不同來源內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)性狀的比較

許慧芳，王俊力，邱昕，萬小林，陳國(guó)華

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·論著·

不同來源內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)性狀的比較

許慧芳，王俊力，邱昕，萬小林，陳國(guó)華

目的：比較大鼠胸主動(dòng)脈來源的成熟內(nèi)皮細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）來源的內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)性狀及各自Akt表達(dá)的情況。方法：分離培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈來源內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)MSCs分化為內(nèi)皮細(xì)胞，對(duì)2組細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、增殖能力、成管能力進(jìn)行比較，通過Western blotting比較其表面標(biāo)記表達(dá)情況及Akt表達(dá)情況。結(jié)果：MSCs來源的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)與成熟內(nèi)皮細(xì)胞不盡相同，增殖能力和成管能力均強(qiáng)于后者。2組細(xì)胞均可表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞的表面標(biāo)記，但成熟內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)于分化而來的內(nèi)皮細(xì)胞（P<0.05）。Akt表達(dá)在分化而來的內(nèi)皮細(xì)胞明顯高于成熟內(nèi)皮細(xì)胞（P<0.05）。結(jié)論：MSCs分化而來的內(nèi)皮細(xì)胞和成熟內(nèi)皮細(xì)胞存在生物學(xué)性狀和Akt表達(dá)差異。

內(nèi)皮細(xì)胞；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；Akt

內(nèi)皮損傷所致的內(nèi)皮功能失調(diào)是動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)因素，血管受損部位內(nèi)皮化推遲及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、平滑肌細(xì)胞遷移和過度增殖可促進(jìn)血栓形成及新內(nèi)膜增生，導(dǎo)致靶血管狹窄發(fā)生[1]，快速再內(nèi)皮化對(duì)于恢復(fù)正常血管功能和調(diào)節(jié)新生血管內(nèi)膜增生有至關(guān)重要的作用。成熟內(nèi)皮細(xì)胞在損傷區(qū)域的再生緩慢，大多數(shù)情況下，新生的內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、再排序是一個(gè)不完整的過程[2]。近年來有很多研究聚焦于內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）[3]和干細(xì)胞來源內(nèi)皮細(xì)胞，證實(shí)兩者對(duì)于血管再生和再內(nèi)皮化的作用，這提示干細(xì)胞來源的前體細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞可能是移植修復(fù)內(nèi)皮損傷的突破口。Akt又稱作蛋白激酶B（proteinkinase B，PKB）[4]，是PI3K重要的下游分子，其中Akt1促進(jìn)細(xì)胞存活和增殖，可能在促進(jìn)受損動(dòng)脈快速再內(nèi)皮化中起重要作用。本研究探討成熟內(nèi)皮細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）分化的內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)性狀的差異，以及各自Akt表達(dá)的不同。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物 健康SD大鼠，雌雄不限，體質(zhì)量200～250 g，由同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。1.1.2主要試劑與儀器 DMEM/F12（購(gòu)于美國(guó)Hyclon公司）；胎牛血清、胰蛋白酶-EDTA消化液、膠原酶Ⅰ（購(gòu)于美國(guó)Gibco公司）；重組大鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（recombinant vascular endothelial growth factor，rVEGF，購(gòu)于以色列Prospec公司）；小鼠抗血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（kinase insert domain receptor，KDR）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelialnitric oxide synthase，Enos）、磷酸化Akt（P-Akt）抗體及羊抗小鼠IgG二抗（購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司）；基質(zhì)膠（購(gòu)于美國(guó)BD公司）。

