BCRP過表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

于兆進(jìn)，余澗坤，于麗鳳，魏敏杰，趙琳（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽(yáng)110001）

BCRP過表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

于兆進(jìn)，余澗坤，于麗鳳，魏敏杰，趙琳
（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽(yáng)110001）

目的 探討乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）基因過表達(dá)對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435S增殖和凋亡的影響。方法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-435S細(xì)胞，將其隨機(jī)分為三組，陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組將真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/BCRP經(jīng)雙酶切和測(cè)序鑒定后轉(zhuǎn)染MDA-MB-435S細(xì)胞，陰性對(duì)照組同步轉(zhuǎn)染2 μg pcDNA3.1的空質(zhì)粒，空白對(duì)照組用2 mL原培養(yǎng)液正常培養(yǎng)。采用RT-PCR法和Western blotting法檢測(cè)BCRP mRNA和蛋白表達(dá)。轉(zhuǎn)染后48 h，每組再分設(shè)7個(gè)絲裂霉素（MMC）濃度（0.01、0.10、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00 μmol/L）組，每個(gè)濃度組3個(gè)復(fù)孔，加入相應(yīng)濃度的MMC 10 μL，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況；流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果 重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/BCRP經(jīng)雙酶切和測(cè)序證實(shí)該質(zhì)粒構(gòu)建正確；陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染24、48、72 h后，MDA-MB-435S細(xì)胞中BCRP mRNA和蛋白表達(dá)均明顯增加（P均＜0.05）；與陰性對(duì)照組比較，陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/BCRP 48 h后，細(xì)胞凋亡率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；CCK-8結(jié)果顯示，化療藥物MMC作用24 h后，與陰性對(duì)照組比較，陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/BCRP 48h后細(xì)胞存活率顯著增加（P＜0.05）。結(jié)論 BCRP過表達(dá)可促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435S增殖，但對(duì)細(xì)胞凋亡無明顯影響。

乳腺癌；乳腺癌耐藥蛋白；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

乳腺癌是對(duì)化療較敏感的實(shí)體瘤之一，術(shù)后化療可明顯降低乳腺癌患者的復(fù)發(fā)率，10年生存率提高10%左右［1］。然而，內(nèi)在性和獲得性的多藥耐藥性（MDR）產(chǎn)生是引起化療失敗的重要原因。乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）是從耐藥的人乳腺癌細(xì)胞株MCF7/AdrVP中用RNA指紋分析法分離出來的跨膜半轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，與乳腺癌耐藥作用最為相關(guān)。由位于人染色體4q22的ABCG2基因編碼，包含2.4 kb mRNA翻譯的655個(gè)氨基酸殘基、1個(gè)ATP結(jié)合域和1個(gè)疏水性跨膜結(jié)構(gòu)域［2］。BCRP通過水解ATP供能將轉(zhuǎn)運(yùn)底物（化療藥物）從細(xì)胞內(nèi)逆濃度梯度泵到細(xì)胞外［3］，特異性使乳腺癌細(xì)胞內(nèi)米托蒽醌、拓?fù)涮婵怠⒚顾?、羅丹明123等濃度下降，從而導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)藥物抵抗、誘導(dǎo)耐藥性產(chǎn)生［4～7］。2014年11月～2015年5月，我們用pcDNA3.1-BCRP-cDNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435S，構(gòu)建BCRP基因過表達(dá)細(xì)胞模型，觀察乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的變化，為進(jìn)一步研究BCRP在乳腺癌中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 MDA-MB-435S細(xì)胞（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥理教研室凍存），pcDNA3.1真核表達(dá)載體、感受態(tài)大腸桿菌E.Coli DH5α、小量及大量質(zhì)粒提取試劑盒（天根生化科技有限公司）；限制性內(nèi)切酶HindⅢ、BamH I、人源性反轉(zhuǎn)錄酶（AMV）、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、RNA提取試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；pMD18-T克隆載體及dNTP （Promega）；LipofectamineTM2000（Invitrogen）；PVDF膜（美國(guó)Miliipore）；引物合成及測(cè)序由上海生物工程技術(shù)公司完成；Annexin V FITC凋亡試劑盒（晶美生物工程有限公司）；絲裂霉素（MMC，大連美侖生物技術(shù)有限公司）；CCK-8試劑盒（日本DOjinDO）。PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)PE 9600）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD FACS Calibur）；倒置熒光顯微鏡CCD成像系統(tǒng)（日本OLYMPUS）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 MDA-MB-435S細(xì)胞用含抗生素的10%FBS高糖DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代，轉(zhuǎn)染前1 d胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105/mL，每孔2 mL接種6孔板。培養(yǎng)18～24 h，細(xì)胞達(dá)90%融合。將細(xì)胞隨機(jī)分為三組，陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組取2 μg質(zhì)粒加入250 μL DMEM培養(yǎng)基中，得到A液。取4 μL Lipofectamine 2000加于250 μL DMEM培養(yǎng)基中，得到B液，室溫靜置5 min。將A和B液混勻，室溫靜置20 min后均勻滴于1.5 mL細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕輕晃動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)板，混合均勻，分別培養(yǎng)24、48、72 h；陰性對(duì)照組同步轉(zhuǎn)染2 μg pcDNA3.1的空質(zhì)粒，其余操作同陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組；空白對(duì)照組用2 mL原培養(yǎng)液正常培養(yǎng)。

