河南地區(qū)一株雞源H9N2亞型禽流感病毒的分離鑒定及HA基因變異分析

王麗榮，董永軍，杭柏林，劉興友，王三虎，胡建和

(1.河南科技學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)　453003；2.河南科技學(xué)院抗體工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南新鄉(xiāng)　453003；3.新鄉(xiāng)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)　453003)

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河南地區(qū)一株雞源H9N2亞型禽流感病毒的分離鑒定及HA基因變異分析

王麗榮1,2，董永軍1,2，杭柏林1，劉興友3，王三虎1，胡建和1

(1.河南科技學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003；2.河南科技學(xué)院抗體工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南新鄉(xiāng)453003；3.新鄉(xiāng)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003)

由發(fā)病蛋雞體內(nèi)分離得到一株禽流感病毒，經(jīng)PCR、血凝試驗(yàn)和免疫熒光鑒定為H9N2亞型，命名為A/Chicken /henanxy/2010(H9N2)，病毒對(duì)SPF雞無致病性，對(duì)其HA基因進(jìn)行克隆測(cè)序，HA基因氨基酸裂解位點(diǎn)為PSRSSRGLF，符合低致病性禽流感的分類標(biāo)準(zhǔn)；并將HA基因和自GenBank讀取的H9N2病毒的HA基因序列比較，表明河南分離株屬于歐亞分支中的Y280-like分支，與A/Chicken /shandongHL/2010(H9N2)氨基酸同源性94.8%，可能是Y280-like個(gè)別核苷酸突變的一株。

H9N2亞型禽流感病毒；分離鑒定；HA基因；序列分析

A型流感病毒(Avian Influenza virus AIV)屬于正粘病毒科，基因組為分節(jié)段的負(fù)鏈RNA，具有傳染性強(qiáng)、易發(fā)生抗原變異、傳播迅速、宿主范圍廣泛的特點(diǎn)，并有禽流感病毒感染人的病例報(bào)道[1-2]。市場(chǎng)開放、流通頻繁等因素為禽流感的流行創(chuàng)造便利條件。禽流感病毒感染后，導(dǎo)致雞只突然發(fā)病，或沒有特征癥狀而引起產(chǎn)蛋下降，導(dǎo)致育雛及育成雞新城疫等疫苗免疫失敗。H9N2亞型禽流感病毒(H9N2 AIV)屬于低致病性禽流感病毒，是目前中國禽類中流行的主要亞型。H9N2 AIV變異較快，不同毒株間可發(fā)生基因重組，不僅嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)，而且對(duì)人類健康造成巨大的威脅，郭元吉等[1]從人體內(nèi)分離到該病毒，2003年12月香港人感染H9N2 AIV[2]。雖然H9N2 AIV迄今尚未引起人類死亡，但H9N2 AIV比H5N1 AIV更容易跨越物種屏障，在人群中易于傳播，還可能經(jīng)過多次跨種傳播，發(fā)生重配或突變，產(chǎn)生對(duì)人致病力更強(qiáng)的病毒，給公共健康帶來嚴(yán)重威脅[3-4]；因此，高度關(guān)注該亞型病毒的變異，分析其遺傳演化關(guān)系，從分子水平研究H9N2流行毒株的基因來源，進(jìn)一步探索H9N2亞型禽流感的流行趨勢(shì)，為監(jiān)控H9N2流行、變異提供資料。

流感病毒HA基因的變異性很強(qiáng)，是導(dǎo)致抗原變異的主要原因，最能反映流感病毒的變異程度[5-7]。因此，加強(qiáng)H9N2 AIVHA基因遺傳演化的監(jiān)測(cè)，了解H9N2 AIV流行趨勢(shì)的變化規(guī)律，為更好地防治禽流感提供參考。本研究自河南某雞場(chǎng)發(fā)病雞體內(nèi)分離得到病毒，鑒定為H9N2 AIV，并對(duì)其HA基因進(jìn)行序列分析，為河南地區(qū)乃至全國H9N2 AIV抗原變化積累數(shù)據(jù)，豐富中國流感病毒的分子流行病學(xué)資料，為河南地區(qū)流感的防制、H9N2的分子特點(diǎn)及遺傳變異研究提供參考。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

白來航SPF雞由SPF雞胚(購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)人工孵化出雛，孵化溫度為37.8 ℃，孵化相對(duì)濕度為60%。

