一株產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶絲狀真菌的發(fā)酵條件優(yōu)化研究

應(yīng)聰萍,王　瑤,李永成

(海南大學(xué)食品學(xué)院,海南?？?570228)

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一株產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶絲狀真菌的發(fā)酵條件優(yōu)化研究

應(yīng)聰萍,王瑤,李永成*

(海南大學(xué)食品學(xué)院,海南海口 570228)

針對(duì)已篩選出的一株能生產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶(CDA)的海洋絲狀真菌,考察其最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件。通過(guò)單因素與正交實(shí)驗(yàn)得出該菌的最佳產(chǎn)酶條件為:初始pH為6.0,發(fā)酵溫度為30 ℃,發(fā)酵時(shí)間為108 h,葡萄糖濃度7 g/L,酵母浸膏濃度7 g/L,氯化鈣濃度0.75 g/L,幾丁質(zhì)濃度1.25 g/L,NaCl濃度為1.4%。通過(guò)酶活的測(cè)定,發(fā)現(xiàn)該絲狀真菌合成的幾丁質(zhì)脫乙酰酶主要是胞外酶。在最佳發(fā)酵條件下該絲狀真菌的最高CDA胞外酶活為21.37 U/mL。是一株具有開(kāi)發(fā)潛力的幾丁質(zhì)脫乙酰酶生產(chǎn)菌株。

幾丁質(zhì),殼聚糖,幾丁質(zhì)脫乙酰酶

殼聚糖(chitosan)是一種比較特殊的可食性動(dòng)物纖維,含有游離氨基堿性陽(yáng)離子[1],大多通過(guò)蝦、蟹外殼中的幾丁質(zhì)脫乙酰而制備[2]。殼聚糖在1985年被Rouget發(fā)現(xiàn)并提取出來(lái),至今,這類天然高分子由于其優(yōu)良的性能如抑菌性、保濕性、吸附性等被各行各業(yè)廣泛關(guān)注,在食品、化工、醫(yī)藥、化妝用品等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用[3]。此外,在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB-2760中,殼聚糖因具有增稠、被膜功能而被作為食品添加劑[4]。在2014年6月,新的殼聚糖的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)正式實(shí)施。我們可以從GB 29941-2013中看到殼聚糖在我們的日常生活中應(yīng)用越來(lái)越多[5]。

目前制備殼聚糖的方法有兩大類。一類是化學(xué)法,采用濃堿熱解脫去幾丁質(zhì)中的乙?；?此法是工業(yè)上比較完善的方法,但該法會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的環(huán)境污染問(wèn)題[6]。另一類是生物法,這類方法包括幾丁質(zhì)脫乙酰酶法、微生物培養(yǎng)法、發(fā)酵工廠廢菌體生產(chǎn)法等[7]。通過(guò)幾丁質(zhì)脫乙酰酶水解幾丁質(zhì)生產(chǎn)殼聚糖,在實(shí)驗(yàn)程度上已有一定成果[8]。盡管該法克服了環(huán)境污染問(wèn)題,但由于脫乙酰酶法活性不高,現(xiàn)階段還不能進(jìn)行工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。因此,通過(guò)尋覓新菌種或選用基因工程、誘變育種[9-10]等手段獲取具有穩(wěn)定遺傳性狀的產(chǎn)高活性幾丁質(zhì)脫乙酰酶的工程菌將成為重要研究方向。

目前,以海洋絲狀真菌為來(lái)源研究幾丁質(zhì)脫乙酰酶的不多[11],而海洋微生物來(lái)源的幾丁質(zhì)脫乙酰酶具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)如耐高鹽度等[12-13],實(shí)驗(yàn)選用海邊紅樹(shù)林土壤中篩選出的一株絲狀真菌,通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)獲得其最佳發(fā)酵條件,提升該菌株的產(chǎn)酶能力和酶活,并為今后幾丁質(zhì)脫乙酰酶法制備殼聚糖的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