1.3 質(zhì)粒鑒定 將pMD18-T/BCRP重組質(zhì)粒用HindⅢ和BamH I雙酶切，回收BCRP cDNA片段，并與經(jīng)HindⅢ和BamH I雙酶切的真核表達(dá)載體pcDNA3.1進(jìn)行連接反應(yīng)，用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌DH5α，挑取含氨芐青霉素抗性的陽(yáng)性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后按質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒，以HindⅢ和BamH I雙酶切鑒定。細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白質(zhì)粒48 h后，熒光顯微鏡下觀察，計(jì)算帶有綠色熒光的細(xì)胞百分比，轉(zhuǎn)染效率=（綠色熒光細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.4 BCRP mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用RT-PCR法。用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)定量。以隨機(jī)引物于M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件為30℃10 min，50℃30 min，95℃5 min，5℃5 min，1個(gè)循環(huán)。而后以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94℃45 s，55℃45 s，72℃30 s，30個(gè)循環(huán)。

1.5 BCRP蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用RIPI蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定總蛋白量。取25 μg蛋白樣品上樣，進(jìn)行10%SDS-PAGE，電泳結(jié)束取出凝膠，用轉(zhuǎn)印儀將蛋白轉(zhuǎn)移在PVDF膜上。轉(zhuǎn)移膜經(jīng)5%脫脂奶粉封閉1 h后，加入兔抗BCRP單克隆抗體（1∶500稀釋），4℃孵育過夜，PBST洗膜，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶5 000稀釋），室溫孵育1 h，PBST洗膜，用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)BCRP蛋白表達(dá)，以β-actin作為內(nèi)參，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞存活率測(cè)算 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-435S細(xì)胞，接種至96孔板中，每孔100 μL細(xì)胞懸液（5×103個(gè)細(xì)胞），培養(yǎng)過夜后，陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組與陰性轉(zhuǎn)染組按前述方法轉(zhuǎn)染陽(yáng)性質(zhì)粒及陰性質(zhì)粒（每孔質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑用量為6孔板的1/20），同步設(shè)置空白對(duì)照組。轉(zhuǎn)染后48 h，棄板內(nèi)液體，重新加入培養(yǎng)基后，每組再分設(shè)7個(gè)MMC濃度組（0.01、0.10、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00 μmol/L），每個(gè)濃度組3個(gè)復(fù)孔，加入相應(yīng)濃度的MMC 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄板內(nèi)液體，重新加入培養(yǎng)基，然后每孔加入CCK-8工作液10 μL，37℃孵育1 h，60 r/min振蕩10 min，用安圖酶標(biāo)儀450 nm檢測(cè)OD值，并計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（陰性對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值）×100%。

1.7 乳腺癌細(xì)胞凋亡情況檢測(cè) 采用Annexin V-FITC/PI雙染法。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種至6孔板中，每孔2 mL細(xì)胞懸液（3×105個(gè)細(xì)胞），37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，按前述方法轉(zhuǎn)染陽(yáng)性及陰性對(duì)照質(zhì)粒，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，按照凋亡試劑盒說明書上步驟進(jìn)行處理并通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BCRP過表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 抽提質(zhì)粒進(jìn)行HindⅢ/BamHⅠ酶切后進(jìn)行凝膠電泳，可見2 381 bp和5 400 bp兩個(gè)基因片段，證明重組質(zhì)粒中含有BCRP cDNA全長(zhǎng)；成功構(gòu)建的的重組質(zhì)粒pcDNA 3.1/BCRP，片段長(zhǎng)度為7.9 kb。電泳結(jié)果見圖1。