1.2病料樣品

2010年河南地區(qū)某蛋雞場(chǎng)海蘭蛋雞發(fā)生疑是H9N2疫情，患病蛋雞主要表現(xiàn)產(chǎn)蛋率明顯下降，蛋殼質(zhì)量變差，伴有輕微呼吸道癥狀，發(fā)病持續(xù)時(shí)間較長，病雞剖檢可見腺胃腫脹，質(zhì)地較硬，乳頭凹凸不平，嚴(yán)重的氣囊炎，氣管出血，有粘液，支氣管栓塞，有白色干酪樣物質(zhì)，肺臟出血等。調(diào)查中顯示，在同地區(qū)其他雞場(chǎng)也發(fā)生同樣癥狀的疾病。本研究采集發(fā)病蛋雞的氣管、肺臟、脾臟等病料。

1.3抗原和抗體

H9N2和H5N1亞型禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)抗原及血清由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。鼠抗流感病毒NP蛋白的單抗、FITC-羊抗鼠IgG抗體均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所提供。

1.4主要試劑

RNA提取試劑盒MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0、RT-PCR試劑盒PrimeScriptTMRT-PCR Kit、TaKaRa ExTaqTM、DL2000 Marker均購自TaKaRa公司。GoldView核酸染料購自賽百盛。

1.5雞胚成纖維細(xì)胞(CEF細(xì)胞)的制備

參照文獻(xiàn)[8]的方法制備CEF細(xì)胞。

1.6病毒的分離

將無菌采集的病料剪碎、研磨，加入含雙抗的PBS液，凍融2～3次，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行過濾，濾液接種5枚10日齡SPF雞胚，每枚0.2 mL。棄去24 h內(nèi)死亡雞胚，收集24～72 h死亡和未死亡雞胚尿囊液分裝，保存，備用。

1.7分離病毒的濃縮

取上述雞胚尿囊液原液作1∶10稀釋，接種SPF雞胚，37 ℃孵化48～72 h，置4 ℃ 12 h后收獲雞胚尿囊液。取雞胚尿囊液低速離心，取上清超速離心(40 000 r/min離心4 h)，棄上清，沉淀用1 mL 滅菌PBS液懸浮后保存，備用。

1.8病毒血凝活性的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行分離病毒的血凝活性測(cè)定。

1.9分離毒株的RT-PCR鑒定

用Trizol試劑提取分離病毒RNA，用M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，分別利用禽流感病毒、新城疫病毒的特異性引物(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1　分離毒株P(guān)CR鑒定的引物

1.10間接免疫熒光鑒定(IFA)病毒

待CEF細(xì)胞長成單層后，待檢病毒10倍稀釋，每孔加100 μL病毒稀釋液感染細(xì)胞，同時(shí)設(shè)未感染陰性對(duì)照孔。24 h后，棄上清，細(xì)胞用φ=4%的多聚甲醛固定，經(jīng)PBST洗滌3次，加入500倍稀釋的鼠抗流感病毒NP蛋白的單抗，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌3次，加入FITC-羊抗鼠IgG抗體，繼續(xù)37 ℃孵育1 h，PBST洗滌3次，最后在熒光下顯微鏡觀察。

1.11病毒的亞型鑒定

HA亞型鑒定參照文獻(xiàn)[9-12]的方法進(jìn)行。

NA亞型鑒定，通過PCR方法鑒定分離毒的NA亞型。引物N2NA-Fll21: 5′-CGCTACGGT-

TATGAGACTTTCAG-3′，N2NA-R1401:5′-ATATTCGCCCCATCAGGCCATGAG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為280 bp。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，54 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.12病毒EID50的測(cè)定

分離毒株第3代雞胚尿囊液做10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10倍稀釋，分別接種10日齡SPF雞胚，每枚0.1 mL，每一稀釋度接種5枚，37 ℃培養(yǎng)，棄去24 h死亡雞胚，觀察記錄雞胚死亡情況，于接種后72 h 4 ℃過夜凍死雞胚，收獲雞胚尿囊液，測(cè)定其血凝價(jià)，血凝價(jià)≥1∶64判定為有病毒感染。按Reed-Muench方法計(jì)算其雞胚半數(shù)感染量(EID50)。

1.13動(dòng)物感染試驗(yàn)

取26只4周齡SPF雞分成2組，將尿囊液用滅菌PBS稀釋10倍，0.2 mL經(jīng)靜脈接種13只SPF雞，另外13只接種PBS作為空白對(duì)照，感染后4 d，各剖殺3只，分別采集氣管、肺臟、脾臟，進(jìn)行病毒滴定，其余連續(xù)觀察10 d，記錄發(fā)病死亡情況。

