巴戟天多糖對骨質(zhì)代謝相關(guān)基因的影響

朱孟勇 吳洋洋

巴戟天多糖對骨質(zhì)代謝相關(guān)基因的影響

朱孟勇 吳洋洋

目的 研究巴戟天多糖對骨質(zhì)代謝相關(guān)基因的影響。方法 使用雙能量X射線吸光測定法（DEXA）測定骨礦質(zhì)元素含量（BMC）和使用一個Hologic QDR 1000和Hologic’s小動物程序測定骨礦質(zhì)元素密度（BMD）。按照RNA分離試劑盒的說明分離RNA。結(jié)果 藥理學(xué)分析表明能顯著提高鼠骨的礦質(zhì)元素密度和含量，巴戟天多糖處理能夠增加骨相關(guān)基因 （BMP-2、Cbfal、Dmp1、rRANKL、rALP、rOPG、rPPARγ2 mRNA） 的表達(dá)。結(jié)論 藥理學(xué)試驗表明巴戟天多糖能刺激骨代謝相關(guān)基因的表達(dá)及提高骨礦質(zhì)元素密度和含量。

巴戟天多糖 骨代謝相關(guān)基因

骨質(zhì)疏松癥是以骨質(zhì)損失和骨組織微結(jié)構(gòu)退行性變化為特點(diǎn)的骨病，伴隨高齡人口的增加，發(fā)病率不斷上升，是目前影響老年人生活質(zhì)量的重要疾病之一，骨質(zhì)疏松的發(fā)生與環(huán)境、遺傳、內(nèi)分泌系統(tǒng)變化及體內(nèi)氧自由基的損傷有關(guān)。中醫(yī)藥防治骨質(zhì)疏松具有一定的作用，巴戟天是亞洲地區(qū)治療骨科疾病的傳統(tǒng)中藥，對于免疫反應(yīng)引起的骨損傷及退行性骨病具有良好的治療作用，其中多糖是發(fā)揮藥理作用的主要成分，本文作者自2012年6月至2014年6月研究巴戟天多糖對骨礦質(zhì)元素密度和含量的影響，探討其對骨基因表達(dá)的影響。報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 2013年3月，作者于省內(nèi)一藥店購得巴戟天多糖樣品。

1.2 動物和處理 32只健康雌性wistar大鼠來自浙江中醫(yī)藥大學(xué)試驗動物中心。試驗開始前，鼠養(yǎng)育于籠中，溫度24℃，相對濕度 50%～60%，試驗期間維持12h 光/暗循環(huán)，在藥物處理前7d以實驗鼠適應(yīng)試驗條件。將大鼠隨機(jī)分成4組：對照組（I組）、模型組（II組）、低劑量組（III組）、高劑量組（IV組），每組各8只。模型組、低劑量組及高劑量組大鼠切除雙側(cè)卵巢后飼養(yǎng)4周建立骨質(zhì)疏松大鼠模型，對照組及模型組灌胃生理鹽水2ml/（kg·d），低劑量組及高劑量組灌胃巴戟天多糖溶液2ml/（kg·d），濃度分別為50mg/ml及150mg/ml，連續(xù)給藥30d后處死大鼠，取下脛骨，脛骨組織樣本立即冷凍在液氮中，貯藏溫度-80℃。

1.3 骨質(zhì)測定 使用雙能量X射線吸光測定法（DEXA）測定骨礦質(zhì)元素含量（BMC），使用Hologic QDR 1000和Hologic's小動物程序測定骨礦質(zhì)元素密度（BMD）。在不同測試中心由不同的檢測者使用Hologic QDR 1000對鼠后腿重復(fù)檢測。然后鼠腿燃燒成灰，余礦物質(zhì)稱重，即測定鼠腿骨礦質(zhì)元素合量。后將骨灰溶解于0.1mol/L鹽酸中，由不同檢測者用標(biāo)準(zhǔn)比色法測定鈣、鎂、磷的濃度。DEXA的測試精度由灰重量與骨礦物質(zhì)濃度間的相關(guān)系數(shù)及重量比較決定。

