FAK對黑米花青素抑制HER-2陽性乳腺癌轉(zhuǎn)移的影響研究

周　杰,陳祥燕,陳靜瑤,李　飛,朱彥鋒,余小平

(成都醫(yī)學院公共衛(wèi)生系,四川成都 610500)

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FAK對黑米花青素抑制HER-2陽性乳腺癌轉(zhuǎn)移的影響研究

周杰,陳祥燕,陳靜瑤,李飛,朱彥鋒,余小平*

(成都醫(yī)學院公共衛(wèi)生系,四川成都 610500)

目的:探討粘著斑激酶(Focal Adhesion Kinase,FAK)在黑米花青素(Black Rice Anthocyanins,BRACs)抑制人表皮生長因子受體2(Human epidermal growth factor-2;HER-2)陽性乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用。方法:以正常永生化乳腺細胞MCF-10A、HER-2陰性乳腺癌細胞MCF-7、HER-2陽性乳腺癌細胞MDA-MB-453為研究對象,使用Cell Counting Kits-8(CCK8)試劑盒檢測細胞活性;傷痕愈合實驗檢測細胞轉(zhuǎn)移狀態(tài);免疫印跡實驗測定FAK、cSrc表達及磷酸化水平;免疫共沉淀實驗檢測HER/FAK蛋白間相互作用。結(jié)果:與對照組相比,分別用50、100、200、400 μg/mL BRACs處理MDA-MB-453細胞后,抑制率分別為18.74%、21.06%、22.82%、40.12%;200 μg/mL BRACs處理后MDA-MB-453細胞遷移距離減少37%;FAK及cSrc磷酸化水平降低,HER-2/FAK蛋白間相互作用減弱。結(jié)論:BRACs通過減弱FAK與HER-2受體相互作用抑制FAK及cSrc磷酸化從而抑制MDA-MB-453細胞增殖和轉(zhuǎn)移,這可能是黑米花青素抑制MDA-MB-453細胞增殖和轉(zhuǎn)移的分子機制之一。

人表皮生長因子受體2,乳腺癌,轉(zhuǎn)移,粘著斑激酶

乳腺癌占全球癌癥病例的25%,患癌女性死亡病例中乳腺癌患者占15%[1],極大威脅著女性健康。黑米花青素(BRACs)是來源于黑米皮中的黃酮類植物化學物質(zhì),現(xiàn)有研究資料證實這類化合物具有抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤等生物學效應(yīng)[2-3]。已有研究表明,BRACs具有抑制HER2陽性乳腺癌血管生成、促進細胞凋亡作用[4]。在裸鼠MDA-MB-453移植瘤模型中,灌胃黑米花青素腫瘤增長速度減緩、腫瘤生長體積減小[5]。粘著斑激酶(FAK)是一種非受體酪氨酸激酶,主要作用是在整合素及黏著斑的作用下調(diào)節(jié)細胞表面受體從而參與調(diào)節(jié)細胞生理過程,FAK在多類腫瘤細胞中表現(xiàn)為過表達狀態(tài)[6]。研究表明FAK通過整合素介導的信號通路參與調(diào)節(jié)細胞遷移和粘附[7],HER-2/HER-3受體信號通路通過在Y397、Y861以及Y925位點引起FAK磷酸化從而促進腫瘤侵襲[8],Vadlamudia等人發(fā)現(xiàn)HER-2受體能通過cSrc/FAK信號通路調(diào)節(jié)乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移能力[9]。本研究探討B(tài)RACs對HER-2陽性乳腺癌細胞抗轉(zhuǎn)移效應(yīng)及FAK和cSrc對其抗轉(zhuǎn)移效應(yīng)的影響。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

