優(yōu)化超聲提取辣木葉黃酮及其抗氧化活性

岳秀潔,李　超,扶　雄

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510640)

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優(yōu)化超聲提取辣木葉黃酮及其抗氧化活性

岳秀潔,李超,扶雄*

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院,廣東廣州 510640)

采用響應(yīng)面分析法對辣木葉黃酮的超聲提取工藝進行優(yōu)化。以乙醇濃度、料液比、提取時間、提取溫度為考察因素,總黃酮得率和氧自由基吸收能力(ORAC)值為響應(yīng)值,進行四因素三水平的Box-Behnken實驗設(shè)計,最優(yōu)條件:乙醇濃度70%,料液比1∶27(m/v),提取時間46 min,提取溫度50 ℃,在此條件下,總黃酮得率為48.93±0.44 mg RE/g,ORAC值為2747.17±301.51 μmol TE/g,與預(yù)測值(49.23 mg RT/g,2853.99 μmol TE/g)的誤差為0.6%和3.7%。采用聚酰胺樹脂對辣木葉黃酮粗提物進行純化,純化后黃酮含量為65.89%,ORAC值為5923.48±228.65 μmol TE/g,且純化前后均表現(xiàn)出較強的DPPH和ABTS自由基清除能力,其EC50值分別為0.45、0.10和0.26、0.05 mg/mL。結(jié)果表明超聲提取是一種高效的提取辣木葉黃酮方法;聚酰胺樹脂可有效提高辣木葉提取物中的黃酮含量并顯著提高其抗氧化性。

辣木葉,黃酮,超聲提取,抗氧化

辣木(MoringaoleiferaLam),屬辣木科辣木屬植物,廣泛分布于亞洲、非洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)。辣木含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、氨基酸、脂肪、碳水化合物,其根、莖、葉、果、樹皮、種子等常被用來治療各種疾病,因此又被稱為“奇跡之樹”。辣木含有許多活性成分,具有多種生理活性,在醫(yī)藥保健行業(yè)具有廣泛的用途和前景。近年來,辣木在我國云南、廣東、福建、臺灣等地得到了廣泛的引種栽培,其藥理活性也引起了專家學(xué)者的廣泛關(guān)注。研究表明辣木的粗提物具有抗氧化[1-2]、抗腫瘤[3]、降血糖[4]、降血脂[5]、抗病毒[6]、抑菌[7]等活性。

目前,黃酮的提取方法主要有溶劑法、超聲法和微波法。傳統(tǒng)的溶劑提取耗時長、效率低,且長時間的加熱將會破壞黃酮化合物的結(jié)構(gòu),使其抗氧化等生物活性顯著下降。超聲法是利用超聲波的粉碎、空化、攪拌等作用,促進黃酮等有效成分的溶出,具有高效、經(jīng)濟等優(yōu)勢。本實驗以乙醇濃度、料液比、提取時間和溫度為考察因素,總黃酮得率和ORAC為響應(yīng)值,對超聲輔助提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化;采用聚酰胺樹脂對黃酮粗提物進行純化,并比較其純化前后黃酮含量和抗氧化活性的變化,為辣木葉黃酮高效提取及其抗氧化劑的開發(fā)利用提供理論知識。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

辣木干葉云南省云南三高辣木科技有限公司;AAPH(2,2′-Azobis(2-amidinopropane)Dihydrochloride);蘆丁;熒光素(FL);Trolox(6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid);維生素C;DPPH(1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl)和ABTS(2,2-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)Sigma-Aldrich公司;聚酰胺樹脂(30～60目)國藥集團化學(xué)試劑有限公司;其它試劑均為分析純。

KQ-300DE超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司;RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠;DL-5C低速臺式離心機上海安亭科學(xué)儀器廠;Fluoroskan Ascent FL熒光/化學(xué)發(fā)光分析儀美國Thermo公司;Scientz-18N冷凍干燥機寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1辣木葉總黃酮的提取流程辣木干葉→粉碎(60目)→超聲提取(300 W)→抽濾、離心(5000 r/min、15 min)→旋蒸濃縮→真空冷凍干燥→黃酮粗提物。

1.2.2最優(yōu)參數(shù)的確定

1.2.2.1單因素實驗以總黃酮得率和ORAC值為指標(biāo),固定超聲功率300 W,依次改變乙醇濃度、料液比、提取時間和溫度,實驗方法如下:

乙醇濃度:稱取辣木葉粉若干份,每份1 g,分別用50%、60%、70%、80%和90%的乙醇作為提取溶劑,料液比1∶30,60 ℃下超聲提取60 min。

料液比:稱取辣木葉粉若干份,每份1 g,分別加入5、15、25、35、45 mL的70%乙醇,60 ℃下超聲提取60 min。

提取時間:稱取辣木葉粉若干份,每份1 g,加入25 mL 70%乙醇,60 ℃下分別超聲提取10、30、45、60、90 min。

提取溫度:稱取辣木葉粉若干份,每份1 g,加入25 mL 70%乙醇,分別于40、50、60、70、80 ℃下超聲提取45 min。

1.2.2.2響應(yīng)面優(yōu)化實驗根據(jù)單因素實驗結(jié)果確定四因素三水平的最佳參數(shù)進行響應(yīng)面分析,如表1所示。

表1　因素水平表

1.2.3蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確稱取23.7 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品,用60%乙醇溶解并定容至50 mL,裝入棕色瓶中置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?474 μg/mL)。分別移取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于25 mL比色管中,加入0.3 mL 5% NaNO2溶液,混勻,6 min后加入0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液,混勻,靜置6 min,加入4 mL 4% NaOH溶液搖勻,放置15 min,用60%乙醇定容至10 mL,搖勻,15 min后于510 nm處測定吸光度,以蘆丁濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得標(biāo)準(zhǔn)方程為y=0.0111x+0.0049(x為蘆丁濃度,范圍為9 μg/mL

1.2.4黃酮含量測定稱取辣木葉粉1 g于100 mL三角瓶中,加入乙醇-水溶液,于超聲清洗器(300 W)中進行提取,抽濾、離心,用60%乙醇定容至50 mL,取0.5 mL提取液于25 mL比色管,用鋁絡(luò)合分光光度法測定總黃酮得率,單位為mg RE(rutin)/g,計算公式如下:

總黃酮得率=(10×CV1/V2m)×10-3

式(1)

式(1)中:C為依據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出來的黃酮濃度μg/mL;V1為提取液的總體積mL;V2為測定過程中所移取的提取液體積mL;m為稱取的辣木葉粉的質(zhì)量g。

1.2.5抗氧化活性的測定

1.2.5.1ORAC參考Zhang,W.等[8]的實驗方法:樣品、Trolox和熒光素鈉均用75 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)配成所需濃度。于96孔板中依次加入20 μL不同濃度的樣品溶液和Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液(6.25～50 μmol/L)、200 μL熒光素鈉鹽溶液(95.6 nmol/L),同時設(shè)空白對照組和控制對照組。設(shè)定熒光/化學(xué)分析儀的程序,37 ℃孵育20 min,自動混勻,迅速加入20 μL AAPH(119.4 mmol/L),自動混勻并開始測定。熒光強度為激發(fā)波長485 nm,吸收波長538 nm,每3.5 min測定一次,共35次。熒光強度分別記錄為f1、f2、f3,……,f35,根據(jù)公式計算熒光猝滅下的面積,計算公式如下:

AUC=3.5×[0.5×(f1+f35)+f2+f3+f4+…+f34]

式(2)

樣品組和空白組的熒光淬滅面積差表示為Trolox當(dāng)量(TE),單位為μmol TE/g。

1.2.5.2DPPH自由基清除能力參考Brand-Williams等[9]的方法并加以改進:用無水乙醇配制200 μM的DPPH工作液,將1 mL樣品溶液加入到3 mL DPPH工作液中,搖勻,室溫下避光反應(yīng)20 min后于517 nm下測定吸光值A(chǔ)i,無水乙醇代替DPPH扣除樣品溶液的本底吸收,吸光值為Aj,用相同體積的樣品溶劑代替樣品溶液作為對照,吸光值為A0。同時用相同濃度的VC作為控制對照組,計算公式為:

清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100

式(3)

1.2.5.3ABTS自由基清除能力參考Re等[10]的方法并加以改進:5 mL 7 mM的ABTS溶液和5 mL 2.45 mM的K2S2O8溶液避光反應(yīng)12 h生成ABTS+使用液,該使用液提前一天配制,且必須當(dāng)天使用,使用前用無水乙醇稀釋到吸光值在732 nm處為0.70±0.02。取0.4 mL不同濃度的樣品溶液于試管中,加入3 mL ABTS+·使用液,室溫下避光反應(yīng)30 min,于732 nm處測定吸光值A(chǔ)i,無水乙醇代替ABTS+·扣除樣品溶液的本底吸收,吸光值為Aj,用相同體積的樣品溶劑代替樣品溶液作為對照,吸光值為A0。同時用相同濃度的VC作為控制對照組,計算方法參考公式3。

