雷公藤紅素對(duì)單核/巨噬細(xì)胞在舌癌中的影響

賴河青 馮紅超★ 宋宇峰

雷公藤紅素對(duì)單核/巨噬細(xì)胞在舌癌中的影響

賴河青 馮紅超★ 宋宇峰

目的 探討雷公藤紅素（Tri）對(duì)人單核/巨噬細(xì)胞系（THP-1細(xì)胞）和舌癌細(xì)胞（Tca8113）的影響。方法 在酸性微環(huán)境中，加入不同濃度的Tri分別與Tca8113細(xì)胞、THP-1細(xì)胞+ Tca8113細(xì)胞、THP-1細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)24h、48h、72h后，用MTT法檢測(cè)Tri在不同的濃度下，THP-1細(xì)胞對(duì)Tca8113的殺傷作用。結(jié)果 THP-1細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)，隨著Tri濃度的升高，細(xì)胞數(shù)量先增加后減少；THP-1細(xì)胞+Tca8113細(xì)胞混合培養(yǎng)以及Tca8113細(xì)胞的單獨(dú)培養(yǎng)，隨著Tri濃度的升高，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，與濃度成負(fù)相關(guān)（r=-0.452，P＜0.05）。結(jié)論 Tri在低濃度時(shí)，能促進(jìn)THP-1細(xì)胞殺傷Tca8113細(xì)胞的作用，但濃度過(guò)大時(shí)，則有明顯的殺傷THP-1細(xì)胞的作用。

雷公藤紅素 單核/巨噬細(xì)胞 口腔鱗狀細(xì)胞癌

腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的特殊環(huán)境，特點(diǎn)是間質(zhì)壓力高、組織血供不足、營(yíng)養(yǎng)相對(duì)缺乏、高酸低氧等特點(diǎn)［1，2］。在有氧環(huán)境下腫瘤細(xì)胞仍然進(jìn)行糖酵解，即所謂的warburg效應(yīng)，導(dǎo)致生長(zhǎng)旺盛的腫瘤細(xì)胞伴隨大量酸性代謝產(chǎn)物的排出，從而形成腫瘤細(xì)胞外的酸性環(huán)境［3，4］。Shin等［5］發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素（Tripterine，Tri）明顯抑制血管的生成，產(chǎn)生抑瘤作用，甚至可直接殺滅身體內(nèi)許多惡性腫瘤細(xì)胞，同時(shí)也具有復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)作用，可以調(diào)節(jié)單核/巨噬細(xì)胞功能。作者自2012年9月至2013年5月，通過(guò)體外模擬舌鱗狀細(xì)胞癌的酸性微環(huán)境，在不同濃度的Tri中進(jìn)行了舌癌細(xì)胞與單核/巨噬細(xì)胞單獨(dú)及共同培養(yǎng)，研究Tri對(duì)單核/巨噬細(xì)胞在舌癌中的影響，為Tri在抗腫瘤方面提供了新的研究方向。報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 THP-1細(xì)胞株、Tca-8113細(xì)胞株、Tri、噻唑藍(lán)（MTT）、RPMI-1640培養(yǎng)液、PBS液、二甲基亞砜（DMSO）、0.25%含 EDTA胰酶/胎牛血清等。