BRACs吉林新星天然藥物公司(花青素含量43.2%);L-15不完全培養(yǎng)基凱基生物;DMEM高糖不完全培養(yǎng)基、DMEM/F12高糖不完全培養(yǎng)基美國Hyclone公司;胎牛血清、馬血清美國Gbico公司;胰島素日本W(wǎng)ako公司;EGF美國Peprotech公司;磁珠美國millipore公司;BCA試劑盒美國Thermo公司;鼠多克隆抗體Anti-HER-2、兔單克隆抗體Anti-FAK、鼠單克隆抗體Anti-cSrc、兔多克隆抗體Anti-Phospho-FAK(Y861)、兔多克隆抗體Anti-Phospho-cSrc(Y216)英國Abcam公司。

IX71倒置顯微鏡日本Olympus公司;XS2酶標儀中國BioTek公司;Thermo Scientific Forma 3110 CO2培養(yǎng)箱美國Thermo公司;PowerPacTMHC電泳儀美國Bio-RAD公司。

1.2細胞培養(yǎng)及分組

人乳腺癌細胞MDA-MB-453(雌激素受體陰性ER-,HER-2/neu高表達)中國科學院上海細胞庫,含10%胎牛血清的L-15培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng);人乳腺癌細胞MCF-7(雌激素受體陽性ER+,HER-2/neu弱表達或不表達)中國科學院上海細胞庫,含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng);人正常上皮永生化細胞MCF-10A第三軍醫(yī)大學糜漫天教授惠贈,DMEM/F12培養(yǎng)基(5%馬血清、20 ng/mL EGF、10 μg/mL胰島素、0.5 μg/mL氫化可的松、100 μg/L霍亂毒素)常規(guī)培養(yǎng)。實驗分為2組:空白對照組、BRACs處理組,處理濃度根據(jù)以往研究資料[10],設(shè)定為200 μg/mL,處理時間為24 h。

1.3CCK-8法檢測BRACs對細胞增殖的影響

將MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-453細胞調(diào)整細胞數(shù)至104個/mL,取100 μL接種于96孔板,培養(yǎng)24 h后加入終濃度為(0、50、100、200、400)μg/mL BRACs,每組設(shè)3個復孔。培養(yǎng)24 h,每孔加入10 μL CCK-8,繼續(xù)培養(yǎng)3 h,于450 nm處測定吸光度(A)值。增殖率(proliferation rate,PI)=(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%。

1.4傷痕愈合實驗檢測細胞遷移能力

MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-453細胞接種于24孔培養(yǎng)板,待細胞生長至90%密度,劃痕處理,加入無血清培養(yǎng)基,分別用0、200 μg/mL BRACs處理細胞24 h后于相差顯微鏡下觀察細胞遷移變化,用ImageJ軟件計算各組劃痕區(qū)域?qū)挾绕骄w移距離。

1.5Western Blot檢測蛋白表達

Western Blot檢測HER-2、FAK蛋白表達及FAK磷酸化水平。收取各實驗組細胞總蛋白,用BCA法測定濃度,取100 μg總蛋白進行凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF),含10%脫脂牛奶的TBST封閉1 h,1∶1000稀釋抗體4 ℃孵育過夜,TBST(含0.1%Tween-20的TBS緩沖液)漂洗3次(10 min/次),1∶2000稀釋二抗室溫孵育1h,TBST漂洗(3次,10 min/次)后進行化學發(fā)光法顯色,Quantity One 軟件分析結(jié)果。

1.6免疫共沉淀檢測蛋白相互作用

Co-IP檢測HER-2與FAK的相互關(guān)系。取細胞總蛋白,等量蛋白(1000 μg)液中加入HER-2抗體及免疫磁力珠進行免疫沉淀,SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上,然后加入FAK抗體4 ℃孵育過夜,HRP 結(jié)合的二抗37 ℃孵育2 h,ECL增強化學發(fā)光法檢測蛋白間相互作用,并進行圖像定量分析。

1.7統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)用x±S表示,采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA),組間比較采用t檢驗。