1.2方法

1.2.1大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)及傳代和免疫熒光鑒定 大鼠頸部脫臼處死，消毒。無菌操作環(huán)境中剪開大鼠胸骨，取約2 cm左右的胸主動(dòng)脈，去除外膜及脂肪組織。在培養(yǎng)基中將手術(shù)線穿過動(dòng)脈管并封住血管的兩端，加入適量膠原酶Ⅰ，在37℃、5%CO2環(huán)境中消化約30 min。加入胎牛血清終止消化，去除兩端，將血管剪成3～4個(gè)1×1 mm2大小的組織塊分別放入六孔培養(yǎng)板中，加入培養(yǎng)液（90%DEME/F12+10%FBS）培養(yǎng)約3 d。更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)直至細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿底部，消化并按1∶3傳代培養(yǎng)。傳代前以血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞總數(shù)。免疫熒光鑒定：在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3 min；用4%的多聚甲醛固定爬片15 min，PBS浸洗玻片3次，每次3 min；PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min；吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗（VWF）并放入濕盒，4℃孵育過夜；加熒光二抗：PBST浸洗爬片滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中孵育1 h，PBST浸洗切片；復(fù)染核：滴加DAPI避光孵育5 min，PBST 5 min×4次洗去多余的DAPI；封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.2.2大鼠MSCs培養(yǎng) 大鼠脫臼處死，消毒。在無菌環(huán)境下取大鼠的脛骨和股骨，用5 mL注射器吸取適量DEME/F12沖出骨髓，去除大的雜質(zhì)后倒入離心管，1 000 r/min離心5 min，棄上清，吸取培養(yǎng)基進(jìn)行吹打懸浮后分瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)基為90%DEME+10%FBS。待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后傳代。

1.2.3MSCs誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細(xì)胞 取第 2～3代MSCs，待其長(zhǎng)至瓶底80%時(shí)開始加入誘導(dǎo)液（97% DMEM/F12+3%胎牛血清+VEGF 50 μg/mL）進(jìn)行誘導(dǎo)。每隔2 d進(jìn)行誘導(dǎo)換液，第13天停止誘導(dǎo)，加90% DMEM/F12，10%胎牛血清培養(yǎng)液進(jìn)行正常培養(yǎng)，按1∶3比例進(jìn)行傳代。傳代前以血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞總數(shù)。按如上所述免疫熒光鑒定其表面標(biāo)志。

1.2.4內(nèi)皮細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn) 取基質(zhì)膠和24孔培養(yǎng)板，放入冰塊上中待用，吸取約30 μL基底膠在24孔板上鋪膠。取培養(yǎng)中的成熟內(nèi)皮細(xì)胞和新分化內(nèi)皮細(xì)胞，倒掉廢液，加入PBS緩沖液清洗細(xì)胞，去除雜質(zhì)。吸出緩沖液，加入適量胰蛋白酶，在顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞由扁平逐漸變成圓形時(shí)加入含胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化。將消化好的細(xì)胞溶液移至離心管中，1 000 r/min離心5 min。棄上清，重新懸浮細(xì)胞。取適量細(xì)胞液加入基質(zhì)膠包被的24孔板中，加入適量培養(yǎng)液。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。自2 h開始，每隔0.5 h在顯微鏡下觀察成管情況，并拍照。

1.2.5Western blotting檢測(cè) 提取成熟內(nèi)皮細(xì)胞、新分化內(nèi)皮細(xì)胞、MSCs 3組細(xì)胞的總蛋白，測(cè)蛋白濃度后，各樣品取50 μg總蛋白上樣電泳，根據(jù)蛋白分子量配制6%的PAGE膠電泳。根據(jù)預(yù)染Marker顯示，判斷目的蛋白得到充分分離后，停止電泳。常規(guī)轉(zhuǎn)膜，用含5%脫脂奶粉的TBST（封閉液）浸泡PVDF膜，室溫?fù)u床封閉2 h。用封閉液稀釋相應(yīng)的一抗，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育過夜。TBST充分洗滌PVDF 膜5～6次，5 min/次。用封閉液稀釋相應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗1∶50 000稀釋，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，室溫?fù)u床孵育2 h。顯色曝光：TBST充分洗滌PVDF膜5～6次，5 min/次。每張膜滴加適量的ECL底物液，孵育數(shù)分鐘。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量結(jié)果以（M±s）表示，t檢驗(yàn)，方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

