人結(jié)腸癌組織中NIBP、CyclinE和CyclinD1蛋白表達(dá)變化及意義

陳楚杰，黃杰安，徐春燕（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530007）

人結(jié)腸癌組織中NIBP、CyclinE和CyclinD1蛋白表達(dá)變化及意義

陳楚杰，黃杰安，徐春燕
（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530007）

目的 觀察結(jié)腸癌患者癌組織中NIK-IKK結(jié)合蛋白（NIBP）、周期蛋白E（CyclinE）和周期蛋白D1（CyclinD1）表達(dá)變化，并探討其臨床意義。方法 收集經(jīng)外科手術(shù)切除及消化內(nèi)科腸鏡活檢的部分標(biāo)本130例份，其中正常結(jié)腸黏膜、結(jié)腸癌各65例份，患者均未接受放化療。采用免疫組織化學(xué)SP法檢測結(jié)腸癌組織及正常結(jié)腸黏膜組織中NIBP、CyclinE和CyclinD1表達(dá)，并分析三者陽性細(xì)胞表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系；采用Pearson或Spearman相關(guān)檢驗分析NIBP、CyclinE和CyclinD1表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果 正常結(jié)腸黏膜組織與結(jié)腸癌組織中NIBP陽性表達(dá)率分別為18.46%（12/65）、60.00%（39/65），CyclinD1陽性表達(dá)率分別為3.08%（2/65）、56.92%（37/65），CyclinE陽性表達(dá)率分別為43.08%（28/65）、89.23%（58/65），兩種組織中NIBP、CyclinD1及CyclinE陽性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。NIBP、CyclinE和CyclinD1表達(dá)與結(jié)腸癌患者腫瘤浸潤深度、TNM臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)（P均＜0.05）。結(jié)腸癌組織中NIBP與CyclinE、CyclinD1表達(dá)呈正相關(guān)（rs分別為0.43、0.32，P均＜0.05），CyclinE、CyclinD1表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.23，P＜0.05）。結(jié)論 NIBP、CyclinE及CyclinD1在人結(jié)腸癌組織中呈高表達(dá)，三者可能參與了結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。

結(jié)腸癌；NIK-IKK結(jié)合蛋白；周期蛋白E；周期蛋白D1

2011年統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，我國女性結(jié)腸癌發(fā)病率居第3位、男性居第5位，而結(jié)腸癌患者病死人數(shù)高居所有腫瘤第5位［1］。結(jié)腸癌的發(fā)生是黏膜上皮受到遺傳和環(huán)境等多種因素導(dǎo)致多基因改變及相互作用的結(jié)果，本質(zhì)在于細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控，呈現(xiàn)無限制性的自主分裂與增殖，但其發(fā)生發(fā)展的確切機制至今尚不明確。細(xì)胞周期蛋白（Cyclins）是一個與細(xì)胞周期相關(guān)的核蛋白家族，其中細(xì)胞周期蛋白E （CyclinE）屬G1期的正調(diào)節(jié)因子，其通過促進(jìn)G1向S期的轉(zhuǎn)變，調(diào)節(jié)組織細(xì)胞增殖的作用，研究［2］證實其在腫瘤組織中常表達(dá)增強；CyclinD1是細(xì)胞周期成分G1期中衡量表達(dá)的癌基因，如過量表達(dá)可導(dǎo)致G1期縮短、細(xì)胞分裂加快，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［3］。NIK-IKK結(jié)合蛋白（NIBP）是一種支架蛋白，其能將NF-κB經(jīng)典途徑中的關(guān)鍵激活子-IKKp和非經(jīng)典途徑中的關(guān)鍵酶-NIK連接成為三聚體，NIBP在NF-κB經(jīng)典途徑中發(fā)揮激活劑的作用［4］，而NIKK/IKK/NF-κB可調(diào)控CyclinD1、D2、D3和E1的表達(dá)，但在結(jié)腸癌中NIBP是否通過Cyclin參與調(diào)控人結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展仍不明了。2015年2～12月，我們采用免疫組化SP方法檢測了NIBP、CyclinE 及CyclinD1在人結(jié)腸癌組織與正常腸黏膜中的表達(dá)，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2015年2～12月未接受放、化療、經(jīng)外科手術(shù)切除及消化內(nèi)科腸鏡活檢的部分標(biāo)本130例份，其中距離癌旁10 cm的正常結(jié)腸黏膜、結(jié)腸癌組織各65例份，患者年齡15～84（55.44±13.32）歲，標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)確診。其中腫瘤浸潤深度黏膜或肌層23例，深肌層以下42例；TNM分期Ⅰ期9例，Ⅱ期17例，Ⅲ期18例，Ⅳ期21例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移22例。