圖1 pcDNA3.1/BCRP質(zhì)粒HindⅢ和BamHⅠ酶切產(chǎn)物的電泳分析

2.2 BCRP過表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率 細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白質(zhì)粒48 h后，熒光顯微鏡下觀察可見綠色熒光，MDA-MB-435S轉(zhuǎn)染效率為40.21%±4.18%。熒光顯微鏡照相結(jié)果見圖2。

圖2 熒光顯微鏡觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前后的MDA-MB-435S細(xì)胞

2.3 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/BCRP重組質(zhì)粒后乳腺癌細(xì)胞中BCRP mRNA表達(dá) 重組質(zhì)粒pcDNA3.1/BCRP轉(zhuǎn)染MDA-MB-435S細(xì)胞后24、48、72 h，BCRP mRNA表達(dá)較空白對(duì)照組增加（68.18±12.45）%、（107.80± 22.62）%、（182.93±31.78）%（P均＜0.01）；陰性對(duì)照組BCRP mRNA表達(dá)（0.064±0.012）較空白對(duì)照組（0.071±0.015）無明顯增加（P＞0.05），見圖3。

圖3 RT-PCR法檢測(cè)MDA-MB-435S細(xì)胞中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后BCRP mRNA表達(dá)

2.4 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/BCRP重組質(zhì)粒后乳腺癌細(xì)胞中BCRP蛋白表達(dá) 重組質(zhì)粒pcDNA3.1/BCRP轉(zhuǎn)染MDA-MB-435S細(xì)胞后24、48、72 h，BCRP蛋白表達(dá)水平較空白對(duì)照組分別增加（17.46± 4.66）%、（72.71±15.05）%和（85.34±19.56）% （P＜0.05）；陰性對(duì)照組BCRP表達(dá)水平（0.059± 0.008）較空白對(duì)照組（0.066±0.014）無明顯增加（P＞0.05）。見圖4。

圖4 Western blotting法檢測(cè)MDA-MB-435S細(xì)胞中轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后BCRP蛋白表達(dá)

2.5 BCRP基因過表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響

化療藥物MMC作用24 h后，與陰性對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/BCRP 48 h后細(xì)胞存活率顯著增加（P＜0.05）。見圖5。

圖5 CCK-8法檢測(cè)MDA-MB-435S細(xì)胞轉(zhuǎn)染后細(xì)胞存活率

2.6 BCRP基因過表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響

轉(zhuǎn)染后48 h，陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組MDA-MB-435S細(xì)胞凋亡率（53.24%±6.86%）與陰性對(duì)照組（51.08%± 5.20%）比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見圖6。

3 討論

圖6 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)三組MDA-MB-435S細(xì)胞凋亡

BCRP基因位于4q22～23，編碼665個(gè)氨基酸殘基。BCRP跨度超過66kb，包括16個(gè)外顯子和15個(gè)內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)在第二個(gè)外顯子上，第一個(gè)外顯子含有大量的5＇端不翻譯區(qū)，在此區(qū)存在三種未翻譯的外顯子（E1a、Elb、E1c），這些變異體在藥物篩選細(xì)胞系中的表達(dá)及翻譯起始位點(diǎn)均不同，在MCF-7細(xì)胞系中以Elc為主并被高效翻譯［8］。BCRP首先在人乳腺癌細(xì)胞株中被發(fā)現(xiàn)，但其并非乳腺癌所特有。研究表明，以米托蒽醌（MX）誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116、人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株GLC4、人骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226等獲得的耐藥株均可檢測(cè)到BCRP過表達(dá)［9～11］。除MX外，近年來發(fā)現(xiàn)Topo I抑制劑拓?fù)涮婵?、伊立替康等亦能誘導(dǎo)細(xì)胞BCRP的過表達(dá)。通過抑制BCRP的表達(dá)已成為逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的重要手段，Xie等［12］報(bào)道，RNAi抑制人絨毛膜癌細(xì)胞中BCRP表達(dá)后，可增加細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，微小RNA-miR-181a、487a靶向抑制BCRP表達(dá)后，可增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素和米托蒽醌的敏感性［13］。