菌種:海洋絲狀真菌,從?？跂|寨港紅樹(shù)林的土壤中篩選出來(lái),4 ℃保藏于實(shí)驗(yàn)室冰箱中。

斜面培養(yǎng)基:馬鈴薯300 g,葡萄糖20 g,瓊脂15 g,氯霉素0.1 g,最終pH6.0±0.2,定容至1 L,121 ℃高溫滅菌 16 min。

種子培養(yǎng)基:酵母浸膏5.0 g,葡萄糖2.5 g,硫酸銨4.0 g,磷酸二氫鉀1.5 g,膠體幾丁質(zhì)1.25 g,NaCl 1.0%,初始pH6.0,定容至1 L,121 ℃高溫滅菌16 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母浸膏5.0 g,葡萄糖2.5 g,硫酸銨4.0 g,磷酸二氫鉀1.5 g,膠體幾丁質(zhì)1.25 g,NaCl 1.4%,初始pH6.0,定容至1 L,121 ℃高溫滅菌16 min。

實(shí)驗(yàn)設(shè)備:T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、JB-CJ-1FX超凈工作臺(tái)、LRH-250A生化培養(yǎng)箱、TGL-16M離心機(jī)、GM-1.0A隔膜真空泵、PHS-3C pH計(jì)、HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋、HZQ-X300C恒溫振蕩器、Fuhe 85-1恒溫磁力攪拌器。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌種的活化將4 ℃保藏的絲狀真菌劃線接種于PDA斜面培養(yǎng)基中,30 ℃恒溫培養(yǎng)5 d,使菌種活化。

1.2.2培養(yǎng)方法

1.2.2.1種子培養(yǎng)方法挑取一塊長(zhǎng)勢(shì)良好的菌種斜面(0.5 cm×0.5 cm),接種于種子液培養(yǎng)基中,在30 ℃、180 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)60～72 h。

1.2.2.2發(fā)酵培養(yǎng)方法以1 mL/50 mL的比例將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為50 mL/250 mL,在30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)108 h,進(jìn)行幾丁質(zhì)脫乙酰酶的酶活測(cè)定。

1.2.3培養(yǎng)條件的確定

1.2.3.1發(fā)酵培養(yǎng)基成分影響具體實(shí)驗(yàn)參數(shù)見(jiàn)1.1中發(fā)酵培養(yǎng)基的配方,培養(yǎng)方案見(jiàn)1.2.2.2,其他實(shí)驗(yàn)條件如下。

碳源種類:發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源分別為葡萄糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖。

碳源濃度:碳源濃度分別定為0,1,2.5,4,6.5,8 g/L。

氮源種類:發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源分別為牛肉浸膏、酵母浸膏、蛋白胨、氯化銨、硫酸銨。

氮源濃度:氮源濃度分別定為2.5,5,7.5,10,12.5 g/L。

無(wú)機(jī)鹽種類:發(fā)酵培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽分別為硫酸鎂、七水合硫酸亞鐵、硫酸銅、氯化鈣、七水合硫酸鋅、磷酸二氫鉀。

無(wú)機(jī)鹽濃度:無(wú)機(jī)鹽濃度分別定為0,0.75,1.5,2.25,3 g/L。

膠體幾丁質(zhì)添加量:膠體幾丁質(zhì)濃度分別定為0,1,1.25,2,3,4 g/L。

滲透壓:氯化鈉濃度分別定為0.8%,1%,1.2%,1.4%,1.6%進(jìn)行滲透壓的研究。

1.2.3.2發(fā)酵條件的影響發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為葡萄糖濃度7 g/L,酵母浸膏濃度7 g/L,氯化鈣濃度0.75 g/L,幾丁質(zhì)濃度1.25 g/L,NaCl 1.4%。,培養(yǎng)方案見(jiàn)1.2.2.2,其他實(shí)驗(yàn)條件如下。

pH:初始pH分別定為5.00,5.50,6.00,6.50,7.00。

培養(yǎng)溫度:培養(yǎng)溫度分別定為24,26,28,30,33,35 ℃。

1.2.4幾丁質(zhì)脫乙酰酶(CDA)酶活測(cè)定方法

1.2.4.1CDA酶液的提取將發(fā)酵液在4 ℃、3000 r/min條件下離心10 min,上層清液即為胞外酶提取液;將菌絲體低溫抽濾,稱重,加入預(yù)冷0.05 mol/L pH7.0磷酸鹽緩沖液和石英砂,在低溫環(huán)境中碾磨,漿液立即進(jìn)行4 ℃、3000 r/min、10 min條件的離心,所得上清液即為胞內(nèi)酶提取液[14]。