1.2 結(jié)腸癌組織及正常結(jié)腸黏膜組織中NIBP、CyclinE和CyclinD1表達(dá)檢測 采用免疫組化染色法。標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)4 μm切片。按SP法染色，具體步驟參考說明書進(jìn)行抗原修復(fù)，分別用NIBP多克隆抗體、CyclinE和CyclinD1單抗作為一抗4℃過夜，二抗和辣根過氧化物酶孵育后，DAB顯色、蘇木素染核，封片。陽性對照由試劑公司提供，用PBS代替一抗作為陰性對照。用O-lympus顯微鏡及顯微攝像儀對染色組織切片進(jìn)行觀察。每張切片分別取上、下、左、右及中央共5個區(qū)域進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，每個區(qū)計數(shù)100個細(xì)胞，共計數(shù)500個細(xì)胞，對照陽性切片，計算染色陽性細(xì)胞（胞膜/胞質(zhì)/胞核中出現(xiàn)明顯的黃色或黃褐色顆粒視為免疫組化染色陽性）所占比例，綜合染色強度及陽性細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，相關(guān)分析采用Pearson或Spearman相關(guān)檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色結(jié)果 NIBP主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，CyclinE和CyclinD1主要表達(dá)于細(xì)胞核，見圖1。

圖1 NIBP、CyclinE及CyclinD1在結(jié)腸癌組織及正常結(jié)腸黏膜組織中的表達(dá)

2.2 結(jié)腸癌組織及正常結(jié)腸黏膜組織中NIBP、CyclinE和CyclinD1陽性表達(dá)率比較 正常結(jié)腸黏膜組織與結(jié)腸癌組織中的NIBP陽性細(xì)胞表達(dá)率分別為18.46%（12/65）、60.00%（39/65），CyclinD1陽性細(xì)胞表達(dá)率分別為3.08%（2/65）、56.92%（37/ 65），CyclinE陽性細(xì)胞表達(dá)率分別為43.08%（28/ 65）、89.23%（58/65），兩種組織中NIBP、CyclinD1 及CyclinE陽性細(xì)胞表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。

2.3 NIBP、CyclinE和CyclinD1表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 NIBP、CyclinE及CyclinD1陽性表達(dá)與結(jié)腸癌患者腫瘤浸潤深度、TNM臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)（P均＜0.05）。見表1。

表1 NIBP、CyclinE及CyclinD1表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系（例）

2.4 NIBP、CyclinE和CyclinD1在結(jié)腸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性 結(jié)腸癌組織中NIBP與CyclinE、CyclinD1表達(dá)呈正相關(guān)（rs分別為0.43、0.32，P均＜0.05），CyclinE、CyclinD1表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.23，P ＜0.05）。

3 討論

結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，主要好發(fā)于直腸與結(jié)腸交界處。近年來數(shù)據(jù)提示，結(jié)腸癌在我國的發(fā)病率逐年增加。在腫瘤的惡性增殖中，常伴隨原癌基因的激活，腫瘤細(xì)胞內(nèi)大量周期蛋白的調(diào)控失衡［5］。目前已發(fā)現(xiàn)Cyclin家族成員A～J10大類，15種亞型。其中CyclinE是參與細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換的重要正性調(diào)節(jié)因子。柴大敏等［6］研究發(fā)現(xiàn)，喉鱗狀細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移的標(biāo)本中，CyclinE基因表現(xiàn)為強陽性。姚坦等［7］研究膽囊癌患者發(fā)現(xiàn)，癌組織中CyclinE陽性表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞周期的調(diào)控異?？赡苁羌膊“l(fā)生發(fā)展的重要特征。而Hanashiro等［8］認(rèn)為CyclinE對中心體復(fù)制起始激酶復(fù)合物發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用，過度表達(dá)則干擾有絲分裂，形成不穩(wěn)定的染色體，這是誘發(fā)腫瘤形成的可能機制之一。Cyclin家族中，CyclinD1是G1期細(xì)胞增殖信號的關(guān)鍵蛋白，常被視為一種原癌基因。在正常組織中CyclinD1呈恒定表達(dá)，在膀胱癌、肺癌、卵巢癌及膽道腫瘤中均呈高表達(dá)［9～12］，同時在膽囊癌中CyclinE表達(dá)與CyclinD1呈正相關(guān)，提示二者可能有一定協(xié)同作用［13］。