本研究應(yīng)用基因重組技術(shù)構(gòu)建了DH5α真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/BCRP，經(jīng)酶切和測(cè)序分析堿基排列順序正確，沒有突變，證實(shí)質(zhì)粒構(gòu)建成功。該質(zhì)粒可在MDA-MB-435S細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)BCRP的合成，使得BCRP在細(xì)胞中的表達(dá)顯著增高，繼BCRP過表達(dá)的耐藥細(xì)胞株誘導(dǎo)成功之后，成功構(gòu)建了BCRP過表達(dá)MDAMB-435S細(xì)胞模型。并且該質(zhì)粒帶有neo基因，能夠進(jìn)行真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的G418壓力篩選試驗(yàn)，有可能篩選出BCRP基因過表達(dá)的陽(yáng)性單細(xì)胞克隆，并建立目的基因過表達(dá)的細(xì)胞株。以上實(shí)驗(yàn)研究為闡明BCRP在乳腺癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能及進(jìn)一步研究BCRP在乳腺癌發(fā)生發(fā)展和多藥耐藥產(chǎn)生過程中的作用奠定了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MDA-MB-435S在轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1-BCRP-cDNA質(zhì)粒后BCRP表達(dá)明顯增加，加入MMC 24 h后細(xì)胞存活率升高，即細(xì)胞對(duì)MMC敏感性降低，該結(jié)果與BCRP可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞耐藥性一致。同時(shí)細(xì)胞凋亡變化不大，但具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究BCRP在乳腺癌細(xì)胞中的作用及其機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，對(duì)其功能的進(jìn)一步研究可能為更有效地治療癌癥提供新途徑。

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Influence of BCRP overexpression on proliferation and apoptosis of human breast cancer cells

YU Zhaojin，YU Jiankun，YU Lifeng，WEI Minjie，ZHAO Lin
（Department of Pharmacology，China Medical University，Shenyang 110001，China）

Objective To investigate the effect of breast cancer resistance protein（BCRP）overexpression on cell proliferation and apoptosis of breast cancer cells MDA-MB-435S.Methods MDA-MB-435S cells in the logarithmic phase were randomly divided into three groups：the positive transfection group，in which the eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1/BCRP was identified by restriction analysis and sequencing and then was transfected into MDA-MB-435S cells，the positive control group，in which the cells were transfected with 2 μg pcDNA3.1 empty plasmid at the same time，and the blank control group，in which the cells were cultured with 2 mL nutrient solution.The mRNA and protein expression of BCRP was determined by RT-PCR and Western blotting，respectively.After 48-hour transfection，7 mitomycin（MMC）concentration groups（0.01，0.10，2.50，5.00，10.00，20.00，40.00 μmol/L）were set up in each group，each concentration group had 3 complex holes which were added with 10 μL MMC.Cell counting kit-8（CCK-8）and flow cytometry were used to determine the influence of BCRP on cell proliferation and apoptosis of MDA-MB-435S cells，respectively.Results Restriction analysis and sequencing proved that recombinant plasmid pcDNA3.1/BCRP was constructed correctly. Both the expression of BCRP mRNA and protein was up-regulated in MDA-MB-435S cells after transfection 24，48 or 72 h in the positive transfection group（P＜0.05）.No significant difference was found between the positive transfection group and the negative control group（P＞0.05）.After MMC treatment of 24 hours，CCK-8 showed that the cell survival rate in the transfection group was significantly higher than that of the negative control group（P＜0.05）.Conclusion BCRP overexpression promotes the proliferation of MDA-MB-435S cells，but has no significant effect on apoptosis.

breast carcinoma；breast cancer resistance protein；cell proliferation；apoptosis

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.25.006

R737.9

A

1002-266X（2016）25-0020-04

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81573462）；遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計(jì)劃項(xiàng)目（LJQ2015118）。

于兆進(jìn)（1983-），男，講師，博士研究生在讀，主要研究方向?yàn)榉肿幽[瘤藥理學(xué)研究。E-mail：yuzhaojin19830813@163.com

簡(jiǎn)介：趙琳（1979-），女，副教授，博士研究生，主要研究方向?yàn)榉肿幽[瘤藥理學(xué)研究。E-mail：zl_cmu@163.com

2015-11-25）