胃癌組織中CyclinD1、CDC25B的表達(dá)變化及意義

王軍，趙醒，趙宇陽(yáng)，趙楊，劉成一，申興斌，李春輝（承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德067000）

胃癌組織中CyclinD1、CDC25B的表達(dá)變化及意義

王軍，趙醒，趙宇陽(yáng)，趙楊，劉成一，申興斌，李春輝
（承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德067000）

目的 觀察胃癌組織中CyclinD1、CDC25B mRNA及蛋白的表達(dá)變化，并探討其意義。方法 收集手術(shù)切除胃癌組織標(biāo)本42例份，同時(shí)取距腫瘤邊緣＞5 cm處作為正常黏膜組織。采用RT-PCR法檢測(cè)胃癌及正常胃黏膜組織中CyclinD1、CDC25B mRNA表達(dá)，采用Western blotting法檢測(cè)胃癌及正常胃黏膜組織中CyclinD1、CDC25B蛋白表達(dá)，分析CyclinD1、CDC25B表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果 CyclinD1、CDC25B mRNA及蛋白在正常胃黏膜組織中的相對(duì)表達(dá)量均顯著低于胃癌組織（P均＜0.05），CyclinD1、CDC25B蛋白表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P均＜0.05），胃癌組織中CyclinD1、CDC25B蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.513，P＜0.05）。結(jié)論胃癌組織中CyclinD1、CDC25B呈高表達(dá)，且與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；檢測(cè)二者水平有助于胃癌預(yù)后判斷。

胃腫瘤；CyclinD1基因；CDC25B基因

細(xì)胞周期素D1（CyclinD1）是調(diào)控細(xì)胞周期的重要蛋白，在許多組織的癌變過(guò)程中，均檢測(cè)到CyclinD1表達(dá)上調(diào)，在食管癌［9］、膽管癌［10］等消化道腫瘤中均提示CyclinD1高表達(dá)。細(xì)胞分裂周期蛋白25B（CDC25B）與人類(lèi)多種惡性腫瘤相關(guān)，在不同腫瘤組織中的檢測(cè)證實(shí)，在腫瘤生長(zhǎng)和細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中，CDC25B基因活性增強(qiáng)，過(guò)量表達(dá)，在消化道腫瘤中亦有類(lèi)似研究。2014年1月，我們觀察了CyclinD1、CDC25B在胃癌組織中的表達(dá)變化，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集本院病理科2008～2014年手術(shù)切除胃癌組織標(biāo)本42例份，患者男31例、女11例，年齡34～84歲，平均59.35歲。患者均為首次接受手術(shù)治療，術(shù)前未行任何放療及化療，術(shù)后病理檢查證實(shí)均為胃腺癌。高分化15例、中分化13例、低分化14例。同時(shí)取距腫瘤邊緣（＞5 cm）處組織作為正常黏膜組織。標(biāo)本均液氮保存。

1.2 胃癌及正常胃黏膜組織中CyclinD1、CDC25B mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用RT-PCR法。β-actin上游引物為5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，下游引物為5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′，β-actin擴(kuò)增片段大小為250 bp。CyclinD1上游引物為5′-CACACGGACTACAGGGGAGTT-3′，下游引物為5′-GCTCTTTTTCACGGGCTCCA-3′，CyclinD1擴(kuò)增片段大小為313 bp。CDC25B上游引物為5′-GACAGCGACTTGCTGCTCAA-3′，下游引物為5′-ATAGGGCTGGGGGAATCCAT-3′，CDC25B擴(kuò)增片段大小為416 bp。用細(xì)胞裂解液將各組細(xì)胞裂解，用TRIzol、氯仿和異丙醇提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：30℃、10 min；42℃、30 min；99℃、5 min；5℃、5 min。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系10 μL。DNA Ladder 6 μL及擴(kuò)增產(chǎn)物20 μL進(jìn)行4%瓊脂糖凝膠電泳（120 V，45 min），采用ZF型紫外透射反射分析儀攝像，采用Quantity one4.62軟件統(tǒng)計(jì)各條帶的積分光密度值，以積分光密度值比值分析兩組間差異。

1.3 胃癌及正常胃黏膜組織中CyclinD1、CDC25B蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。將新鮮胃及胃癌組織剪碎，加入苯甲基磺酰氟，提取總蛋白，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉的TTBS封閉液中封閉，一抗結(jié)合，過(guò)夜，室溫洗膜，每次10 min，共3次，二抗結(jié)合，室溫孵育2 h后曝光，觀察并計(jì)算CyclinD1、CDC25B蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)用±s表示，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；胃癌組織中CyclinD1、CDC25B蛋白表達(dá)的相關(guān)性采用直線相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌及正常胃黏膜組織中CyclinD1、CDC25B mRNA表達(dá)比較 胃癌及正常胃黏膜組織中CyclinD1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.85±0.05、0.41 ±0.03，CDC25B mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.92± 0.06、0.33±0.02，兩種組織中CyclinD1、CDC25B mRNA表達(dá)比較，P均＜0.05。