2　結(jié)果與分析

2.1BRACs對MDA-MB-453細胞增殖的影響

BRACs分別處理正常乳腺上皮MCF-10A細胞、HER-2陰性乳腺癌MCF-7細胞以及HER-2陽性乳腺癌MDA-MB-453細胞24 h以后,用CCK8試劑盒檢測細胞活性。如圖1所示,BRACs對MCF-10A細胞活性無明顯影響(p>0.05),50、200 μg/mL BRACs處理后MCF-7細胞活性有適當減少,無統(tǒng)計學意義(p>0.05),BRACs抑制了MDA-MB-453細胞的活性呈劑量依賴效應(yīng),與未加BRACs對照組相比,50、100、200、400 μg/mL BRACs對MDA-MB-453細胞抑制率分別為18.74%、21.06%、22.82%、40.12%(p<0.05)。

圖1　BRACs對MDA-MB-453細胞活性的影響Fig.1　Effects of BRACs on the cell viability of MDA-MB-453 cells

2.2BRACs對MDA-MB-453細胞遷移的影響

細胞遷移是腫瘤細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要過程,遷移有利于細胞從原來位置遷移到其他器官從而促進轉(zhuǎn)移發(fā)生。BRACs處理MCF-10A、MCF-7以及MDA-MB-453三種細胞24 h后于相差顯微鏡下觀察細胞遷移變化,用ImageJ軟件計算各組平均遷移距離。如圖2所示,與MCF-10A細胞相比,BRACs抑制了乳腺癌細胞MCF-7、MDA-MB-453細胞的遷移能力。200 μg/mL BRACs分別作用于MCF-7、MDA-MB-453細胞后,與未加BRACs對照組相比,MCF-7遷移距離與未加BRACs對照組相比降低了28%;MDA-MB-453細胞遷移距離相比未加BRACs對照組降低了37%,(p<0.05)。

圖2　BRACs對MDA-MB-453細胞遷移的影響Fig.2　Effects of BRACs on the migration of MDA-MB-453 cells注:圖A:a:對照組;b:200μg/mL BRACs組。

2.3BRACs對FAK磷酸化水平的影響

cSrc/FAK信號通路在調(diào)節(jié)HER-2陽性乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用[9],使用免疫印記法(western blot)檢測BRACs對HER-2陽性乳腺癌細胞cSrc、FAK磷酸化的影響,如圖3所示,200 μg/mL BRACs分別作用于MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-453細胞后,cSrc、FAK總表達量沒有變化,cSrc、FAK磷酸化水平下降,BRACs降低了HER-2陽性乳腺癌MDA-MB-453細胞FAK的磷酸化,抑制了cSrc/FAK信號通路的激活。

圖3　BRACs對FAK和cSrc磷酸化水平的影響Fig.3　Effects of BRACs on the phosphorylation of FAK and cSrc

2.4BRACs對HER-2與FAK蛋白間相互作用的影響

已有研究表明FAK在HER-2/HER-3誘導的乳腺癌發(fā)生及侵襲中發(fā)揮重要作用[11],HER-2激活具有召集FAK誘導其磷酸化的能力,HER-2活化引起HER-2與FAK之間相互聯(lián)系增加,選用免疫共沉淀法檢測HER-2/FAK相互作用。先將人抗HER-2抗體、免疫磁力珠與樣品蛋白免疫共沉淀以后檢測FAK蛋白含量的變化。MDA-MB-453細胞為HER-2高表達乳腺癌細胞,如圖4所示,選用HER-2抗體沉淀樣品蛋白后MDA-MB-453組FAK信號更強,MDA-MB-453細胞經(jīng)200μg/mL BRACs處理后,FAK信號減弱,這表明HER-2/FAK蛋白間相互聯(lián)系減弱,BRACs可能是通過減弱HER-2與FAK的相互結(jié)合從而抑制FAK極其下游蛋白的磷酸化。

圖4　BRACs對HER-2與FAK蛋白間相互結(jié)合的影響Fig.4　Effects of BRACs on the associationbetween HER-2 and FAK

3　討論

HER-2是表皮生長受體家族的一員,20%～30%乳腺癌患者都表現(xiàn)為HER-2過表達狀態(tài),而HER-2過表達會抑制腫瘤細胞凋亡,增加腫瘤血管增生,造成病人預后不良和復發(fā)[12-13]。有研究表明,黑米花青素(BRACs)能抑制HER-2陽性乳腺癌移種移植瘤血管形成,抑制瘤體生長;抑制裸鼠肺轉(zhuǎn)移瘤增殖,促進移植瘤細胞凋亡[14-15]。

