產(chǎn)β-葡萄糖苷酶釀酒酵母菌株的化學(xué)誘變選育及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

王　婧,張　莉,張宏海,韓舜愈，*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730070;2.甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅蘭州 730070;3.甘肅省葡萄酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心,甘肅蘭州 730070)

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產(chǎn)β-葡萄糖苷酶釀酒酵母菌株的化學(xué)誘變選育及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

王婧1,2,3,張莉1,2,3,張宏海1,2,3,韓舜愈1,2,3，*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730070;2.甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅蘭州 730070;3.甘肅省葡萄酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心,甘肅蘭州 730070)

以實(shí)驗(yàn)室保存的一株釀酒酵母菌株UV-45為出發(fā)菌株,通過硫酸二乙酯(DES)誘變篩選及致死率測定,得到一株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶穩(wěn)定,酶活為74.26 U/mL的突變菌株UV-E-16,與出發(fā)菌株相比,其酶活提高了22.74%;通過Plackett-Burman方法對(duì)該菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的相關(guān)因素進(jìn)行分析,得出初始pH、培養(yǎng)溫度和接種量為顯著影響因子;利用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)曲面法獲得其最佳產(chǎn)酶條件為初始pH5.62、培養(yǎng)溫度29.5 ℃、接種量6.12%,該條件下,菌株UV-E-16產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酶活為90.91 U/mL。經(jīng)化學(xué)誘變及響應(yīng)面優(yōu)化產(chǎn)酶條件,出發(fā)菌株UV-45產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酶活力提高了50.24%,具有工業(yè)化應(yīng)用的潛力。

β-葡萄糖苷酶,硫酸二乙酯,化學(xué)誘變,產(chǎn)酶條件

β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,BGL,EC 3.2.1.21),是鍵合態(tài)香氣釋放的關(guān)鍵酶,首次于 1837 年在苦杏仁中由Liebig和Wohler發(fā)現(xiàn)[1-2]。它能催化烷基糖苷、芳基糖苷等結(jié)合于糖鏈末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵[3-4]水解使其釋放出游離的具有香氣的糖苷配體[5-7],能夠改善和增強(qiáng)果酒的香氣[8],且在食品方面有廣泛應(yīng)用。

微生物是β-葡萄糖苷酶的主要來源,主要集中在酵母、黑曲霉及一些細(xì)菌上。目前對(duì)微生物來源的β-葡萄糖苷酶研究較多的是絲狀真菌,主要是曲霉以及木霉;在眾多的產(chǎn)酶微生物菌種中,黑曲霉為產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的優(yōu)勢菌,研究也較多,但是黑曲霉存在一定的食品安全隱患,在食品加工中的應(yīng)用受到了很大程度的限制[9]。因此,酵母以及乳酸菌成為了與食品相關(guān)的產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的研究重點(diǎn)。

在實(shí)際應(yīng)用中,酵母釋放的β-葡萄糖苷酶活性較低,產(chǎn)酶條件不明,因此,探明酵母菌株的產(chǎn)酶條件并提高β-葡萄糖苷酶活力對(duì)提高果酒香氣以及食品方面應(yīng)用具有重要意義。

誘變育種是指利用物理或化學(xué)誘變劑處理微生物菌株使其發(fā)生基因突變,再通過簡便、快速和高效的篩選方法,從中挑選出目標(biāo)突變菌株的過程[10]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,化學(xué)誘變手段主要是利用化學(xué)試劑使菌株發(fā)生突變,常用的化學(xué)誘變試劑有硫酸二乙酯(DES)、甲基磺酸乙酯(EMS)、亞硝基胍(NTG)等。其誘變機(jī)理是化學(xué)試劑能改變DNA結(jié)構(gòu),并引起DNA變異,許多化學(xué)誘變試劑產(chǎn)生的DNA畸變幾率較低,其具有位點(diǎn)特異性,且產(chǎn)生突變的比例較高、范圍較大,可以引起染色體斷裂和生物學(xué)損傷。該方法操作不需要特殊設(shè)備,且操作過程較為簡單。因此可以低濃度處理較長時(shí)間而獲得較高的誘變效果[11]。