1.2.4.2酶活的測(cè)定方法測(cè)定酶活的原理為:以對(duì)硝基乙酰苯胺為底物,CDA可脫除對(duì)硝基乙酰苯胺的乙酰基生成對(duì)硝基苯胺,對(duì)硝基苯胺在400 nm處有最大吸收峰。通過(guò)測(cè)定產(chǎn)物溶液在400 nm處的吸光值,來(lái)反映CDA的酶活值。

具體測(cè)定方法為:10 mL具塞試管中加入1 mL 200 mg/L的對(duì)硝基乙酰苯胺溶液、3 mL 0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖液,50 ℃水浴3 min,加入1 mL酶液,50 ℃水浴15 min,沸水浴終止酶促反應(yīng),加水定容至10 mL,若出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象,在3000 r/min條件下離心10 min,在400 nm處測(cè)定吸光值。空白對(duì)照組添加1 mL滅活酶液,其余同上。在該反應(yīng)條件下每小時(shí)產(chǎn)生1 μg對(duì)硝基苯胺所需要的酶量定義為1個(gè)酶活力單位(U/mL)[14]。

1.2.5培養(yǎng)基組分因素水平的確定選取碳源濃度(A)、氮源濃度(B)、無(wú)機(jī)鹽濃度(C)、幾丁質(zhì)濃度(D)4個(gè)因素,每個(gè)因素均在合理范圍內(nèi)取3個(gè)值進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)研究,具體詳見(jiàn)表1。

表1　因素水平表

2　結(jié)果與分析

2.1絲狀真菌的生長(zhǎng)曲線

生長(zhǎng)曲線可以反映液體培養(yǎng)基中微生物群體的生長(zhǎng)狀況[15]。實(shí)驗(yàn)表明,該菌株0～12 h為延滯期,12～60 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,60 h以后進(jìn)入穩(wěn)定期。一般情況下,種子液處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)活力最強(qiáng),故實(shí)驗(yàn)選擇培養(yǎng)60 h的種子液進(jìn)行接種,具體見(jiàn)圖1。

表2　胞內(nèi)酶活和胞外酶活對(duì)比表

圖1　真菌生長(zhǎng)曲線Fig.1　Growth curve of fungus

注:培養(yǎng)條件:酵母浸膏5.0 g/L,硫酸銨4.0 g/L,磷酸二氫鉀1.5 g/L,膠體幾丁質(zhì)1.25 g/L,NaCl 1.0%,葡萄糖濃度見(jiàn)表1,初始pH6.0,在30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)108 h。

2.2胞內(nèi)酶活和胞外酶活對(duì)比

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),菌株的胞內(nèi)酶活遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于胞外酶活,即菌株所產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶主要為胞外酶。因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)均只進(jìn)行胞外酶活的測(cè)定。

2.3酶合成過(guò)程曲線

酶合成隨培養(yǎng)時(shí)間變化情況如圖2所示。發(fā)酵液中酶活于108 h達(dá)到最大值20.82 U/mL,此時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)處于穩(wěn)定期。在0～108 h之間酶活逐步增長(zhǎng),108 h之后酶活開(kāi)始下降。分析酶活值下降的原因,主要是隨著細(xì)胞衰老,新陳代謝效率降低所致[16]。超過(guò)這個(gè)時(shí)間段不再生產(chǎn)或少量生產(chǎn)該酶,隨時(shí)間增長(zhǎng),發(fā)酵液中酶濃度不斷下降,在一定程度上影響酶活的大小[16]。因此,收獲酶的最佳時(shí)間為108 h。