1.14HA基因序列測(cè)定及進(jìn)化分析

參照文獻(xiàn)[4,12-14]的方法進(jìn)行HA基因的擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，送北京英俊公司測(cè)序。利用DNA STAR分析軟件進(jìn)行序列拼接，獲得基因序列。并與NCBI上的禽流感病毒H9N2 AIVHA基因進(jìn)行同源性比對(duì)，分析河南分離株HA基因的變異規(guī)律。

2　結(jié)果與分析

2.1病毒的分離及血凝活性測(cè)定

將河南地區(qū)發(fā)病蛋雞的氣管、肺臟和脾臟搗碎后，接種5枚10日齡SPF雞胚，雞胚在72 h內(nèi)均未死亡，其中1枚雞胚的尿囊液具有血凝活性，血凝效價(jià)為211，其余雞胚尿囊液無血凝活性。

2.2RT-PCR鑒定

用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用AIV的M基因特異引物和NDV的NP基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，用M基因特異引物可擴(kuò)增出特異的條帶，產(chǎn)物為300 bp左右(圖1)，與預(yù)期大小一致。表明分離的病毒為禽流感病毒。

1.分離毒株Isolate；2新城疫病毒Newcastle disease virus；3.空白對(duì)照Negative control； M.Marker DL2000

圖1分離毒株M基因PCR產(chǎn)物

Fig.1PCR products ofMgene for the isolate

2.3單克隆抗體的間接免疫熒光鑒定

待檢病毒感染CEF細(xì)胞后，用鼠抗流感病毒NP蛋白的單抗進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)，結(jié)果顯示，待檢病毒感染細(xì)胞呈現(xiàn)特異綠色熒光信號(hào)，而對(duì)照細(xì)胞沒有特異的熒光信號(hào)。表明待檢病毒是禽流感病毒(圖2)。

A.待檢病毒　Quarantine virus; B.對(duì)照　Control

2.4病毒HA和NA亞型的鑒定

從表2可以看出，待檢病毒的血凝活性可被H9N2亞型血清特異性抑制，而不受H5N1亞型禽流感病毒血清的影響。由圖3可知，用H9N2的NA基因特異引物能擴(kuò)增出300 bp左右預(yù)期片段。表明分離病毒為H9N2亞型AIV。

2.5病毒EID50

由表3可看出，雞胚接種分離毒株，72 h內(nèi)隨著稀釋倍數(shù)的降低，具有血凝活性的雞胚數(shù)也隨之下降，病毒稀釋至10-9時(shí)，接種病毒雞胚不再有血凝活性。按照Reed-Muench方法計(jì)算出分離病毒的EID50為10-10/μL。

表2　血凝與血凝抑制結(jié)果

M. Marker DL2000；1.分離毒株　Isolate

尿囊液稀釋倍數(shù)Dilutionratioofallantoicfluid1∶1051∶1061∶1071∶1081∶109HA≥1∶64胚數(shù)HA≥1∶64numbersofembryos44420

注 Note:EID50=10-10/μL

2.6SPF雞感染試驗(yàn)

靜脈接種10倍稀釋雞胚第3代尿囊液0.2 mL，13只SPF雞均未表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，感染后4 d，剖殺3只，采集各實(shí)質(zhì)臟器進(jìn)行病毒滴定，病毒主要集中在肺、氣管和脾臟，其他器官未檢測(cè)到病毒(表4)。

表4　接毒后SPF雞感染結(jié)果

2.7HA基因的克隆

分離毒株經(jīng)PCR擴(kuò)增后，得到1條1 742 bp 的特異條帶(圖4)，其大小與預(yù)期的結(jié)果基本一致，將該基因克隆到載體中，進(jìn)行測(cè)序。

2.8分離毒株HA基因片段克隆和序列測(cè)定

將擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，PCR鑒定獲得RT-PCR產(chǎn)物的陽性重組質(zhì)粒，即pMD18-T/HA，對(duì)陽性重組質(zhì)粒中插入的基因片段進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果分離毒株的HA基因片段大小為1 742 bp。