1.2.6聚酰胺樹脂純化黃酮將處理好的聚酰胺樹脂裝入層析柱(Φ 6.0×80 cm)內(nèi)。稱取10 g黃酮粗提物用70%乙醇進行溶解,濕法裝柱,柱平衡后,先用8倍柱體積的蒸餾水洗去水溶性雜質(zhì),然后用10倍柱體積的70%乙醇進行洗脫,流速為2 mL/min,每250 mL收集一瓶,洗脫完成后合并洗脫液,減壓旋蒸濃縮,冷凍干燥,得黃色粉末,室溫下置于干燥器內(nèi)備用。

1.3數(shù)據(jù)分析處理

所有實驗重復(fù)3次,采用Design-Expert.8.05b、Origin 9.0 64位和SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行作圖和統(tǒng)計分析。

2　結(jié)果與討論

2.1單因素實驗結(jié)果

乙醇濃度對總黃酮得率和ORAC值的影響如圖1A所示,乙醇濃度為80%時總黃酮得率達(dá)到最大值,濃度小于80%時,得率隨乙醇濃度的增加而增大,濃度大于80%時得率反而降低;乙醇濃度小于70%時ORAC值隨濃度的增加而升高,在70%處達(dá)到最大值,70%～90%范圍內(nèi)反而降低,這是因為不同濃度乙醇極性不同,隨著乙醇濃度的增大脂溶性物質(zhì)溶出增多,使得黃酮化合物等有效成分溶出減少,活性降低,故選取70%作為響應(yīng)面實驗的一個中心點。

料液比對總黃酮得率和ORAC值的影響如圖1B所示,料液比從1∶5上升到1∶25的過程中,隨著料液比的增大,得率和ORAC值均明顯增大,1∶25之后,隨著料液比的繼續(xù)增大,兩者均增長緩慢,但能耗及成本會隨溶劑用量的增大而增加,這說明加大提取溶劑的用量只能在一定程度上提高得率和抗氧化活性,且考慮到生產(chǎn)成本及后期處理等因素,不宜過度增加提取溶劑的用量,故料液比選在1∶15～1∶35范圍內(nèi)。

提取時間對總黃酮得率和ORAC值的影響如圖1C所示,超聲時間從10 min延長至45 min的過程中,得率和ORAC值均有明顯的升高,在45 min時達(dá)到最大值,45 min后又均有呈下降趨勢,這可能是因為隨著時間的延長,黃酮化合物等活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞,故選取45 min作為響應(yīng)面的另一個中心點。

提取溫度對總黃酮得率和ORAC值的影響如圖1D所示,得率和ORAC值在50 ℃時達(dá)到最大值,50～80 ℃范圍內(nèi),隨著溫度的升高,得率和ORAC值呈明顯下降趨勢,這可能是因為高溫使溶劑粘度降低,分子運動加快,從而加快生物活性物質(zhì)的溶出,但溫度過高會使得熱敏性化合物降解為小分子化合物,導(dǎo)致得率和ORAC值降低。

圖1　不同提取條件對總黃酮得率和ORAC值的影響Fig.1　Effects of different extraction parameters on total flavonoid yield and ORAC values

2.2響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果分析

2.2.1總黃酮得率和ORAC的優(yōu)化結(jié)果根據(jù)實驗結(jié)果建立以下模型:

總黃酮得率(mg RT/g)Y1=+49.16-0.23A+0.51B+0.33C-0.38D+0.32AB+0.22AC-0.75AD-0.37BC-0.10BD-0.68CD-2.18A2-1.45B2-1.25C2-1.97D2

ORAC(μmol TE/g)Y2=+2848.83-36.96A+42.07B+2.91C-9.22D+0.56AB-102.80AC-58.72AD+5.81BC-14.49BD+14.70CD-235.88A2-98.97B2-151.84C2-318.20D2

式中:A為乙醇濃度(%),B為料液比(m/v),C為提取時間(min),D為提取溫度(℃)