2004年,王宜林[12]用鹽酸羥胺和5-溴尿嘧啶復(fù)合誘導(dǎo)酵母使產(chǎn)超氧化物歧化酶SOD能力提高。2009年,劉海洲[13]通過紫外誘變、硫酸二乙酯誘變及復(fù)合誘變,對(duì)南極假絲酵母菌種進(jìn)行了選育,篩選出一株高產(chǎn)菌株UDAan-I,其酶活達(dá)到42.7 U/mL,為原始茵株的1.8倍。2013年Ruchi[14]等人利用化學(xué)與物理誘變復(fù)合技術(shù)處理枯草芽孢桿菌,使其產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活性提高1.2倍。但是,系統(tǒng)研究化學(xué)誘變方法在提高酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶方面的報(bào)道較少。

實(shí)驗(yàn)以一株能夠產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶的釀酒酵母菌株為出發(fā)菌株,分析化學(xué)誘變處理的條件參數(shù),旨在選育出高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的突變菌株并明確其產(chǎn)酶最優(yōu)條件,以期為實(shí)際生產(chǎn)提供優(yōu)良的菌株。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

釀酒酵母菌株(Saccharomycescerevisiae)UV-45由甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室紫外誘變選育保存。

p-NPGSigma公司;對(duì)硝基苯酚天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司;硫酸二乙酯、硫代硫酸鈉、酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂等均為國產(chǎn)分析純。

湘儀高速冷凍離心機(jī)長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;紫外-可見分光光度計(jì)Thermo Fisher scientific公司;SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;SYQ-DSX-280B型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2培養(yǎng)基與試劑配制

YPD液體培養(yǎng)基酵母浸膏1.0%,蛋白胨2.0%,葡萄糖2.0%,自然pH,121 ℃滅菌 20 min。

YEPD固體培養(yǎng)基酵母浸膏1.0%,蛋白胨2.0%,葡萄糖2.0%,瓊脂2.0%,自然pH,121 ℃滅菌 20 min。溫度降至70 ℃左右,加入60 μg/mL鏈霉素。

發(fā)酵培養(yǎng)基[15]酵母浸膏1.0%,蛋白胨2.0%,葡萄糖2.0%,NH4NO30.3%、KH2PO40.4%,自然pH

初篩培養(yǎng)基[16]馬鈴薯20 g/L,葡萄糖20 g/L,瓊脂 20 g/L,自然pH,將200 g馬鈴薯去皮切碎,煮爛后取得馬鈴薯汁,加入葡萄糖與瓊脂并加水至1000 mL,121 ℃滅菌 20 min,在溫度降到60～70 ℃左右加入1 g/L p-NPG。

DES誘變劑DES與無水乙醇按相應(yīng)體積比混合,制備不同濃度DES誘變劑。

25%硫代硫酸鈉25 g硫代硫酸鈉溶于100 mL蒸餾水中。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1原菌株活化培養(yǎng)將出發(fā)菌株UV-45接種一環(huán)于YEPD斜面培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)24 h后,接入50 mL YPD液體培養(yǎng)基中28 ℃,180 r/min培養(yǎng)48 h。將活化好的酵母菌按5%的接種量轉(zhuǎn)入20 mL YPD液體培養(yǎng)基中,28 ℃,180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。

1.3.2生長曲線繪制取15個(gè)50 mL三角瓶,分別裝入20 mL YPD液體培養(yǎng)基滅菌備用。將菌株UV-45擴(kuò)增培養(yǎng)液按5%接種量分別接入,并于28 ℃,180 r/min培養(yǎng),每隔4 h取樣。以不接菌的YPD液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照,在600 nm下測吸光度值,繪制菌株生長曲線[17]。

1.3.3菌株化學(xué)誘變及篩選

1.3.3.1菌懸液制備取對(duì)數(shù)生長期的培養(yǎng)液,8000 r/min離心10 min收集酵母菌體,并以適量無菌生理鹽水洗滌2次。將酵母菌體懸浮于無菌生理鹽水中,并以無菌生理鹽水進(jìn)行10倍系列逐級(jí)稀釋,然后配成106～108cfu/mL的菌懸液。