1.2 方法 （1）配制不同pH值（含2%胎牛血清、20%胎牛血清）的RPMI-1640完全培養(yǎng)液：用5.5%NaHCO3溶液及1N的HCl溶液調(diào)配含2%、20%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，pH值為6.6、6.8、7.2（在常規(guī)條件下配制），配好后-20℃冰箱保存。（2）配制含有不同濃度Tri及調(diào)配其不同的pH值：將Tri溶解于少量二甲亞砜（DMSO）配成1mg/ml母液，過(guò)濾除菌后分裝成1ml/支，-20℃冰箱保存。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，分別將Tri母液加入含有2%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)液中，然后將其濃度調(diào)整為0μg/ml、5μg/ ml、10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml，后用5.5%NaHCO3溶液及1N HCl溶液，將其pH調(diào)配為6.6、6.8、7.2。（3）復(fù)蘇凍存的THP-1細(xì)胞株、Tca8113細(xì)胞株及其細(xì)胞懸液的制備：從-196℃液氮中取出凍存管后，迅速將其放入37℃溫水杯中，使其快速解凍，擦干后立即放進(jìn)超凈臺(tái)里面，用吸管將液體吸至15ml的無(wú)菌離心管內(nèi)，再用托盤天平將其平衡后，放入離心機(jī)，1500r/min，離心5min，離心結(jié)束后，吸管吸棄上清液，再加進(jìn)pH值為7.2含10%胎牛血清、青霉素100μg/ ml、鏈霉素100μg/ml的RPMI-1640培養(yǎng)基，直至5ml，用吸管輕柔吹打，使其成為細(xì)胞懸液，吹打混勻后將其移至25ml的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，在飽和濕度、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，利用懸浮換液法，約2～3d時(shí)更換新鮮的培養(yǎng)基。（4）MTT檢測(cè)細(xì)胞：培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間之后，在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察。加入 MTT溶液（5mg/ml）20μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h，1500r/min，離心5min，小心吸凈孔內(nèi)培養(yǎng)液，然后在避光情況下，加入二甲基亞砜150μl/孔，后立即放于搖床上低速振蕩，持續(xù)時(shí)間10min，最終使結(jié)晶物能夠充分溶解。將酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀的波長(zhǎng)設(shè)置為490nm，進(jìn)行測(cè)量，保存吸光度值，同時(shí)設(shè)調(diào)零孔。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件包。MTT實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用正交設(shè)計(jì)的方差分析，計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Tri對(duì)THP-1細(xì)胞作用后的細(xì)胞數(shù)量變化 在同一時(shí)間段、同一Tri濃度下，隨著pH濃度的增加，THP-1細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）；在同一pH值、同一Tri濃度下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）；在同一時(shí)間段，在同一pH值下，Tri濃度為0～20μg/ml之間時(shí)，THP-1細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，濃度為50μg/ml時(shí)，細(xì)胞數(shù)量則下降明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 THP-1細(xì)胞培養(yǎng)后細(xì)胞數(shù)量的變化［μg/ml，（±s）］

表1 THP-1細(xì)胞培養(yǎng)后細(xì)胞數(shù)量的變化［μg/ml，（±s）］

時(shí)間（h）pH值Tri濃度0 5 102050 246.60.568±0.112 0.691±0.102 0.795±0.109 0.891±0.111 0.381±0.093 6.80.566±0.113 0.781±0.113 0.894±0.118 0.982±0.103 0.472±0.082 7.20.567±0.102 0.671±0.104 0.789±0.107 0.873±0.113 0.363±0.084 486.60.559±0.115 0.661±0.115 0.748±0.116 0.764±0.104 0.354±0.072 6.80.558±0.107 0.721±0.107 0.767±0.106 0.835±0.116 0.445±0.066 7.20.553±0.106 0.641±0.108 0.656±0.105 0.746±0.105 0.336±0.076 726.60.547±0.108 0.631±0.105 0.745±0.1020757±0.1170.327±0.073 6.80.544±0.109 0.651±0.113 0.754±0.112 0.823±0.108 0.418±0.084 7.20.541±0.104 0.611±0.105 0.719±0.102 0.733±0.112 0.304±0.092

2.2 Tri對(duì)THP-1細(xì)胞+Tca8113細(xì)胞共同培養(yǎng)組作用后細(xì)胞數(shù)量的變化 THP-1細(xì)胞+Tca8113細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí)，在同一時(shí)間段、同一Tri濃度下，pH值由酸至堿，THP-1細(xì)胞+Tca8113細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）；在同一pH值、同一Tri濃度下，隨時(shí)間的增加，細(xì)胞數(shù)量不斷地減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）；同一時(shí)間段和pH值，Tri濃度越高，THP-1細(xì)胞+Tca8113細(xì)胞的數(shù)量出現(xiàn)越少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 THP-1+Tca8113細(xì)胞培養(yǎng)后細(xì)胞數(shù)量的變化［μg/ml，（±s）］