MSCs生長(zhǎng)情況：原代細(xì)胞接種后，細(xì)胞較多較雜，培養(yǎng)液外觀渾濁，經(jīng)過數(shù)次換液后，混雜細(xì)胞逐漸去除，可見培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)梭貼壁細(xì)胞，后期隨著細(xì)胞數(shù)目增多，細(xì)胞呈輻射狀排列生長(zhǎng)。傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)增快，24 h完全貼壁，一般7 d左右可在瓶底完全長(zhǎng)滿融合，見圖1A。內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)情況：原代內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)3 d左右，組織塊周圍開始出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞，14 d左右細(xì)胞融合成片，形態(tài)一致，大小均勻，邊界清晰，呈典型的“鋪路石樣”鑲嵌排列生長(zhǎng)，vWF表達(dá)陽性，見圖1B、D。誘導(dǎo)分化的內(nèi)皮細(xì)胞：誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液中生長(zhǎng)的MSCs，生長(zhǎng)旺盛，13 d時(shí)觀察細(xì)胞，形態(tài)學(xué)介于干細(xì)胞和成熟內(nèi)皮細(xì)胞之間，梭形生長(zhǎng)，有“鋪路石樣”改變趨勢(shì)，vWF表達(dá)陽性，見圖1C、E。

圖1　細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

2.2細(xì)胞增殖情況

成熟內(nèi)皮細(xì)胞自第2代開始，細(xì)胞增殖到（5～8）× 106個(gè)細(xì)胞的時(shí)間，大約為5～6 d，平均（5.7±0.40）d （n=6）；新分化內(nèi)皮細(xì)胞傳代后計(jì)算增殖情況，至（5～8）×106個(gè)細(xì)胞大約4～5 d，平均（4.4±0.37）d（n=6）；成熟內(nèi)皮細(xì)胞增殖速度低于新分化內(nèi)皮細(xì)胞，有顯著性差異（t=5.782，P<0.001）。

2.3成管實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在基質(zhì)膠包被的培養(yǎng)板上，成熟內(nèi)皮細(xì)胞大約6 h可形成管腔樣結(jié)構(gòu)并連接成網(wǎng)狀，見圖2A。新分化內(nèi)皮細(xì)胞需要4 h左右，成管分支更多且粗大，見圖2B。

圖2　內(nèi)皮細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)

2.4Western blotting檢測(cè)結(jié)果

內(nèi)皮細(xì)胞及新分化的內(nèi)皮細(xì)胞均可表達(dá)特異性表面標(biāo)記Vwf、KDR、eNOS，MSCs幾乎不表達(dá)（少量表達(dá)eNOS）；與細(xì)胞增殖成長(zhǎng)相關(guān)的Akt表達(dá)，則是MSCs>新分化內(nèi)皮細(xì)胞>成熟內(nèi)皮細(xì)胞，見圖3、表1，提示相對(duì)成熟內(nèi)皮細(xì)胞，新分化內(nèi)皮細(xì)胞的Akt有更高的表達(dá)。

表1　3種細(xì)胞表達(dá)Vwf、KDR、eNOS、P-Akt比較（M±s）

圖3　細(xì)胞表面標(biāo)記表達(dá)檢測(cè)

3　討論

血管內(nèi)膜受損后快速修復(fù)，對(duì)于預(yù)防和治療頸動(dòng)脈粥樣硬化性狹窄和頸動(dòng)脈支架成形術(shù)術(shù)后再狹窄，是關(guān)鍵的一步，對(duì)于腦卒中預(yù)防意義重大[5]。長(zhǎng)期以來人們一直認(rèn)為成熟內(nèi)皮細(xì)胞的增殖遷移能力極其有限，并不適合用于移植，因而內(nèi)皮細(xì)胞直接移植修復(fù)血管內(nèi)膜的研究也鮮有報(bào)道。EPCs是內(nèi)皮細(xì)胞的前體。眾多體內(nèi)和體外試驗(yàn)均證實(shí)EPCs對(duì)于血管再生和再內(nèi)皮化的作用，但EPCs特異性表面標(biāo)志目前尚缺乏統(tǒng)一的意見。本研究表明，新分化的內(nèi)皮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上與成熟內(nèi)皮細(xì)胞存在差異，但可表達(dá)公認(rèn)的內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)記，雖然表達(dá)強(qiáng)度與成熟內(nèi)皮細(xì)胞相比略弱?？梢砸源双@得成分單一，性質(zhì)穩(wěn)定的內(nèi)皮細(xì)胞，且具有更好的增殖和成管能力。