1.3.3.2化學(xué)誘變最佳誘變劑濃度:分別取5 mL制備好的菌懸液,加入同體積DES溶液,DES濃度分別為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%。于28 ℃下以180 r/min的轉(zhuǎn)速恒溫振動(dòng)處理35 min后立即加入過量25% Na2S2O3終止反應(yīng)。分別取不同處理時(shí)間的菌液進(jìn)行梯度稀釋,并取稀釋液10-4、10-5、10-6涂布于YPD固體培養(yǎng)基上,30 ℃培養(yǎng)48 h,取未做DES處理的菌液稀釋平板作為對(duì)照,計(jì)算菌落數(shù)及DES誘變致死率[14]。

最佳誘變時(shí)間:取5 mL制備好的菌懸液,分別加入同體積1% DES溶液,分別于28 ℃下以180 r/min的轉(zhuǎn)速恒溫振動(dòng)處理。分別處理0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 min之后立即加入過量25% Na2S2O3終止反應(yīng)。分別取不同處理時(shí)間的菌液梯度稀釋,取10-4、10-5、10-6涂布于YPD固體培養(yǎng)基上,30 ℃培養(yǎng)48 h,取未做DES處理的菌液稀釋平板作為對(duì)照,計(jì)算菌落數(shù)及DES誘變致死率[14]。

致死率計(jì)算公式如下:

致死率(%)=(對(duì)照每0.1 mL菌落數(shù)-處理后每0.1 mL菌落數(shù))/對(duì)照每0.1 mL菌落數(shù)

1.3.3.3突變菌株篩選初篩:將最佳誘變條件下的單菌落,挑入以p-NPG為底物的96孔板初篩培養(yǎng)基上,培養(yǎng)3 d后,噴灑1 mol/L Na2CO3,觀察顯色情況,并挑選明顯呈黃色的菌落作為高產(chǎn)菌株進(jìn)行復(fù)篩。

復(fù)篩:將初篩顯色明顯的突變菌株接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h,將發(fā)酵液于8000 r/min離心10 min后,收集上清液,即粗酶液,用于測定酶活力,篩選出酶活較高的菌株。

1.3.4酶活測定

1.3.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制稱取對(duì)硝基苯酚139.0 mg,蒸餾水定容至1000 mL,分別吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于100 mL容量瓶中,用1 mol/L Na2CO3溶液定容后混勻。以蒸餾水作為空白,于400 nm處測其吸光值。以對(duì)硝基苯酚濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[15]。

1.3.4.2酶活測定參照馬騰臻的酶活測定方法[18],β-葡萄糖苷酶酶活力單位(U)定義為,在上述反應(yīng)條件下,1 min內(nèi)以p-NPG為底物釋放出1 μmol的p-NP所需要的酶量[18]。

1.3.5誘變菌株產(chǎn)酶穩(wěn)定性驗(yàn)證對(duì)復(fù)篩獲得的高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶突變菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng),連續(xù)傳代10次,測其β-葡萄糖苷酶酶活,獲得產(chǎn)酶穩(wěn)定性高的菌株[14]。

隨機(jī)響應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析以電機(jī)與車軸的垂向相對(duì)動(dòng)態(tài)位移為輸出結(jié)果，并取統(tǒng)計(jì)學(xué)中的3倍標(biāo)準(zhǔn)差，即3 σ作為邊界值，各工況計(jì)算結(jié)果匯總?cè)绫?～4所示。

1.4產(chǎn)酶培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.4.1最佳碳源選擇發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加2%淀粉、玉米芯、蔗糖、微晶纖維素、麩皮、葡萄糖為唯一碳源,其它成分不變,28 ℃,180 r/min培養(yǎng)72 h后測定β-葡萄糖苷酶活性[19],每組實(shí)驗(yàn)3個(gè)平行。

1.4.2最佳氮源選擇發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中去掉氮源,分別加入1%牛肉膏、尿素、硫酸銨、硝酸銨、酵母膏為唯一氮源,其他成分保持不變,28 ℃,180 r/min培養(yǎng)72 h后測定β-葡萄糖苷酶活性[19],每組實(shí)驗(yàn)3個(gè)平行。