2.2 胃癌及正常胃黏膜組織中CyclinD1、CDC25B蛋白表達(dá)比較 胃癌及正常胃黏膜組織中CyclinD1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.649±0.052、0.267±0.026，CDC25B蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.945±0.059、0.385 ±0.044，兩種組織中CyclinD1、CDC25B蛋白表達(dá)比較，P均＜0.05。

2.3 CyclinD1、CDC25B蛋白表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系 詳見(jiàn)表1。胃癌組織中CyclinD1、CDC25B蛋白表達(dá)均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P均＜0.05）。

表1 CyclinD1、CDC25B蛋白表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系（±s）

表1 CyclinD1、CDC25B蛋白表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系（±s）

臨床病理特征nCyclinD1tpCDC25B tp性別男31 0.641±0.0551.026 0.1500.912±0.0890.651 0.355 女11 0.652±0.0470.965±0.089年齡（歲）≤5922 0.639±0.0450.614 0.1300.948±0.0760.085 0.585 ＞5920 0.657±0.0480.941±0.077組織分化程度高分化15 0.636±0.0350.871±0.082中分化13 0.643±0.047 1.639 0.220 0.915±0.052 1.493 0.963低分化14 0.653±0.0520.991±0.090組織浸潤(rùn)深度未見(jiàn)全層15 0.639±0.0403.812 0.1490.872±0.0493.863 0.581全層27 0.657±0.0590.981±0.051淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)24 0.416±0.0594.281 0.0010.785±0.0393.143 0.043 有18 0.981±0.0621.121±0.094

2.4 胃癌組織中CyclinD1、CDC25B蛋白表達(dá)的相關(guān)性 CyclinD1、CDC25B蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r= 0.513，P＜0.05）。

3 討論

胃癌的發(fā)生是一個(gè)涉及多種致癌因素的復(fù)雜過(guò)程，最終導(dǎo)致正常細(xì)胞的異常增殖，形成腫瘤包塊。CDC25B是CDC25家族中的重要成員，CDC25B屬于蘇/酪氨酸功能酶，主要發(fā)揮維持細(xì)胞正常生理功能的作用，可能與胚胎發(fā)育有關(guān)。CDC25家族在1986年被證實(shí)為有絲分裂的啟動(dòng)因子［1，2］，該家族還包括CDC25A和CDC25C。CDC25B基因位于人類(lèi)染色體20p13，其主要作用體現(xiàn)在細(xì)胞周期中，在各種致瘤因素的作用下，CDC25基因被活化，CDC25B蛋白合成增加，使CDK1去磷酸化，進(jìn)而活化CDK1/CyclinB復(fù)合物，結(jié)果是使CDK1/CyclinB復(fù)合物由細(xì)胞質(zhì)和中心體移到細(xì)胞核，通過(guò)正反饋?zhàn)饔?，?xì)胞核內(nèi)的CDK1/CyclinB復(fù)合物完全激活，促進(jìn)細(xì)胞周期由G2期向M期轉(zhuǎn)化［3］。陳彩萍等［4］應(yīng)用免疫組化染色技術(shù)檢測(cè)92例三陰性浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌石蠟標(biāo)本中的CDC25B表達(dá)情況，并分析其與三陰性浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者的年齡、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后間的關(guān)系，結(jié)果顯示，三陰性浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中CDC25B存在高表達(dá)，與乳腺癌的發(fā)展及預(yù)后有關(guān)，提示CDC25B有望在判斷三陰性浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌預(yù)后方面有重要參考價(jià)值。張國(guó)君等［5］檢測(cè)了CDC25B蛋白在膀胱永生化細(xì)胞SV-HUC-1細(xì)胞系和膀胱癌BIU-87和T24細(xì)胞系中的表達(dá)，證實(shí)膀胱癌細(xì)胞系中CDC25B表達(dá)較高。腎癌及大腸癌中亦有研究證實(shí)CDC25B高表達(dá)［6，7］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CDC25B在胃癌組織中表達(dá)較正常胃黏膜組織中高，且CDC25B在胃癌組織中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示高CDC25B可能與胃癌的不良預(yù)后有關(guān)。

細(xì)胞周期紊亂是腫瘤形成的重要決定因素，CyclinD1是調(diào)控細(xì)胞周期的重要蛋白，在許多組織的癌變過(guò)程中，均檢測(cè)到CyclinD1的表達(dá)上調(diào)，目前認(rèn)為，CyclinD1的主要作用是促進(jìn)細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞增殖［8］。在食管癌［9］、膽管癌［10］等消化道腫瘤中均提示CyclinD1高表達(dá)，與本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，CyclinD1在胃癌組織中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)CyclinD1與胃癌的惡性程度相關(guān)。CyclinD1、CDC25B蛋白表達(dá)呈正相關(guān)說(shuō)明二者在胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能起到協(xié)同作用。

綜上所述，CyclinD1及CDC25B在胃癌組織中呈高表達(dá)，且與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；檢測(cè)二者水平可為預(yù)后判斷提供信息。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2016.25.016

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河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題暨河北省政府資助優(yōu)秀臨床人才計(jì)劃基金項(xiàng)目（ZL20140103）；承德市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20132408）。

李春輝（E-mail：chli612@126.com）

2016-01-24）