FAK是一個非受體酪氨酸激酶,在肝細胞癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌等癌癥中都表現(xiàn)為過表達狀態(tài),這使其成為一個治療靶點[16]。HER-2/3受體高表達能促進FAK激活及其Y397、Y861和Y925位點磷酸化,FAK的磷酸化會通過激活下游FAK/Src/p130Cas信號通路調(diào)節(jié)細胞運動和粘附能力,從而造成腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生[17]。

本實驗研究表明,BRACs處理HER-2陽性乳腺癌MDA-MD-453細胞后,細胞活性下降,抑制細胞增殖,細胞遷移和侵襲能力減弱;通過免疫印跡實驗可以發(fā)現(xiàn)細胞FAK、cSrc磷酸化水平下降且HER-2與FAK蛋白間相互作用減弱。這表明BRACs在體外實驗中能抑制HER-2陽性乳腺癌細胞遷移能力,且BRACs處理后FAK、cSrc磷酸化水平下調(diào),HER-2/FAK蛋白間相互作用減弱,本課題組前期研究表明BRACs能與HER-2直接結(jié)合發(fā)揮抑制轉(zhuǎn)移作用[18],這提示FAK在HER-2介導的陽性乳腺癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用,BRACs可能通過抑制cSrc、FAK磷酸化以及抑制HER-2與FAK結(jié)合抑制其激活從而發(fā)揮抗HER-2陽性乳腺癌轉(zhuǎn)移作用。但對于FAK在BRACs抗HER-2陽性乳腺癌中的具體機制需要進一步的研究。

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Role of focal adhesion kinase in black rice anthocyanins inhibiting HER-2 positive human breast cancer cells

ZHOU Jie,CHEN Xiang-yan,CHEN Jing-yao,LI Fei,ZHU Yan-feng,YU Xiao-ping*

(Department of Public Health,Chengdu Medical College,Chengdu 610500,China)

Objective:To explore the role of focal adhesion kinase in HER-2 positive human breast cancer cells anti-metastasis by black rice anthocyanins(BRACs). Methods:To observe the effect of BRACs on the proliferation of MCF-10A,MCF-2 and MDA-MB-453 cells with CCK8 method. Metastasis of MCF-10A,MCF-2 and MDA-MB-453 cells were detected by wound healing experiments. The level of total and phosphorylated FAK and cSrc were detected by western blot. The interaction between HER-2 and FAK were analyzed by immunoprecipitation Results:Different concentration of BRACs including 50,100,200,400μg/mL were used to detect the influence which BRACs play on the growth MDA-MB-453 cells. Compared with control,the inhibition ratio of each group were 18.74%,21.06%,22.82%,40.12% respectively. The migration distance of MDA-MB-453 cells was decreased 37% by 200 μg/mL BRACs. The level of phosphorylated FAK and cSrc were reduced by BRACs and the interaction between HER-2/FAK was also decreased by BRACs. Conclusion:BRACs suppress the metastasis of HER-2 positive breast cancer cells via inhibiting the phosphorylation of FAK and cSrc by decrease the interaction between FAK and HER-2 which maybe a mechanism of anti-metastasis by BRACs.

HER-2;Breast carcinoma;metastasis;FAK

2015-07-13

周杰(1990-)，女，碩士在讀，研究方向：植物化學物抗腫瘤分子機制研究，E-mail:bravezhoujie@sina.com。

余小平(1970-)，男，博士后，教授，研究方向：植物化學物抗腫瘤分子機制研究,E-mail:cyggwsyxp@sina.com。

國家自然科學基金資助項目(81273074)；國家自然科學基金資助項目(81573154)；四川省青年科技創(chuàng)新研究團隊項目(2014TD0021)；四川省省屬高校科研創(chuàng)新團隊項目(14TD0023)；成都醫(yī)學院學科建設(shè)項目(CYXK2012010)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000