1.4.3響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)酶條件

1.4.3.1Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選影響產(chǎn)酶的主效因子根據(jù)已經(jīng)確定好的碳源和氮源,以初始pH、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、轉(zhuǎn)速、接種量、裝液量及培養(yǎng)基碳源、氮源添加量等8個(gè)因素作為研究對(duì)象,考察各個(gè)因子對(duì)UV-E-16菌株產(chǎn)酶的影響。實(shí)驗(yàn)采用Plackett-Burman設(shè)計(jì),每個(gè)因子取高(+1)低(-1)兩個(gè)水平。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果(數(shù)據(jù)未給出)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素,設(shè)計(jì)水平見表1(N=12)[20]。

表1　Plackett-Burnman實(shí)驗(yàn)因素水平編碼Table 1　Factors levels and code of Plackett-Burnman

1.4.3.2最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(Steepest ascent design)由Plackett-Burnman實(shí)驗(yàn)選出對(duì)酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酶活影響顯著的因素進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn),設(shè)計(jì)顯著影響因素的最陡爬坡路徑,以實(shí)驗(yàn)值變化的梯度方向?yàn)榕榔路较颉?/p>

1.4.3.3Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[21]根據(jù)Plackett-Burman設(shè)計(jì)結(jié)果分析,為確定顯著因子的最優(yōu)水平,利用響應(yīng)曲面法(Box-Behnken 設(shè)計(jì))對(duì)影響菌株UV-E-16產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活性的顯著因子進(jìn)一步優(yōu)化。以酶活力為響應(yīng)值,主效因子的水平為自變量,使用Design-Expert進(jìn)行Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),設(shè)計(jì)方案見表2。

表2　中心組合實(shí)驗(yàn)的自變量及其水平Table 2　Factors and levels of center combination test design

1.5數(shù)據(jù)分析

采用Design-Expert 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。

2　結(jié)果與分析

2.1對(duì)硝基苯酚溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

對(duì)硝基苯酚在堿性條件下顯黃色,在一定范圍內(nèi),其濃度與吸光值成正比。如圖1,對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:Y=19.957x-0.0087,相關(guān)系數(shù)R2=0.9970,吸光度與對(duì)硝基苯酚含量成線性關(guān)系。

圖1　對(duì)硝基苯酚溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of p-nitrophenol solution

2.2菌株UV-45生長曲線

菌株UV-45的生長曲線如圖2,4～28 h為酵母菌株UV-45的對(duì)數(shù)生長期,4 h以后酵母進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期,28 h后為穩(wěn)定期,菌體濃度基本保持不變,由于采用OD值法測菌體濃度,因此,細(xì)胞衰亡期趨勢未能體現(xiàn),因此未出現(xiàn)衰亡期。由于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞為生理活性一致的活細(xì)胞,突變率高,重現(xiàn)性好[21],因此本實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)數(shù)生長中期的菌體進(jìn)行化學(xué)誘變,即選擇培養(yǎng)16 h的菌體進(jìn)行DES誘變處理。

圖2　酵母菌株UV-45生長曲線Fig.2　Growth curves of yeast strain UV-45

2.3DES誘變條件優(yōu)化

2.3.1最佳誘變濃度選擇出發(fā)菌株UV-45由不同濃度DES誘變處理,DES濃度與致死率的關(guān)系如圖3所示,UV-45菌株對(duì)DES試劑非常敏感,DES試劑濃度為0.5%時(shí),致死率達(dá)到50%;隨著濃度增大,菌株致死率呈上升趨勢;濃度為2%時(shí),致死率達(dá)到92%。由于高致死率容易產(chǎn)生突變株,但負(fù)突變較多;低致死率不易產(chǎn)生突變,但正突變比例較高[11],據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,誘變的致死率在75%～85%之間時(shí),正突變率相對(duì)較高[11],獲得優(yōu)良性能菌株的可能性更大。因此選擇77.53%的致死率,即DES濃度為1%。

圖3　DES濃度對(duì)菌株致死率的影響Fig.3　Effects of radiation DES concentration on death rate of strain