1.4 mRNA表達(dá) 按照RNA分離試劑盒的說明分離RNA。在260/280下，通過分光光度計分析RNA純度，RNA數(shù)量在260 nm下確定。在熱模擬實體中（Gene Amp? PCR system 2400，Perkin-Elmer，Roche，NJ，USA），cDNA 由240ng的總RNA經(jīng)兩步逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)合成試劑盒 （RT-PCR） 合成。特異的寡核苷酸序列是：BMP-2 F：5'-TCAGCGAGTTTGAGTTGAGG-3'。R：5'-GATGGCTTCTTCGTGATGG-3'；Cbfal F：5'-CCAAGAAGGCACAGACAGAA-3'。R：5'-TGGCTCAGATAAGAGGGGTAAG-3'；Dmp1 F：5'-CTGTCCTGTGCTCTCCCTGT-3'。R：5'-TCGTCTTCATCCTCCTCCTT-3'；rRANKL F：5'-GGCTGGGCCAAGATCTCTAAC-3'。R：5'-GTGTCCAACCCTTCCCTGTTG-3'；rALP F：5'-CCTTGAAAAATGCCCTGAAA-3'。R：5'-CTTGGAGAGAGCCACAAAGG-3'；rOPGF：5'-CTGTGAAAGCAGTGTGCAACG-3'。R：5'-AGGTTCTTGCACAGCTTCACC-3'；rPPARγ2 F：5'-CCCTGGCAAAGCATTTGTAT-3'。R：5'-ACTGGCACCCTTGAAAAATG-3'；GAPDH F：5'-CAAGTTCAACGGCACAGTCAA-3'。R：5'-TGGTGAAGACGCCAGTAGACTC-3'。為測定合成產(chǎn)品的線性范圍和精確的半定量分析，使用PCR動態(tài)測試和循環(huán)測定法。在95℃維持2min有30～35變性循環(huán)。在TA退火1min，72℃底物延長。反應(yīng)最后在72℃延長10 min。伴隨RT-PCR 反應(yīng)，排除空白對照 （無RNA 模板RT-PCR） 和RT（-） 反應(yīng) （無逆轉(zhuǎn)錄PCR）。PCR 產(chǎn)品在1.5%瓊脂糖硅膠中經(jīng)電泳分析，并經(jīng)溴化乙錠顯色。使用photographs和圖像分析軟件（Gel Documentation InGenius? L，Bio-Rod Lab，Hercules，CA，USA）進(jìn)行定性分析。The relative amount of BMP-2，Cbfal，Dmp1，rRANKL，rALP，rOPG，rPPARγ2 mRNA表達(dá)的相對量通過與GAPDH比較計算。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 巴戟天多糖對大鼠體重、BMD和BMC的影響 見表1。

表1 巴戟天多糖對卵巢切除鼠體重、BMD和BMC的影響（±s）

表1 巴戟天多糖對卵巢切除鼠體重、BMD和BMC的影響（±s）

注：與I組比較，*P＜0.01；與II組比較，#P＜0.01

組別體重（g）BMD （g/cm2）BMC （g）I組346.1± 16.50.241±0.0090.573±0.024 II組350.2±22.10.297±0.013*0.602±0.017 III組347.8±19.30.328±0.011*0.643±0.021# IV組343.8±25.10.352±0.013*0.692±0.030#

2.2 巴戟天多糖對鼠骨代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響 與正常對照組大鼠比較，巴戟天多糖處理能夠增加骨相關(guān)基因 （BMP-2、 Cbfal、Dmp1、 rRANKL、rALP、rOPG、rPPARγ2 mRNA） 的表達(dá)。在這些表達(dá)中，BMP-2、Cbfal、rRANKL、rALP 和 rPPARγ2 mRNA表達(dá)水平隨巴戟天多糖處理濃度的增加而升高。