M. Marker DL2000； 1.分離毒株Isolate； 2.空白對(duì)照 Negative control

圖4AIVH9N2分離毒株HA基因RT-PCR擴(kuò)增

Fig.4RT-PCR amplification ofHAgene for H9N2 AIV isolate

2.9HA基因的進(jìn)化樹分析

河南分離毒株HA氨基酸裂解位點(diǎn)為 PSRSSRGLF，符合低致病性禽流感的分類標(biāo)準(zhǔn)。從HA基因進(jìn)化關(guān)系可看出，與河南分離毒株(H9N2)HA基因同源性最高的是2010年山東分離毒株，且是同一年份，其2株病毒可能有一定的聯(lián)系，均來源于Y280分支(圖5)。分離毒株HA基因與NCBI上H9N2 AIV的HA氨基酸序列同源性為87.1%～99.3%；且分離毒株與2010年山東分離毒株氨基酸同源性為98.4%(圖6)。

圖5　 (H9N2)分離株HA基因進(jìn)化樹

核苷酸和氨基酸同源性分析結(jié)果表明，該毒株與A/chicken/Shandong/HL/2010(H9N2) 毒株基本屬于同一毒株，推測(cè)該野毒可能是河南山東地區(qū)流行株。

圖6　(H9N2)分離株HA基因推導(dǎo)的氨基酸同源性(%)比較

3　討 論

中國自1994年首次從雞群中分離到H9N2 亞型禽流感病毒以來，目前H9N2 亞型禽流感在中國多省地區(qū)廣泛存在，不僅是嚴(yán)重危害中國養(yǎng)禽業(yè)的主要疾病之一，而且還危害到人類的健康。過去，人們往往把目光放在如H5、H7等高致病性禽流感上，而對(duì)H9等低致病性禽流感未引起足夠的重視，但目前種種跡象已表明，H9N2亞型禽流感的發(fā)病率和危害性日趨嚴(yán)重，給養(yǎng)禽業(yè)和公共健康帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失[15-17]。禽流感病毒的監(jiān)測(cè)有助于了解禽流感病毒在禽類中的生態(tài)分布、傳播規(guī)律及演化進(jìn)程，為流感的防治提供重要依據(jù)。從國內(nèi)外的流行病學(xué)和血清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，很多雞場(chǎng)中都存在流感病毒[17-18]。劉金華等[11]在發(fā)病雞體內(nèi)分離得到多株H9N2亞型AIV；楊其峰等[12]自雞胚中分離到H9N2 AIV，但從種蛋中分離到H9N2還不能作為H9N2可垂直傳播的證據(jù)。

流感病毒HA基因變異性很強(qiáng)，是導(dǎo)致病毒抗原變異的主要原因，最能反映流感病毒的變異程度[9]，非常有必要監(jiān)測(cè)H9N2亞型禽流感病毒分離株的遺傳變異情況。

近年來在河南地區(qū)的一些養(yǎng)雞場(chǎng)相繼發(fā)生疑是H9N2亞型禽流感病毒為主要癥狀的疾病，給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，本研究的樣品來自河南地區(qū)某蛋雞場(chǎng)，是在雞只發(fā)病初期采集的發(fā)病蛋雞氣管、肺臟等，并送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。通過SPF雞胚接種分離得到一株病毒，經(jīng)鑒定分離毒株是H9N2亞型禽流感病毒。

SPF雞人工感染未出現(xiàn)典型禽流感癥狀，但自感染SPF雞體內(nèi)分離到該病毒，分析H9N2 AIV對(duì)雞來說是低致病性禽流感病毒，雞可以攜帶H9N2病毒而不發(fā)病或者沒有任何癥狀。與以前的 H9N2 亞型AIV一樣，動(dòng)物試驗(yàn)都不能復(fù)制出與臨床一樣的癥狀和病理變化，與SPF雞體內(nèi)不能提供HA蛋白裂解的胰蛋白酶有關(guān)，而HA能否裂解是AIV毒力的決定性因素，高致病性禽流感能夠自身提供HA裂解所需要的酶，而低致病性禽流感需要其他細(xì)菌或者病毒提供其HA裂解所需要的胰蛋白酶[13]。Bano等[19]在實(shí)驗(yàn)室首先用H9N2病毒感染雞，隨后采用不同途徑接種傳染性支氣管炎病毒、傳染性鼻炎細(xì)菌或大腸桿菌，或者首先使用化學(xué)性免疫抑制劑后再用H9N2病毒攻擊，以單獨(dú)攻擊H9N2病毒的雞作對(duì)照，結(jié)果表明，繼發(fā)大腸桿菌感染或處于免疫抑制狀態(tài)下的試驗(yàn)雞，對(duì)H9N2病毒的攻擊均出現(xiàn)很高的死亡率，而單獨(dú)攻擊H9N2病毒的對(duì)照雞沒有出現(xiàn)死亡。2009年劉麗琦[14]也報(bào)道H9N2分離毒株感染的試驗(yàn)組動(dòng)物小鼠并未出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，也沒有死亡出現(xiàn)，但也在試驗(yàn)動(dòng)物肺、氣管中分離到病毒。本研究與劉月煥等[15]研究報(bào)道3株臨床分離毒株H9N2人工感染SPF雞攻毒雞全部表現(xiàn)正常，沒有出現(xiàn)明顯的呼吸困難、拉稀癥狀，剖檢也未見明顯的大體病變報(bào)道相一致。