2.3.2最佳誘變時(shí)間選擇DES處理時(shí)間與致死率的關(guān)系如圖4所示,UV-45在濃度為1%的DES處理下,隨著處理時(shí)間增長,菌株致死率呈上升趨勢;在處理60 min時(shí),酵母菌株UV-45的致死率達(dá)到100%,因此,選擇1% DES處理酵母菌40 min,此時(shí)致死率為82.02%。

圖4　DES誘變處理時(shí)間對(duì)菌株致死率的影響Fig.4　Effects of radiation DES time on death rate of strain

2.4突變菌株篩選

由于p-NPG經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解后的產(chǎn)物p-NP在堿性條件下顯黃色[15],因此將其作為反應(yīng)底物,利用96孔板培養(yǎng)進(jìn)行菌株初篩,根據(jù)顏色深淺據(jù)此來初步判斷酶活高低,以篩選出酶活較高的11株菌株分別是UV-E-5、UV-E-8、UV-E-9、UV-E-12、UV-E-16、UV-E-17、UV-E-19、UV-E-23、UV-E-25、UV-E-29、UV-E-33。

通過對(duì)這11株菌搖瓶發(fā)酵復(fù)篩,所得結(jié)果見圖5。對(duì)11株菌復(fù)篩所得的酶活力數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,根據(jù)顯著性分析,UV-E-9、UV-E-16、UV-E-23、UV-E-25,這4株突變體與出發(fā)菌株UV-E-45酶活力差異極顯著(p<0.01),分別比出發(fā)菌株提高了51.75%、48.24%、45.68%、40.19%,說明菌株UV-E-9、UV-E-16、UV-E-23、UV-E-25所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活力比原菌株有明顯提高。因此選擇這四株突變體進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

圖5　突變體β-葡萄糖苷酶酶活Fig.5　β-glucosidase activity of Mutant

2.5突變菌株產(chǎn)酶穩(wěn)定性研究

將復(fù)篩得到的突變菌株UV-E-9、UV-E-16、UV-E-23、UV-E-25經(jīng)過多次傳代后測酶活,結(jié)果如圖6所示,只有菌株UV-E-16傳代10次后β-葡萄糖苷酶酶活仍保持了83.3%的酶活力,說明突變菌株UV-E-16性狀相對(duì)穩(wěn)定,因此選擇UV-E-16為目標(biāo)菌株做進(jìn)一步研究。

圖6　突變體產(chǎn)酶穩(wěn)定性Fig.6　Produce enzyme stability of Mutant

2.6突變菌株產(chǎn)酶培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.6.1最佳碳源、氮源選擇由圖7可知,蔗糖作為突變菌株UV-E-16產(chǎn)酶培養(yǎng)的碳源時(shí),最有利于產(chǎn)酶;其次是葡萄糖和微晶纖維素。當(dāng)選擇蔗糖為最佳碳源,其酶活為84.91 U/mL。

圖7　不同碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.7　The influence of different carbon sources on the enzyme production

如圖8所示,突變菌株UV-E-16產(chǎn)酶培養(yǎng)的最適氮源為酵母膏,其次是尿素,而硫酸銨和硝酸銨作為唯一氮源不能滿足大量產(chǎn)酶的需求,因此選擇酵母膏為最佳氮源。

圖8　不同氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.8　The influence of different nitrogen source on the enzyme production

2.6.2響應(yīng)面法優(yōu)化β-葡萄糖苷酶產(chǎn)酶條件

2.6.2.1Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選影響產(chǎn)酶的主效因子運(yùn)用Design-Expert 8.05進(jìn)行設(shè)計(jì)與分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果及主效應(yīng)分析結(jié)果分別見表3、表4。

表3　Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3　Design and results of Plackett-Burnman

由表4可知,對(duì)突變菌株UV-E-16產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酶活有顯著影響的因素為初始pH(X1)、培養(yǎng)溫度(X2)、接種量(X5),其他因素對(duì)產(chǎn)酶活性沒有顯著影響,根據(jù)效應(yīng)判斷,選擇條件即培養(yǎng)時(shí)間(X3)為64 h,轉(zhuǎn)速(X4)為170 r/min,裝液量(X6)為40 mL,蔗糖添加量(X7)為40 g/L,酵母膏添加量(X8)為10 g/L。因此,最陡爬坡實(shí)驗(yàn)選擇初始pH、培養(yǎng)溫度和接種量為研究對(duì)象。