3 討論

與其他骨形態(tài)發(fā)生蛋白類似，BMP-2 在骨與軟骨發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用［1］。其與hedgehog、TGF beta 信號路徑及 cytokine-cytokine 受體相互作用，亦與心肌細(xì)胞分化和內(nèi)皮細(xì)胞向間葉細(xì)胞過渡相關(guān)。Core-binding 因子（Cbfal）也稱作Pebp2aA（多瘤病毒提升蛋白） 或AML3 （急性骨髓性白血?。瑢儆趓untdomain 基因家族的轉(zhuǎn)錄因子之一［2］。Cbfal/Pebp2aA 控制成骨細(xì)胞中大量基因的表達(dá)［3］，Cbfal/Pebp 2a A-缺乏會導(dǎo)致骨發(fā)育延緩［4，5］。DMP1 是一個骨礦化的主要調(diào)節(jié)因子，其在成骨細(xì)胞向骨細(xì)胞過渡中發(fā)揮著重要作用?？赡芡ㄟ^礦化調(diào)節(jié)，DMP1在骨細(xì)胞調(diào)節(jié)機(jī)械應(yīng)力方面發(fā)揮著重要作用［6］。核因子 kappa-B 配體（RANKL）的受體也稱為腫瘤壞死因子，TNF-相關(guān)激活細(xì)胞因子 （TRANCE）、骨保護(hù)素配體 （OPGL）和骨細(xì)胞分化因子 （ODF）、核因子 kappa-B 配體 （RANKL）的受體激活是一個編碼人體TNFSF11基因的蛋白質(zhì)［7，8］。RANKL 在骨代謝過程中和必需的表面分子 （也稱作 CD254）能在骨細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，其能激活破骨細(xì)胞，破骨細(xì)胞與骨再吸收相關(guān)。ALP是成骨細(xì)胞表型信號，這一基因的時間表達(dá)說明在機(jī)械張力下MSCs向成骨細(xì)胞短期分化［9］。在骨微環(huán)境中，ODF mRNA/OPG mRNA決定了骨代謝的方向［10］（合成代謝或分解代謝）。過氧化物酶體增殖激活受體 γ2 （PPARγ2）是核受體轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，其能誘導(dǎo)多能性成骨細(xì)胞脂肪形成。如果PPARγ2在破骨細(xì)胞中表達(dá)，能抑止成熟破骨細(xì)胞表型和誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)［11］。

近年來，從生物中（蘑菇、藻類、地衣、高等植物）分離的多糖由于低毒性和較好的藥用價值，受到生物醫(yī)藥科研人員的廣泛關(guān)注［12］。雖然尚未完全理解這些物質(zhì)的作用機(jī)制，但可以確定這些機(jī)制與免疫力相關(guān)［12］。這些生物多糖的免疫刺激、抗腫瘤、抗菌和其他的治療效果是機(jī)體通過刺激巨細(xì)胞和調(diào)節(jié)補(bǔ)體系統(tǒng)實現(xiàn)的［13］。

巴戟天是一種著名的中草藥，在古代中國，用其治療一系列的病癥，包括消化不良、高血壓、呼吸系疾病及免疫力低下等［14］。巴戟天的主要生物活性物質(zhì)是蒽醌類，此成分具有抗HIV病毒、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗氧化、抗突變活力的作用［15］。

作者采用DEXA測定BMC和使用Hologic QDR 1000和Hologic's小動物程序測定BMD。按照RNA分離試劑盒的說明分離RNA。藥理學(xué)分析表明能顯著提高實驗大鼠BMD和BMC，巴戟天多糖處理能夠增加骨相關(guān)基因 （BMP-2、Cbfal、Dmp1、rRANKL、rALP、rOPG、rPPARγ2 mRNA） 的表達(dá)。藥理學(xué)試驗表明，巴戟天多糖能夠刺激骨相關(guān)基因的表達(dá)。

1 Lorden JF，Caud1e A.Behaviora1 and endocrino1ogica1 effects of sing1e injections of monosodium g1utamate in the mouse.Neurobehaviora1 Toxico1ogy & Terato1ogy，1986，8（5）：509～519.

2 Komori T，Kishimoto T.Cbfa1 in bone deve1opment.Current Opinion in Genetics & Deve1opment，1998，8（4）：494～499.

3 Ducy P，Zhang R，Geoffroy V，et a1.Osf2/Cbfa1：a transcriptiona1 activator of osteob1ast differentiation.Ce11，1997，89（5）：747～754.