圖2　CDA酶合成過(guò)程曲線Fig.2　The synthesis curve of CDA

2.4發(fā)酵培養(yǎng)基成分對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.4.1碳源種類的影響不同菌種所產(chǎn)生的胞外酶不同,故對(duì)不同種類碳源的吸收利用亦不相同。實(shí)驗(yàn)采用5種碳源進(jìn)行實(shí)驗(yàn),表3為絲狀真菌利用幾種常見(jiàn)碳源產(chǎn)CDA酶的情況。在單因素條件下,以葡萄糖作為碳源發(fā)酵時(shí)酶活最高,為12.42 U/mL,蔗糖和可溶性淀粉次之,乳糖作為碳源時(shí)酶活最差。說(shuō)明葡萄糖是菌株產(chǎn)酶的最合適碳源。

2.4.2碳源濃度的影響葡萄糖濃度為零時(shí),只有膠體幾丁質(zhì)為碳源來(lái)源,酶活因細(xì)胞饑餓而成倍增加,酶活較高,為13.15 U/mL。根據(jù)碳分解代謝物阻遏(carbon catabolite repression,CCR)效應(yīng)[17],當(dāng)供應(yīng)低劑量葡萄糖時(shí),它能阻遏或者關(guān)閉用于其它碳源代謝的基因[18],酶活一定程度下降。在葡萄糖濃度為6.5 g/L時(shí),細(xì)胞生長(zhǎng)與葡萄糖效應(yīng)達(dá)到一個(gè)最佳平衡,酶活達(dá)到最高,為14.61 U/mL,超過(guò)6.5 g/L濃度后酶活呈下降趨勢(shì)。因此,葡萄糖在低濃度下影響細(xì)胞生長(zhǎng),在高濃度下,則存在葡萄糖效應(yīng)達(dá),二者均影響CDA的合成。實(shí)驗(yàn)表明,葡萄糖最佳濃度為6.5 g/L,其CDA活性最高。

表3　不同碳源對(duì)胞外酶活和細(xì)胞濕重的影響

圖3　葡萄糖濃度對(duì)胞外酶活的影響Fig.3　Effect of glucose concentration on extracellular enzyme activity

2.4.3氮源種類的影響實(shí)驗(yàn)表明,相同培養(yǎng)條件下,由于有機(jī)氮源營(yíng)養(yǎng)豐富,直接含有少量的游離氨基酸和生長(zhǎng)因子[10],有利于菌體的生長(zhǎng),酶活明顯優(yōu)于無(wú)機(jī)氮源。由表4可以看出,酵母浸膏作為氮源時(shí)酶活最高,為17.72 U/mL,牛肉膏次之,無(wú)機(jī)氮源不利于菌體產(chǎn)酶。因此,最適合菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的氮源是酵母浸膏。

2.4.4氮源濃度的影響圖4表明,隨著酵母浸膏濃度的增加,酶活呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì),當(dāng)濃度達(dá)到10 g/L,酶活趨于平穩(wěn)。隨著酵母浸膏濃度增加,酶活趨于飽和。故酵母浸膏濃度為10 g/L時(shí)最佳。

圖4　酵母浸膏濃度對(duì)胞外酶活的影響Fig.4　Effect of yeast extract concentrationon on extracellular enzyme activity

2.4.5無(wú)機(jī)鹽種類的影響無(wú)機(jī)鹽的除了提供除碳、氮以外的各類重要元素外,對(duì)微生物菌體的生長(zhǎng)、酶的生成、酶活性的激活等有重要影響。實(shí)驗(yàn)表明,在相同培養(yǎng)條件下,鈣離子對(duì)酶活的影響程度最高,酶活為14.61 U/mL。詳見(jiàn)表5。

表4　不同氮源對(duì)胞外酶活和細(xì)胞濕重的影響

表5　不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)胞外酶活和細(xì)胞濕重的影響

2.4.6無(wú)機(jī)鹽濃度的影響圖5表明,隨著氯化鈣濃度的增加,該絲狀真菌的酶活開(kāi)始增加較為迅速,到濃度為0.75 g/L以后,酶活出現(xiàn)緩慢下降,酶活最高可達(dá)14.61 U/mL,故氯化鈣濃度為0.75 g/L時(shí)最佳。