Akt是PI3K重要的下游分子，目前發(fā)現(xiàn)至少有3種形式的Akt：Akt1、Akt2和Akt3。眾多實(shí)驗(yàn)證實(shí)抑制AKT信號(hào)途徑可抑制血管再生[6,7]，本研究表明，新分化內(nèi)皮細(xì)胞具有更強(qiáng)增殖和血管形成能力，且Akt表達(dá)明顯強(qiáng)于成熟內(nèi)皮細(xì)胞。故推斷2組細(xì)胞的差異可能與Akt信號(hào)系統(tǒng)有關(guān)，而上調(diào)Akt表達(dá)，可能會(huì)使成熟內(nèi)皮細(xì)胞獲得與新分化內(nèi)皮細(xì)胞一樣的增殖能力和成管能力，可進(jìn)一步設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。Akt信號(hào)系統(tǒng)是非常復(fù)雜的通路，該通路對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力和成管能力的具體作用機(jī)制也有待深入研究。

[1]Kirton JP,Xu Q.Endothelial precursors in vascular repair[J].Microvasc Res,2010,l79:193-199.

[2]Reidy MA,Clowes AW,Schwartz SM.Endothelial regeneration.V.Inhibition of endothelial regrowth in arteries of rat and rabbit[J].Lab Invest, 1983,49:569-575.

[3]崔斌,黃嵐.大鼠脾源性內(nèi)皮細(xì)胞移植在損傷血管內(nèi)膜修復(fù)中的作用[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,28:1553-1556.

[4]Gosen N,She QB.AKT and cancer-is it allmTOR[J].Cancer Cell,2006, 10:254-256.

[5]Chu L,Hao H,Luo M,et al.Ox-LDL modifies the behavior of bone marrow stem cells and impairs their endothelial differentiation via inhibition of Akt phosphorylation[J].J Cell Mol Med,2011,15:423-432.

[6]Sami A,Karsy M.Targeting the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway in glioblastoma:novel therapeutic agents andadvances in understanding[J]. Tumour Biol,2013,34:1991-2002.

[7]Polivka J Jr,Janku F.Molecular targets for cancer therapy in the PI3K/AKT/Mtor pathway[J].Pharmacol Ther,2014,142:164-175.（本文編輯：王晶）

Comparison of Biological Characters between Different Sources of Endothelial Cells

XU Hui-fang,WANG Jun-li,QIU Xin,WAN Xiao-lin,CHEN Guo-hua.Department of Neurology,Wuhan Traditional Chinese Medicine Hospital,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430022,China

Objective:To compare the biological characters and Akt expression between rat endothelial cells and mesenchymal stem cells(MSCs)-derived endothelial cells.Methods:The endothelial cells derived from the thoracic aorta of rats were isolated and cultured,and MSCs were induced to differentiate into endothelial cells.The two groups of cells were compared for their morphology,proliferation,tube formation ability,and the expression of surface marker and Akt were exmaine by Western blot.Results:The morphology was different between stem cell-derived endothelial cells and mature endothelial cells.Proliferation and tube formation abilities of stem cell-derived endothelial cells were stronger than the latter.The both groups could express endothelial cells surface markers,but the mature endothelial cells were more intensive(P<0.05).Akt expression in stem cell-derived endothelial cells was significantly higher than that of mature endothelial cells(P<0.05).Conclusion:There were biological and Akt differences between MSCs-derived endothelial cells and mature endothelial cells.

endothelial cells;mesenchymal stem cells;Akt

R741；R321

A

10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.01.001

華中科技大學(xué)附屬武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

武漢430022

基金課題

武漢市學(xué)科帶頭人計(jì)劃

（No.20127113045 8）；

湖北省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目

（No.CDA061）；

武漢市科技局

（No.201506170101 1618）

2015-01-26

陳國(guó)華

cghys2008@126. com