表4　Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)各因素主效應(yīng)分析Table 4　Main effect factors analysis of Plackett-Burnman

2.6.2.2最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)2.6.2.1篩選所得的3個(gè)顯著因素及其效應(yīng),設(shè)定最陡爬坡實(shí)驗(yàn)步長及爬坡方向。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析見表5。

表5　最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5　Design and results of steepest garde test

由表5知,2號(hào)實(shí)驗(yàn)條件下酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酶活最高為87.5 U/mL,即培養(yǎng)基初始pH為5.5、培養(yǎng)溫度為30 ℃、接種量為6% 的培養(yǎng)條件。因此,將2號(hào)實(shí)驗(yàn)條件作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平的中心點(diǎn)。

2.6.2.3Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果根據(jù)2.6.2.1與2.6.2.2結(jié)果分析,對(duì)產(chǎn)β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量影響顯著的因素為初始pH、培養(yǎng)溫度以及接種量。為了確定顯著因子的最佳水平,利用響應(yīng)曲面法(Box-Behnken設(shè)計(jì))對(duì)影響突變菌株UV-E-16產(chǎn)酶活性的顯著因子進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。以酶活力為響應(yīng)值,顯著因子的水平為自變量,借助實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Design-Expert進(jìn)行Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),設(shè)計(jì)及結(jié)果見表6。

利用Design Expert 8.0軟件對(duì)表6的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合,獲得酶活(Y)對(duì)A-初始pH(X1)、B-培養(yǎng)溫度(X2)、C-接種量(X5)的二次多項(xiàng)回歸方程:

Y=89.67+7.42A-5.17B+1.65C+10.09AB+10.24AC-6.35BC-16.01A2-17.65B2-19.63C2

表6　Box-Behnken組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6　Design and results of Box-Behnkencombination test

表7　Box-Behnken實(shí)驗(yàn)回歸模型方差分析Table 7　Analysis of Box-Behnken combination test regression model variance

用Design Expert 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析,其方差分析見表7、表8。從表中可以看出,該模型在α=0.01的水平上高度顯著,說明模型的預(yù)測值和實(shí)際值非常吻合,模型成立。各因素中一次項(xiàng) A,交互項(xiàng)AB,AC及二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響極顯著(p<0.01);一次項(xiàng) B 對(duì)產(chǎn)酶量影響顯著(p<0.05);而C、BC的影響差異不顯著。同時(shí)回歸方程相關(guān)系數(shù)R2=0.9661,模型F=22.14,說明響應(yīng)值的變化有96.61%來源于所選變量,即初始pH、培養(yǎng)溫度、接種量等三個(gè)因素的變化是造成菌株UV-E-16β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量不同的原因。

表8　二次多項(xiàng)回歸方程系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)Table 8　The regression coefficients of the quadratic multinomial significance test

回歸方程失擬檢驗(yàn)p>0.05,F=1.36,說明未知因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果干擾很小。因此,該回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系,可以用其確定最佳產(chǎn)酶條件。根據(jù)表7、表8中各因素對(duì)于菌株酶產(chǎn)量影響的F值,可以看出初始pH對(duì)菌株產(chǎn)酶量影響最大,培養(yǎng)溫度次之,接種量影響最小。