圖5　氯化鈣濃度對(duì)胞外酶活的影響Fig.5　Effect of CaCl2 concentration on extracellular enzyme activity

2.4.7幾丁質(zhì)濃度的影響幾丁質(zhì)脫乙酰酶是誘導(dǎo)酶[1],因此幾丁質(zhì)作為幾丁質(zhì)脫乙酰酶的作用底物,在培養(yǎng)基中添加一定量的膠體幾丁質(zhì)將有利于幾丁質(zhì)脫乙酰酶的合成。圖6表明,隨著幾丁質(zhì)濃度的增加,菌株的酶活開(kāi)始增加較為迅速,到濃度為1.25 g/L以后,酶活趨于平穩(wěn),隨后變化幅度不大,趨于飽和,最佳酶活達(dá)12.42 U/mL。結(jié)果表明,幾丁質(zhì)最佳添加量為1.25 g/L。

圖6　幾丁質(zhì)濃度對(duì)胞外酶活的影響Fig.6　Effect of chitin concentration on extracellular enzyme activity

2.4.8滲透壓的影響滲透壓對(duì)真菌細(xì)胞生命活動(dòng)的進(jìn)行有較大的影響。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)NaCl來(lái)改變培養(yǎng)基的滲透壓。由于該絲狀真菌是從?？跂|寨港紅樹(shù)林的土里篩選出來(lái)的海洋微生物,實(shí)驗(yàn)表明,制作培養(yǎng)基時(shí)選用NaCl濃度為1.4%為佳。詳見(jiàn)圖7。

圖7　不同氯化鈉濃度對(duì)胞外酶活的影響Fig.7　Effect of NaCl concentration on extracellular enzyme activity

2.5發(fā)酵培養(yǎng)基成分正交實(shí)驗(yàn)

四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如表6所示。

根據(jù)極差Rj的大小,可以判斷各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的影響力程度。由RD>RC>RB>RA可得出D因素影響力最大,即幾丁質(zhì)濃度這個(gè)因素影響最大。其次是氯化鈣濃度和酵母浸膏濃度,而葡萄糖濃度的影響較小。

根據(jù)極差分析,可得出A3B1C2D2為本實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)水平組合,即發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳成分組合為葡萄糖濃度7 g/L,酵母浸膏濃度7 g/L,氯化鈣濃度0.75 g/L,幾丁質(zhì)濃度1.25 g/L。

2.6培養(yǎng)條件對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.6.1起始pH的影響培養(yǎng)基的pH大小會(huì)影響細(xì)胞膜所帶的電荷,從而影響細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收,或直接影響酶的活性,進(jìn)而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和繁殖,所以在發(fā)酵過(guò)程中需要維持一定的pH以維持微生物的正常代謝[19]。圖8表明,菌株在pH為6.0時(shí),CDA酶活達(dá)到最高值16.07 U/mL,pH在5.0～6.0之間時(shí)酶活迅速上升,超過(guò)6.0之后,酶活開(kāi)始下降。分析原因,pH大于6.0時(shí)不適合CDA酶促反應(yīng)的發(fā)生,酶的穩(wěn)定性下降[10]。發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)最適pH為6.0。

表6　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果極差分析

圖8　起始pH對(duì)胞外酶活的影響Fig.8　Effect of initial pH on extracellular enzyme activity

2.6.2發(fā)酵溫度的影響培養(yǎng)溫度能夠顯著影響微生物的生長(zhǎng)速率和代謝途徑,不適宜的培養(yǎng)溫度會(huì)影響生物體內(nèi)的活性,從而影響酶的合成[20]。圖9表明,在30 ℃時(shí),幾丁質(zhì)脫乙酰酶酶活達(dá)到最高,為17.53 U/mL,發(fā)酵溫度選擇30 ℃時(shí)最佳。