NIBP是一種支架蛋白，其能將NF-κB經(jīng)典途徑中的關(guān)鍵激活子-IKKp和非經(jīng)典途徑中的關(guān)鍵酶-NIK連接成為三聚體。研究發(fā)現(xiàn)，NIK/IKK/NF-κB信號通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其中重要特征之一就是調(diào)控細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)［14］。在本研究中同樣證實，人結(jié)腸癌組織中NIBP、 CyclinE及CyclinD1表達(dá)明顯高于正常結(jié)腸黏膜組織，同時NIBP、CyclinE及CyclinD1陽性表達(dá)與腫瘤浸潤深度、TNM臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)。NIBP、CyclinE及CyclinD1陽性表達(dá)越強，癌組織浸潤深度越深、TNM分期越高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移越多，提示NIBP、CyclinE及CyclinD1參與了人結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移。研究還發(fā)現(xiàn)NIBP、CyclinE 及CyclinD1陽性表達(dá)三者之間互為正相關(guān)。CyclinD1和CyclinE正相關(guān)提示CyclinE亦可能是腫瘤發(fā)生的早期事件，而NIBP與CyclinE、CyclinD1呈正相關(guān)，可能提示NIBP通過NF-κB通路干預(yù)了細(xì)胞周期，調(diào)控CyclinE及CyclinD1表達(dá)而參與結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移與發(fā)生發(fā)展。

總之，NIBP、CyclinE及CyclinD1在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)提示其參與了結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移過程，NIBP可能通過NF-κB通路調(diào)控CyclinE及CyclinD1介導(dǎo)結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移。NIBP、CyclinE及CyclinD1未來可能作為結(jié)腸癌預(yù)后參考指標(biāo)及腫瘤的抑制靶點。

［1］陳萬青，鄭榮壽，曾紅梅，等.2011年中國惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析［J］.中國腫瘤，2015，24（1）：1-10.

［2］Hur K，Kim JR，Yoon BI，et al.Overexpression of CyclinD1 and CyclinE in 1，2-dimethylhydrazine dihydrochloride-induced rat colon carcinogenesis［J］.J Vet Sci，2000，1（2）：121-126.

［3］Elkady AI，Hussein RA，Abu-Zinadah OA.Differential control of growth，apoptotic activity and gene expression in human colon cancer cells by extracts derived from medicinal herbs，Rhazya stricta and Zingiber officinale and their combination［J］.World J Gastroenterol，2014，20（41）：15275-15288.

［4］Hu WH，Pendergast JS，Mo XM，et al.NIBP，a novel NIK and IKK（beta）-binding protein that enhances NF-（kappa）B activation ［J］.J Biol Chem，2005，280（32）：29233-29241.

［5］Phang CW，Karsani SA，Sethi G，et al.Flavokawain C inhibitscell cycle and promotes apoptosis，associated with endoplasmic reticulum stress and regulation of MAPKs and Akt signaling pathways in HCT 116 human colon carcinoma cells［J］.PLoS One，2016，11（2）：e0148775.

［6］柴大敏，鮑正齊，胡建國，等.喉鱗狀細(xì)胞癌中細(xì)胞周期蛋白E 和p27異常表達(dá)的臨床意義［J］.臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2014，28（3）：165-169.

［7］姚坦，孟翔凌.P27和CyclinE在膽囊癌組織中的表達(dá)及意義［J］.肝膽外科雜志，2008，16（1）：41-44.