表2 THP-1+Tca8113細(xì)胞培養(yǎng)后細(xì)胞數(shù)量的變化［μg/ml，（±s）］

時(shí)間（h）pH值Tri濃度0 102050 246.60.693±0.107 0.684±0.1020.567±0.1050.558±0.1020.354±0.082 6.80.692±0.106 0.713±0.1120.588±0.1060.569±0.1040.363±0.072 7.20.792±0.103 0.602±0.1080.548±0.1040.536±0.1060.343±0.092 486.60 .783±0.101 0.663±0.1080.557±0.1020.542±0.1070.344±0.073 6.80.784±0.102 0.694±0.1020.576±0.1070.561±0.1090.355±0.074 7.20.775±0.105 0.565±0.1010.535±0.1120.523±0.1120.336±0.082 726.60.766±0.108 0.636±0.1020.543±0.1080.539±0.1010.317±0.092 6.80.757±0.108 0.647±0.1050.562±0.1020.547±0.1030.348±0.085 7.20.748±0.109 0.528±0.1060.521±0.1070.517±0.1050.309±0.076 5

2.3 Tri對(duì)Tca8113細(xì)胞培養(yǎng)組作用后細(xì)胞數(shù)量的變化 在培養(yǎng)Tca8113細(xì)胞時(shí)，隨著時(shí)間、Tri濃度的增加，pH值由酸性至堿性，Tca8113細(xì)胞數(shù)量均呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 Tca8113細(xì)胞培養(yǎng)后細(xì)胞數(shù)量的變化［μg/ml，（±s）］

表3 Tca8113細(xì)胞培養(yǎng)后細(xì)胞數(shù)量的變化［μg/ml，（±s）］

時(shí)間（h）pH值Tri濃度0 102050 246.60.566±0.1070.532±0.1020.399±0.108 0.162±0.0210.049±0.007 6.80.567±0.1020.522±0.1120.389±0.104 0.152±0.0320.039±0.006 7.20.565±0.1080.519±0.1050.381±0.106 0.149±0.0220.033±0.009 486.60.564±0.1040.521±0.1080.378±0.103 0.158±0.0210.038±0.008 6.80.561±0.1020.513±0.1090.374±0.102 0.145±0.0230.033±0.012 7.20.562±0.1070.510±0.1050.366±0.101 0.137±0.0120.027±0.011 726.60.561±0.1080.512±0.1060.373±0.106 0.142±0.0370.031±0.009 6.80.553±0.1020.486±0.1070.367±0.105 0.127±0.0180.029±0.007 7.20.520±0.1030.434±0.1060.355±0.104 0.116±0.0190.025±0.005 5

3 討論

研究表明在腫瘤的生長(zhǎng)過(guò)程中，會(huì)“激活”其周圍的間質(zhì)，這些腫瘤的相關(guān)間質(zhì)又促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展［6］。當(dāng)瘤體增大到一定程度后，會(huì)出現(xiàn)局部灌注不足、循環(huán)差，從而使酸性代謝物乳酸滯留，最終造成局部的pH值降低，出現(xiàn)酸性環(huán)境［7］。惡性腫瘤細(xì)胞中的pH值大約為7.1～7.2，較相應(yīng)正常細(xì)胞外pH值（7.1～7.6）低［8］，這種酸性微環(huán)境減弱了單核/巨噬細(xì)胞的殺傷作用，相反增強(qiáng)了分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等因子的能力，故在酸性微環(huán)境中，VEGF使血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)了腫瘤內(nèi)的血管形成［9，10］。微環(huán)境中白細(xì)胞介素-1等細(xì)胞因子也能誘導(dǎo)促使單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生VEGF，從而促進(jìn)血管的生成。