圖9　發(fā)酵溫度對(duì)胞外酶活的影響Fig.9　Effect of fermentation temperature on extracellular enzyme activity

2.7條件優(yōu)化后的發(fā)酵進(jìn)程

在各項(xiàng)條件進(jìn)行優(yōu)化后,選取最佳組合對(duì)該絲狀真菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),得到結(jié)果如圖10,即最高酶活為21.37 U/mL,此時(shí)細(xì)胞濕重為30.92 g/L。

圖10　條件優(yōu)化后的發(fā)酵進(jìn)程Fig.10　The fermentation processafter optimization of conditions

3　小結(jié)與討論

通過(guò)生長(zhǎng)曲線的繪制、發(fā)酵培養(yǎng)基成分單因素實(shí)驗(yàn)、發(fā)酵培養(yǎng)基成分正交實(shí)驗(yàn)、培養(yǎng)條件單因素實(shí)驗(yàn),考察各因素對(duì)幾丁質(zhì)脫乙酰酶活性的影響,最終得出該絲狀真菌的最佳發(fā)酵條件:NaCl濃度為1.4%、葡萄糖濃度7 g/L、酵母浸膏濃度7 g/L、氯化鈣濃度0.75 g/L、幾丁質(zhì)濃度1.25 g/L、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH6.00,發(fā)酵溫度為30 ℃,最佳產(chǎn)酶時(shí)間為108 h。在此發(fā)酵條件下菌株所產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶的最高胞外酶活值為21.37 U/mL。

幾丁質(zhì)脫乙酰酶作為一種清潔的轉(zhuǎn)化殼聚糖的工具,具有非常廣闊的前景,但目前尚未脫離實(shí)驗(yàn)室投入生產(chǎn)。實(shí)驗(yàn)對(duì)一株能產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶絲狀真菌的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化研究,得出該菌的最佳培養(yǎng)條件,但是,本課題還存在亟待思考的問(wèn)題。

其一,天然存在的幾丁質(zhì)并非幾丁質(zhì)脫乙酰酶的良好底物,需要使用濃鹽酸將其溶解,才能保證其與酶良好接觸進(jìn)行反應(yīng)。強(qiáng)酸的應(yīng)用違背幾丁質(zhì)脫乙酰酶法制備殼聚糖防止污染的理念,如何使天然幾丁質(zhì)更容易與酶結(jié)合是一個(gè)問(wèn)題。

其二,與眾多參考文獻(xiàn)比較,該絲狀真菌的產(chǎn)酶能力在篩選出的天然菌株中處于中上水平,與經(jīng)誘變等處理后的菌株相比還有很大差距,故筆者認(rèn)為采用基因工程、誘變育種等手段進(jìn)一步提升該菌種的產(chǎn)酶能力可作為下一步的研究方向。

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Optimization of fermentation conditions of a strain of filamentous fungus producing chitin deacetylase

YING Cong-ping,WANG Yao,LI Yong-cheng*

(College of Food Science and Technology,Hainan University,Haikou 570228,China)

The optimum media composition and fermentation conditions were studied for chitin deacetylase(CDA)production by a screened marine filamentous fungus. Using single factor method and orthogonal experiment in test,the best culture conditions of enzyme was obtained as followings:cultured for 108 h at pH 6.0,and 30 ℃,,the media consist of glucose 7 g/L,yeast extract 7 g/L,CaCl20.75 g/L,chitin 1.25 g/L and NaCl 1.4%. Moreover,after the determination of enzyme activity,it was found that the marine filamentous fungus mainly produced extracellular enzyme. Under this condition of the fermentation,the highest chitin deacetylase activity reached 21.37 U/mL. In general,it was a chitin deacetylase producing strain that had the potential to carry out research further.

Chitin;chitosan;chitin deacetylase

2015-05-19

李永成(1964-)，男，博士，副教授，研究方向：生物化工，E-mail:lyc2360@sina.com。

應(yīng)聰萍(1993-)，女，本科，研究方向：食品質(zhì)量與安全，E-mail:yingcongping2327@163.com。

十二五國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)(2012BAD2B06)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000