4 Komori T，Yagi H，Nomura S，et a1.Targeted disruption of Cbfa1 resu1ts in a comp1ete 1ack of bone formation owing to maturationa1 arrest ofosteob1asts.Ce11，1997，89（5）：755～764.

5 Otto F，Thorne11 AP，Crompton T，et a1.Cbfa1，a candidate gene for c1eidocrania1 dysp1asia syndrome，is essentia1 for osteob1ast differentiation and bone deve1opment.Ce11，1997，89（5）：765～771.

6 Rios HF，Ye L，Dusevich V，et a1.DMP1 is essentia1 for osteocyte formation and function.Journa1 of Muscu1oske1eta1 and Neurona1 Interactions，2005，5（4）：325～327.

7 Wong BR，RhoJ Arron，Robinson E，et a1.TRANCE is a nove1 1igand of the tumor necrosis factor receptor fami1y that activates c-Jun N-termina1 kinase in T ce11s.The Journa1 of Bio1ogica1 Chemist ry，1997，272（40）：25190～25194.

8 Anderson DM，Maraskovsky E，Bi11ings1ey WL，et a1.A homo1ogue of the TNF receptor and its 1igand enhance T-ce11 growth and dendritic-ce11 function.Nature，1997，390 （6656）：175～179.

9 Qi MC，Zou SJ，Han LC，et a1.Expression of Bone-re1ated Genes in Bone Marrow MSCs after Cyc1ic Mechanica1 Strain：Imp1ications for Distraction Osteogenesis. Internationa1 Journa1 of Ora1 Science，2009，1（3）：143～150.

10 Chen D，Chen AM，Guo FJ.Expression of OPGmRNA and ODFmRNA in the patients of hip fracture due to osteoporosis.Journa1 of Nanjing Medica1 University，2007，21（5）：321～323.

11 Boto1in S，F(xiàn)augere MC，Ma11uche H，et a1.Increased bone adiposity and PPARγ2 expression in type I diabetic mice.Endocrino1ogy，2005，146（8）：3622～3631.

12 Tzianabos AO.Po1ysaccharide immunomodu1ators as therapeutic agents： structura1 aspects and bio1ogica1 function.C1inica1 microbio1ogy reviews，2000，13（4）：523～533.

13 Chihara G.Recent progress in immunopharmaco1ogy and therapeutic effects of po1ysaccharides.Deve1opments in Bio1ogica1 Standardizati on，1992，77：191～197.

14 Li YF，Gong ZH，Yang M，et a1.Inhibition of the o1igosaccharides extracted from Morinda officina1is，a Chinese traditiona1 herba1 medicine，on the corticosterone induced apoptosis in PC12 ce11s.Life Science，2003，72（8）：933～942.

15 Choi J，Lee KT，Choi MY，Nam JH，et a1.Antinociceptive Antiinf1ammatory Effect of Monotropein Iso1ated from the Root of Morinda officina1is.Bio1ogica1 & Pharmaceutica1 Bu11etin，2005，28（10）：1915～1918.

Objective To explore the effect of Morinda officinalis polysaccharides on bone- related genes metabolism. Methods Using dual energy X-ray ceiling light measure （DEXA） method for the determination of bone mineral content （BMC） and using a hologic QDR 1000 and hologic 's small animal procedures for the determination of bone mineral density （BMD）. According to the RNA Isolation Kit specification to isolate RNA. Result Pharmacological analyses show can significantly improve bone mineral density and the content of elements，Morinda officinalis polysaccharides can increase the expression of bone- related genes （BMP-2，Cbfal，Dmp1，rRANKL，rALP，rOPG，rPPARγ2 mRNA）. Conclusion Pharmacological tests show that Morinda officinalis polysaccharides can stimulate the expression of bone- related genes metabolism and improve bone mineral density and content of elements.

Morinda officinalis polysaccharides Bone- metabolism-related genes

浙江省自然科學(xué)基金資助（Ly15H270008）

310006 浙江省中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨傷科