和NZO/HiLtJ，除此之外，使用來自小鼠3個Mus亞種的野生近交系作為補充，他們分別是來自捷克布拉格的PWK/PhJ(Mus.musculus.musculus)，來自美國巴爾的摩的WSB/EiJ(Mus.musculus.domesticus)，以及來自泰國的CAST/Ei(Mus.musculus..castaneus)[8, 9]。他們的遺傳物質的多樣性可以基本覆蓋小鼠全基因組的90%[10]，且親緣關系相對較遠，可以保證CC品系遺傳位點的分散性[11]。

CC小鼠的育種過程如圖1所示，八種原始品系作為G0代，首先互相交配形成56種可能的G1代雜交組合，然后，56個G1品系再分別進行交配得到1680種可能的G2代雜交組合，G2代品系再次進行交配可以獲得8！(40 320)種組合可能的G3代雜交小鼠。通過G3：F1代進行數代的同胞近交，大概在G3：F20時獲得充分近交的子代，最終繁育形成獨立的CC小鼠品系。每個CC小鼠品系都將隨機獲得八個原始品系小鼠所有的遺傳變異，這種獨一無二的基因重組模式稱為“漏斗型育種”(breeding funnel)。CC小鼠在繁殖過程中的控制和最小隨機化選擇將目前存在于這些自交系中的自然遺傳變異進行充分重組，使得該實驗種群的每個重組位點都是獨一無二的，可提供足夠的資源來研究單基因附近的數量性狀位點(QTL)[6, 13]。其結果將是一個具高遺傳多樣性的大種群規(guī)模的獨特品系，為近交系小鼠的表型表達帶來巨大的遺傳變異潛能[14, 15]。

CC小鼠項目最初在杰克遜實驗室(The Jackson Laboratory)運作，而后將G3：F1代運至3個育種機構，包括美國田納西州的橡樹嶺國家實驗室(Oak Ridge National Laboratory)，后來被遷移到北卡羅來納大學教堂山分校(CC-UNC)[7]；肯尼亞內羅畢的國際家畜研究中心(The International Livestock Research Institute)，后來被遷移至以色列的特拉維夫大學(Tel Aviv University) (CC-TAU)[16]；以及澳大利亞佩斯的西澳醫(yī)學研究中心/西澳大學(Western Australia Institute for Medical Research/University of Western Australia/Geniad Ltd.) (CC-GND)[12]。目前，在上述3個機構共育有約200個CC品系[17]。

2　CC小鼠的研究及其醫(yī)學應用

CC種群平衡的等位基因頻率，均勻分布的重組位點和表型分布都優(yōu)于其他實驗資源[18-20]。經過十幾年的發(fā)展，CC小鼠已被用于遺傳學，傳染病學和免疫學等研究領域并取得了突破性研究進展。例如基因定位，Ram等[21]利用120個CC小鼠品系的毛色設計了一個原理循證研究，不論使用SNP-Based法或者一種基于QTL定位法，調節(jié)六種毛色表型的四種基因均被成功定位。CC小鼠作為一種新型的動物模型在醫(yī)學研究中的優(yōu)勢也日益凸顯，目前已經有兩個利用CC小鼠成功構建疾病模型的案例，一個是潰瘍性結腸炎[22],另外一個是糖尿病視網膜病變[23]。同時，對于大規(guī)模不同遺傳背景的小鼠品系在群體層面對各種生理和病理表型進行全面分析，可揭示各種表型與潛在的遺傳變異、基因之間，以及基因與環(huán)境之間的相互作用，為人類復雜性疾病的研究和理解提供更多的證據。Rasmussen等[24]利用47個CC小鼠品系感染埃博拉病毒，發(fā)現19%的小鼠品系能夠抗病毒并且能夠在兩周內恢復體重，11%的小鼠品系對病毒有部分抗性，70%的小鼠品系感染病毒后病死率超過半數以上。不同品系的小鼠表現出的癥狀也有差異，有的小鼠只出現肝臟炎癥，有的小鼠則表現出凝血障礙等埃博拉病毒感染的的標志性癥狀。這些小鼠很好地模擬了人群患病的不同病理過程。研究人員還比較了最易感和最不易感的兩種CC小鼠的基因表達模式，發(fā)現內皮細胞酪氨酸激酶基因Tiel和Tek的轉錄水平有顯著差異，而這兩種酶與凝血功能有關。研究表明埃博拉感染的嚴重程度與宿主的遺傳背景有很大關系，而不能單從病毒方面進行解釋。此外，Ferris[25], Leist[26], 以及Xiong 等[27]人分別將H1N1亞型流感病毒，H3N2亞型流感病毒以及SARS流感病毒感染CC小鼠的8個原始品系，均通過品系間的表型差異揭示了宿主易感背后的遺傳學機理。此外，Durrant等[28]在真菌感染實驗中使用了4種近交系小鼠(BALB/CJ，DBA/2J，C3H/HeJ，C57BL/6J)和66個CC小鼠品系定位了煙曲霉菌易感的候選基因。與此類似，Vered等[29]使用上述4種近交系小鼠和73個CC小鼠品系通過評價腹腔內接種克雷伯氏肺炎桿菌后的存活時間差異證實了不同CC小鼠品系感染細菌后存在表型多樣性。

具有高度遺傳多樣性的CC小鼠無疑也為腫瘤這一復雜性狀疾病的研究提供了一個絕佳的機會。Ferguson等[30]首次將CC小鼠應用在腫瘤研究上，他們評價了50個CC小鼠黑色素瘤的特征，其中包括色素痣，色素瘤的發(fā)病時間及其多樣性，解剖位置偏好，色素痣轉化為黑色素瘤以及其轉移的時間。研究表明不同CC小鼠品系間表現出了廣泛的差異(圖2)。此外，研究還發(fā)現，紫外線輻射暴露加劇了大多數小鼠品系的新生仔色素痣和黑色素瘤的形成，但是仍有少部分CC小鼠品系并未表現出該現象。這表明CC小鼠體內的遺傳變異將有助于解釋對陽光暴曬(皮膚癌的主要環(huán)境致癌因素)的個體敏感性。由于在一個小鼠模型里面CC小鼠的遺傳變異帶來了引人注目的表型多樣性，黑色素瘤相關的內表型對比給我們提供了有關致癌的機制，例如黑色素瘤發(fā)病率是否依賴于預先存在的色素痣細胞的密度。已有的小鼠模型已被用于研究基因突變在腫瘤發(fā)生過程中的功能作用。CC小鼠模型將在下一階段進一步研究生物變異或者遺傳變異如何最大程度地影響腫瘤的形成與發(fā)病機制。

圖1　CC小鼠育種設計方案。8個原始品系被定義為G0并且它們的基因組構成分別使用8種顏色來代替[12]Fig.1　Breeding strategy to generate a single breeding “funnel.” The eight founder strains are designated as G0 and their genomes are represented by different colors.

3　CC小鼠的局限性

圖2　紫外線照射條件下不同CC小鼠品系色素痣及黑色素瘤的數目差異 [30]注：(A)色素痣；(B)黑色素瘤。Fig.2　Average number of nevoid plaques and melanomas per mouse for each CC strain background.Note. (A) nevoid plaques; (B) melanomas.

CC小鼠相關的報道主要集中在病毒細菌和真菌等感染性疾病的研究中，為了更好地利用CC小鼠來研究人類復雜性狀疾病，需要解決當前存在的某些局限性，因為近交動物經常會出現健康問題，生殖能力也會下降，據報道，CC小鼠在近交傳代5代后，有90%的小鼠將不再繁殖[31]，因此尋求更好地方法做好CC小鼠的繁殖與保種工作顯得尤為重要。同時，利用CC小鼠作為動物模型進行研究時，需要使用70個品系以上才能基本消除不同品系帶來的假陽性結果，而目前的研究報道很少能夠達到這一品系數目的要求，使得QTL分辨率達不到基因水平[32]。如何創(chuàng)造更好的實驗條件來實現大規(guī)模群體實驗來彌補這一缺陷，為更加精準的定位易感基因，研究復雜性狀疾病也是開展CC小鼠研究亟待解決的問題之一。

4　CC小鼠在腫瘤研究中的應用前景

CC小鼠在腫瘤領域的研究剛剛起步，目前僅在黑色素瘤的易感性表型差異上面有相關研究報道。與此同時，CC小鼠作為一種新型研究工具與信息平臺，將越來越受到腫瘤研究者們的關注及應用。研究者可以利用CC小鼠資源進行腫瘤的病因學研究，用以模擬不同人群對致癌因子的敏感差異，加上系統(tǒng)遺傳學方法對腫瘤易感基因進行篩查；還可以利用CC小鼠模擬評價不同人群對現有抗腫瘤藥物的藥敏藥效以及藥理作用，尋找藥物靶向基因；此外，CC小鼠因其具有豐富的性狀差異與遺傳多樣性，可以幫助我們理解類似前面所述的為什么不同白血病患者對CAR-T療法的不同反應的問題，并且可以幫助我們找到CAR-T療法的易感表型和易感基因，類似的，其他有效療法也可以更加準確的定位相關表型或者相關基因，實現精準治療。這一切都表明CC小鼠將在腫瘤領域掀起一股劃時代的具有革命意義的研究風潮，將為實現精準的分子診斷及精準醫(yī)療提供更多的臨床前指導數據。

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Collaborative Cross mice as a novel platform in cancer research

LI Ke-juan, GAO Ran

(Institute of laboratory animal sciences, CAMS & PUMC, Beijing 100021, China)

Cancer is a general term of a series of complex traits of the disease triggered by the body cells losing their normal regulation of excessive proliferation, which essentially is a genetic disease. Recombinant inbred strain (RI) mouse generated from one pair of founders has been widely used in traditional tumor model. However, RI has many limitations on the statistic efficiency because of the small scale and lacking of allele diversity. The Collaborative Cross (CC) was designed to generate hundreds of recombinant inbred lines by 8 divergent strains of mice. CC mice embody a tremendous amount of natural genetic variation in different sub-strains of mouse and the single nucleotide polymorphism is four times of the traditional experimental mice. The high-genetic diversity and large scale population enables CC mice simulates the differences of individual susceptibility to the pathogeny or the therapies,thus provides a better research tool and information platform for expediting discovery of genes and genes function in human complex traits diseases. This review summarizes our current knowledge of this field, including methodologic aspects, applications, challenges and limitations, and utilization for cancer research.

Collaborative Cross; Genetic diversity; Individual sensitivity; Cancer

中國醫(yī)學科學院基本科研業(yè)務費專項資助項目(DWS201402)。

李克娟(1987-)，女，博士，研究方向：腫瘤模型構建。E-mail：likejuan@cnilas.org。

高苒(1980-)，女，副研究員，研究方向：腫瘤模型構建。E-mail：gaoran26@hotmail.com。

專題研究

R-33

A

1671-7856(2016) 08-0025-05

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.08.000

2016-07-05