由表3可知,總黃酮得率和ORAC模型的p值均小于0.0001,失擬項p值均大于0.05,表明這兩個模型均較顯著。通過對兩個模型的可信性分析,其決定系數(shù)R2分別為0.9444和0.9323,表明模型擬合度好;校正決定系數(shù)分別為0.8888和0.8647,說明有88.88%和86.47%的實驗點可分別由這兩個模型來解釋;精度分別為14.648和12.795,表明模型準(zhǔn)確度高,模型可靠。對于總黃酮得率模型來說,一次項B、C、D,交互項AD、CD和二次項A2、B2、C2、D2對其影響均顯著(p<0.05);而對于ORAC模型來說只有交互項AC和二次項A2、B2、C2、D2影響顯著(p<0.05)。

表2　超聲提取辣木葉黃酮的響應(yīng)面方案

圖2　乙醇濃度、料液比、提取時間和提取溫度對總黃酮得率(a～b)和ORAC值(c)的交互影響Fig.2　Interaction effects between ethanol concentration,solid/liquid ratio,time and temperature on thetotal flavonoid yield(a-b)and ORAC values(c)

2.2.2各因素對總黃酮得率和ORAC值的交互作用乙醇濃度和提取溫度對總黃酮得率有顯著的交互作用,如圖2a所示,當(dāng)乙醇濃度一定時,總黃酮得率隨提取溫度的升高先明顯上升,在50 ℃時達(dá)到最大值,從50 ℃上升至60 ℃的過程中又呈明顯降低趨勢,這可能是因為超聲溫度過高使黃酮化合物等有效成分的結(jié)構(gòu)遭到破壞,導(dǎo)致得率降低;當(dāng)提取溫度一定時,總黃酮得率隨乙醇濃度的增加呈先升高后降低的趨勢,這可能是因為不同濃度乙醇極性不同,乙醇濃度過高使其他脂溶性成分增多,影響黃酮化合物的有效溶出。

提取時間和提取溫度對總黃酮得率有顯著的交互作用,如圖2b所示,當(dāng)提取溫度一定時,總黃酮得率隨提取時間的延長先快速升高后有所降低,在48 min時達(dá)到最大值,這可能是因為延長超聲時間,黃酮化合物的結(jié)構(gòu)遭到破壞,使得得率降低;當(dāng)提取時間一定時,總黃酮得率隨提取溫度的升高先上升后下降,這說明在超聲輔助提取中合適的提取時間和溫度可提高總黃酮得率。

表3　辣木葉總黃酮得率和ORAC值回歸分析結(jié)果

乙醇濃度和提取時間對ORAC值有顯著的交互作用,如圖2c所示,乙醇濃度小于70%時,ORAC值隨提取時間的延長先明顯上升后略有下降,當(dāng)乙醇濃度大于70%時則隨時間延長先略有上升后明顯降低,這表明在超聲輔助提取過程中過度延長超聲時間可能會起反作用;當(dāng)提取時間一定時,ORAC值隨乙醇濃度的升高先增大后降低,在70%時達(dá)到最大值,這說明適當(dāng)增加乙醇濃度可促進黃酮化合物等有效成分溶出,提高其抗氧化性。

故過度增加乙醇濃度和用量,過度延長超聲時間、升高超聲溫度均不能提高得率和抗氧化活性。

2.2響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果分析

2.2.3最優(yōu)提取條件綜上分析,響應(yīng)面模型預(yù)測得出的最優(yōu)提取條件為:乙醇濃度69.45%,料液比1∶26.82,提取時間46.07 min,提取溫度49.48 ℃,此條件下總黃酮得率和ORAC值均達(dá)到最大值,分別為49.23 mg RT/g,2853.99 μmol TE/g。為驗證預(yù)測模型的可信性和準(zhǔn)確性,對預(yù)測模型的最優(yōu)條件進行驗證,并比較真實值和預(yù)測值的符合程度。結(jié)合實際可操作性,將最優(yōu)工藝條件修正為:乙醇濃度70%,料液比1∶27,提取時間46 min,提取溫度50 ℃,此條件下總黃酮得率和ORAC值分別為48.93±0.44 mg RT/g、2747.17±301.51 μmol TE/g,與預(yù)測值(49.23 mg RT/g,2853.99 μmol TE/g)的誤差為0.6%和3.7%。因此,采用響應(yīng)面法優(yōu)化辣木葉黃酮的提取工藝具有較好的可行性。