［8］Hanashiro K，Kanai M，Geng Y，et al.Roles of cyclins A and E in induction of centrosome amplification in p53-compromised cells ［J］.Oncogene，2008，27（40）：5288-5302.

［9］宋旭，周磐石，張圣熙，等.膀胱尿路上皮癌MRP-1/CD9和CyclinD1的表達(dá)與腫瘤生物學(xué)行為的關(guān)系［J］.臨床泌尿外科雜志，2012，27（5）：389-392.

［10］王靜，苗麗君，吳逸明，等.非小細(xì)胞肺癌組織中AKT2、CyclinD1、MMP-9表達(dá)及其與臨床病理因素的關(guān)系［J］.癌癥，2006，25（1）：69-72.

［11］韋淑琴，隋麗華，戚基萍，等.ERK1/2和CyclinD1蛋白在卵巢上皮性腫瘤組織中的表達(dá)及其意義［J］.腫瘤防治研究，2004，31（2）：90-92.

［12］喬岐祿，溫泉，趙建勛，等.β-catenin與CyclinD1在膽道腫瘤中的表達(dá)及臨床意義（英文）［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2007，17 （2）：134-137.

［13］丁俊，李可為，王堅，等.P27、CyclinD1、CyclinE在原發(fā)性膽囊癌中的表達(dá)及臨床意義［J］.肝膽胰外科雜志，2009，21（3）：191-195.

［14］李素艷，黃杰安，譚林，等.NIK和IKKβ連接蛋白、C-myc和細(xì)胞周期蛋白D1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及意義［J］.中國全科醫(yī)學(xué)，2015，18（24）：2922-2928.

Expression and clinical significance of NIBP，CyclinE and CyclinD1 proteins in human colon carcinoma

CHEN Chujie，HUANG Jiean，XU Chunyan
（The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530007，China）

Objective To observe the expression of NIK-IKK binding protein（NIBP），CyclinE and CyclinD1 in the tissues of patients with colon cancer，and to explore its clinical significance.Methods We collected 130 cases of samples from surgical resection and enteroscope biopsy of digestive internal medicine，65 cases of normal colon mucosa and 65 cases of cancer tissues in each group，all patients did not receive radiotherapy and chemotherapy.The expression of NIBP，CyclinE and CyclinD1 was detected by immunohistochemistry SP method，and then we analyzed the relationship between the positive expression of proteins and the clinicopathologic features in patients with colon cancer.The correlations between expression of NIBP，CyclinE and CyclinD1 were determined by Pearson or Spearman tests.Results The positive expression rates of NIBP in the normal colonic mucosa and colon cancer tissues were 18.46%（12/65）and 60.00%（39/65），respectively；the positive expression rates of CyclinD1 were 3.08%（2/65）and 56.92%（37/65），respectively；and the positive expression rates of CyclinE were 43.08%（28/65）and 89.23%（58/65），respectively.Significant differences were found in the positive expression rates of NIBP，CyclinE and CyclinD1 between these two groups（all P＜0.05）.The expression of NIBP，CyclinE and CyclinD1 was significantly related with the depth of tumor invasion，TNM staging，lymph node metastasis and distant metastasis in patients with colon cancer（all P＜0.05）.In the colon cancer tissues，the expression of NIBP was positively correlated with CyclinE and CyclinD1 expression（r=0.43，0.32，all P＜0.05），and the expression of CyclinD1 and CyclinE was positively correlated（r=0.23，P＜0.05）.Conclusion NIBP，CyclinE and CyclinD1 is highly expressed in the human colon cancer tissues，and they may participate in the occurrence and developmentof colon cancer tissues.

colon carcinoma；NIK-IKK binding protein；CyclinE；CyclinD1

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.25.004

R735.35

A

1002-266X（2016）25-0013-04

廣西自然科學(xué)基金資助項目（2013GXNSFAA019159）。

陳楚杰（1989-），在讀碩士，主要研究方向為消化道腫瘤的基礎(chǔ)與臨床。E-mail：397538840@qq.com

簡介：黃杰安（1965-），教授，主要研究方向為消化道腫瘤的基礎(chǔ)與臨床。E-mail：1404991727@qq.com

2016-03-21）