目前，大多數(shù)流感病毒研究者都認(rèn)為，H9N2 AIVHA基因存在歐亞大陸和北美大陸2個(gè)分支[13-14,17]，美洲分支代表株是 A/turkey/Wisconsin/66(H9N2)，歐亞分支可以分為3個(gè)亞分支：A/Quail/Hong Kong/G1/97(H9N2) 為代表的G1-like分支，以A/Duck/Hong Kong/Y280/97(H9N2)為代表的Y280-like，以A/Duck/Hong Kong/Y439/97(H9N2)為代表的Y439-like分支[13]。2010年河南分離株與以往中國分離的大部分毒株類似，屬于歐亞分支中的Y280-like分支，與其相似性94.8%，可能是Y280-like個(gè)別核苷酸突變的一株；推測(cè)與2010年山東分離株是同一毒株。

當(dāng)前H9N2亞型禽流感病毒在中國許多地方呈現(xiàn)地方流行性，不同的毒株之間可能發(fā)生基因重組，在免疫強(qiáng)度不斷加大和生物學(xué)適者生存的規(guī)律下，促使病毒基因組不斷發(fā)生變異和重組以適應(yīng)生存的需要，有可能使病毒抗原位點(diǎn)改變或者裂解位點(diǎn)改變產(chǎn)生超強(qiáng)毒株或者免疫耐受毒株。因此，加強(qiáng)對(duì)H9N2亞型禽流感病毒的生物學(xué)特性和分子流行病學(xué)研究，不僅具有重要的學(xué)術(shù)意義，而且在養(yǎng)殖效益和公共衛(wèi)生方面也有重大的現(xiàn)實(shí)意義[13,18]。

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(責(zé)任編輯：顧玉蘭Responsible editor:GU Yulan)

Isolation,Identification and Variation Analysis ofHAGene of Chicken H9N2 Subtype Avian Influenza Viruses in Henan

WANG Lirong1,2,DONG Yongjun1,2,HANG Bolin1,LIU Xingyou3,WANG Sanhu1and HU Jianhe1

(1. College of Animal Science ,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang Henan453003,China;2.Antibody Engineering Laboratory,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang Henan453003,China;3.Xinxiang University,Xinxiang Henan453000,China)

A newly H9N2 isolate,named A/Chicken /henanxy/2010(H9N2),was collected from Hen flock at peak of laying and PCR technique,hemagglutination test and immunofluorescence identified as subtype H9N2. A/Chicken /henanxy/2010(H9N2) was non-pathogenic to SPF chicken. TheHAgene sequence of the strains was determined. The sequence analysis ofHAgene showed that the amino acid sequence in HA cleavage motif was PSRSSRGLF,which indicated that A/Chicken /henanxy/2010(H9N2) was lentogenic. TheHAgene sequences among isolates and the reference strains in GenBank was analyzed by DNAStar software. The results demonstrated that A/Chicken /henanxy/2010(H9N2) belonged to Y280-like sublineage and the homology of amino acid forHAgene is 94.8% between the isolate A/Chicken /henanxy/2010(H9N2) and Y280-like sublineage. The conclusion can be referred for the genetic evolution of AIV H9N2HAgenes,to reveal the epidemic characteristics of the H9N2 in Henan region.

H9N2 avian infuenza virus; Identification;HAgene; Sequence analysis

2015-12-27Returned2016-01-06

The Key Sci-tech Project of the Higher Education Institution of Henan(No. 15A230013); Key Sci-tech Project of Xinxiang(No.ZG13009).

WANG Lirong,female,associate professor,Ph.D. Research area:veterinary micrbiology and immunology.E-mail: wlr202@126.com

2015-12-27

2016-01-06

河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目(15A230013)；新鄉(xiāng)市重點(diǎn)科技攻關(guān)(ZG13009)。

王麗榮，女，副教授，博士，主要從事獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)研究。E-mail: wlr202@126.com

S855.3

A

1004-1389(2016)08-1125-07

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2016-07-14

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160714.1103.004.html