2.3最優(yōu)條件下粗提物及純化后黃酮的含量及其DPPH自由基和ABTS自由基清除能力的變化

最優(yōu)條件下超聲提取辣木葉黃酮,并取部分提取物過聚酰胺柱進行純化,測定其純化前后對DPPH和ABTS自由基的清除能力,以VC為陽性對照。

70%乙醇洗脫部位得率為17.44%,純化前后黃酮化合物的含量分別為21.90%和65.89%,氧自由基吸收能力(ORAC)分別為2747.17和5923.48 μmol TE/g,其對DPPH和ABTS自由基的清除能力如圖3所示,辣木葉黃酮對DPPH和ABTS自由基的清除能力隨濃度的增加而增大,呈劑量依賴性。純化前后黃酮濃度從0.05上升到0.5 mg/mL的時候,DPPH自由基清除率分別從5.35和8.47%上升到53.78和78.75%,當(dāng)樣品濃度為1 mg/mL的時候,其對DPPH自由基的清除率為85.93%和91.59%,略低于同濃度下VC的清除能力;ABTS自由基清除率分別從19.85%和32.25%上升到99.41%和99.73%,當(dāng)樣品濃度為0.5 mg/mL的時候,其對ABTS自由基的清除能力為99.41%和99.35%,與同濃度下VC的清除能力相當(dāng)。經(jīng)計算,其DPPH的EC50值分別為0.45 mg/mL和0.10 mg/mL,ABTS的EC50值分別為0.26 mg/mL和0.05 mg/mL。

圖3　辣木葉黃酮純化前后對DPPH和ABTS自由基的清除能力Fig.3　DPPH and ABTS radical scavenging activities of crude and purified flavonoids(n=3)

3　結(jié)論

采用Box-Behnken結(jié)合響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲輔助提取辣木葉黃酮,最佳提取條件為:超聲功率 300 W,乙醇濃度70%(v/v),料液比1∶27(m/v),提取時間46 min,提取溫度50 ℃,在此條件下,總黃酮得率為48.93±0.44 mg RT/g,ORAC值為2747.17±301.51 μmol TE/g,與預(yù)測值(49.23 mg RT/g,2853.99 μmol TE/g)的誤差為0.6%和3.7%,表明優(yōu)化超聲輔助提取辣木葉黃酮的提取工藝具有較好的可適用性。辣木葉黃酮粗提物具有很強的清除DPPH和ABTS自由基能力,其EC50值分別為0.45 mg/mL和0.10 mg/mL;聚酰胺樹脂純化后,其黃酮含量和ORAC分別為65.89%和5923.48 μmol TE/g,EC50值分別為0.26 mg/mL和0.05 mg/mL,表明聚酰胺樹脂能夠有效地提高辣木葉提取物的黃酮的含量和抗氧化性。

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Optimization of ultrasonic extraction of flavonoids fromMoringastenopetalaleaves and their antioxidant activities

YUE Xiu-Jie,LI Chao,FU Xiong*

(College of Light Industry and Food Sciences,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China)

Response surface methodology(RSM)was firstly used to optimize ultrasonic-assisted extraction(UAE)of total flavonoids fromMoringastenopetalaleaves. Based on the yield and oxygen radical absorbance capacity(ORAC)of flavonoids,the four single factors including ethanol concentration,solid-liquid ratio,ultrasonic time and temperature were optimized. The optimal conditions were enthanol concentration 70%(v/v),solid-liquid ratio 1∶27(m/v),ultrasonic time 46 min,and temperature 50 ℃. Under the condition,the yield and ORAC value were 48.93±0.44 mg rutin equivalent(RE)/g and 2747.17±301.51 μmol trolox equivalents(TE)/g,respectively,which had no significant differences with the predicted values(49.23 mg RT/g,2853.99μmol TE/g). The crude extract was then purified by polyamide resin,the flavonoids content and ORAC value increased to 65.89% and 5923.48±228.65 μmol TE/g. The crude and purified extracts showed strong DPPH and ABTS radical scavenging activities. The EC50 values of crude extract were 0.45 mg/mL and 0.10 mg/mL and the EC50 values of purified extract were 0.26 mg/mL and 0.05 mg/mL. These results demonstrated that UAE is a highly effective way to extract flavonoids fromMoringastenopetalaleaves and the polyamide resin could significantly increase flavonoids content and antioxidant activity of flavonoids extract.

Moringastenopetalaleaves;Flavonoids;Ultrasonic-assisted extraction;Antioxidant activities

2015-04-13

岳秀潔(1990-),女,碩士研究生,研究方向:功能碳水化合物,E-mail:yxj67814@163.com。

扶雄(1971-),男,博士,教授,研究方向:功能碳水化合物,E-mail:lfxfu@scut.edu.cn。

廣州市科技計劃項目(2013J4500036);廣東省科技計劃項目(2012B050500003)。

TS

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000