活化的巨噬細(xì)胞包含兩種表型：M1經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞（也稱M1型或Ⅰ型巨噬細(xì)胞），指經(jīng)過(guò)激活后的巨噬細(xì)胞，即巨噬細(xì)胞的“經(jīng)典活化”；還有一種叫替代激活的巨噬細(xì)胞（也叫M2型或Ⅱ型巨噬細(xì)胞），即“替代活化”。M1型以具有增強(qiáng)細(xì)胞表面調(diào)理素受體以及增強(qiáng)生成活性氧和一氧化氮的能力，以發(fā)揮其殺菌和殺腫瘤活性。M2巨噬細(xì)胞表達(dá)了較高水準(zhǔn)的甘露糖受體、清道夫A型受體以及半乳糖受體，同時(shí)具有IL-12low等表型。M2功能主要表現(xiàn)為吞噬細(xì)胞碎片，并在血管的生成和組織的重建及其修復(fù)中發(fā)揮重要作用。

本實(shí)驗(yàn)采用在不同的pH值、時(shí)間以及不同Tri的濃度下，將Tca8113細(xì)胞+THP-1細(xì)胞共同培養(yǎng)，而以Tca8113細(xì)胞、THP-1細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)作為對(duì)照。研究發(fā)現(xiàn)，在口腔鱗癌中單核/巨噬細(xì)胞的功能轉(zhuǎn)化與局部酸性微環(huán)境、Tri干預(yù)的濃度密切相關(guān)。酸性微環(huán)境中，THP-1細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)，隨著Tri濃度的升高，細(xì)胞數(shù)量先增加后減少； THP-1細(xì)胞+Tca8113細(xì)胞混合培養(yǎng)以及Tca8113細(xì)胞的單獨(dú)培養(yǎng)，隨著Tri濃度的升高，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，與濃度成負(fù)相關(guān)（r= -0.452，P＜0.05）；由此可推斷單核/巨噬細(xì)胞經(jīng)Tri干預(yù)后，可能是其免疫功能表型發(fā)生了轉(zhuǎn)化即由促瘤型的M2型轉(zhuǎn)化為抑瘤型的M1型。同樣也可以推測(cè)得出Tri具有兩面性，Tri在低濃度時(shí)，能促進(jìn)THP-1細(xì)胞殺傷Tca8113細(xì)胞的作用，但濃度過(guò)大時(shí)，則有明顯的殺傷THP-1細(xì)胞的作用，這為Tri調(diào)節(jié)THP-1細(xì)胞后達(dá)到抗腫瘤的目的，提供了新的研究方向。

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Objective To study the effect of tripterine for the monocytes / macrophages （THP-1） and the common culture of tongue carcinoma （Tca8113） cells in vitro acid microenvironment. Methods In vitro microenvironments，different concentrations tripterine were common cultured with Tca8113 cell，Tca8113 cell+ THP-1 cell，THP-1 cell after 24 hours，48 hours，72 hours . by MTT method to detected change of the number of tongue cancer cells and monocytes / macrophages after to intervente the detection of different tripterine conditions. Results when the monocytes / macrophages were separately cultured，via interfered by different densities of tripterine，the cell counts of Monocytes / macrophages increased and after to reduce. when the monocytes / macrophages and oral squamous cell carcinoma were mixed to culture，and oral squamous cell carcinoma were separately cultured，via interfered by different densities of tripterine，counts of cells was downward trending，and presented significantly inactive related to the densities of tripterine（r=-0.452，P＜0.05）. Conclusion When the concentration of tripterine is lower，the tripterine can promote the increasing of THP-1 cells，however，when the concentration of tripterine is higher，the tripterine can kill the THP-1 cells.

Tripterine Mononuclear-macrophage Oral squamous cell carcinoma

貴州省科技廳計(jì)劃研究項(xiàng)目［黔科合LG字（2011）001號(hào)］

310006 杭州口腔醫(yī)院（賴河青）

550004 貴州省貴陽(yáng)市口腔醫(yī)院（馮紅超）

550004 貴州省食品藥品監(jiān)督管理局（宋宇峰）