2.6.2.4響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果的分析對(duì)初始pH(A)、培養(yǎng)溫度(B)、接種量(C)3個(gè)因素,兩兩交互作用分析,做出響應(yīng)面曲面,如圖9。RSM方法的圖形是特定的響應(yīng)面(Y)與對(duì)應(yīng)的因素A、B、C構(gòu)成的一個(gè)三維空間在二維平面上的等高圖,每個(gè)響應(yīng)面對(duì)其中兩個(gè)因素進(jìn)行分析,另外兩個(gè)因素固定在零水平。從中可以直觀地反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響,從實(shí)驗(yàn)所得的響應(yīng)面分析圖上可以找到它們在提取過程中的相互作用,并通過等高線圖得最優(yōu)條件下各實(shí)驗(yàn)因子的取值。對(duì)初始pH(A)、培養(yǎng)溫度(B)、接種量(C)3個(gè)因素,兩兩交互作用分析,做出相應(yīng)的響應(yīng)面曲面。如圖9A,培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)基初始pH的響應(yīng)面圖及培養(yǎng)基初始pH與接種量的響應(yīng)面圖(圖9B)可知,響應(yīng)曲面坡度陡峭并且等高線扁而十分密集,說明UV-E-16菌株發(fā)酵產(chǎn)酶受到培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)基初始pH兩因素間的交互作用趨勢較明顯,而從培養(yǎng)溫度與接種量的相面圖(圖9C)可以看出,相應(yīng)曲面坡度陡峭度降低,等高線密度降低,說明菌株發(fā)酵產(chǎn)酶量受該兩組因素間的交互作用不顯著。該結(jié)果與表8、表9的方差分析結(jié)果一致。圖9D表示實(shí)際值與預(yù)測值的擬合度較高,實(shí)驗(yàn)真實(shí)性可靠。

圖9　響應(yīng)面分析交互作用對(duì)β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量的 影響及實(shí)際值與預(yù)測值的擬合性Fig.9　Response surface analysis of interactions on beta glycosidase enzymes yield and the influence of the fitting of the actual values and predicted values

2.7驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證該模型的可靠性,初始pH5.62、培養(yǎng)溫度29.8 ℃、培養(yǎng)時(shí)間為64 h、轉(zhuǎn)速為170 r/min、接種量6.12%、裝液量為40 mL、蔗糖添加量為40 g/L、酵母膏添加量為10 g/L的條件下測定酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酶活,實(shí)際測得值為90.91 U/mL,預(yù)測值為95.23 U/mL,相對(duì)誤差為4.54%。因此,該模型設(shè)計(jì)合理且結(jié)果有效,得到的最佳培養(yǎng)條件準(zhǔn)確可靠。

3　結(jié)論

本文以本實(shí)驗(yàn)室選育保存的一株釀酒酵母UV-45為出發(fā)菌株,以硫酸二乙酯(DES)對(duì)其對(duì)數(shù)生長期的菌體進(jìn)行誘變,經(jīng)顯色反應(yīng)初篩和比色法復(fù)篩,得到了突變體UV-E-9、UV-E-16、UV-E-23、UV-E-25,這4株突變體的β-葡萄糖苷酶的酶活較出發(fā)菌株有明顯提高,并根據(jù)產(chǎn)酶穩(wěn)定性確定UV-E-16為最優(yōu)突變菌株。

對(duì)突變菌株UV-E-16發(fā)酵產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的條件進(jìn)行優(yōu)化。首先確定最優(yōu)碳源為蔗糖、最優(yōu)氮源為酵母膏。其次通過Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)培養(yǎng)條件初始pH、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、轉(zhuǎn)速、接種量、裝液量以及培養(yǎng)基碳源、氮源濃度等8個(gè)相關(guān)因素進(jìn)行篩選,初始pH、培養(yǎng)溫度和接種量對(duì)產(chǎn)酶菌株UV-E-16β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量有顯著影響,其他因素對(duì)產(chǎn)酶活性沒有顯著影響。通過Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法分析對(duì)菌株UV-E-16產(chǎn)酶活性有顯著影響的3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化組合,獲得最佳產(chǎn)酶條件為:初始pH 5.62、培養(yǎng)溫度29.8 ℃、培養(yǎng)時(shí)間為64 h、轉(zhuǎn)速為170 r/min、接種量6.12%、裝液量為40 mL、蔗糖添加量為40 g/L、酵母膏添加量為10 g/L。;該條件下,菌株UV-E-16產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酶活為90.91 U/mL,比出發(fā)菌株UV-45的酶活提高了50.24%,具有工業(yè)化應(yīng)用的潛力。

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Chemical mutation of strain and optimization of productionβ-Glucosidase fromSaccharomycescerevisiae

WANG Jing1,2,3,ZHANG Li1,2,3,ZHANG Hong-hai1,2,3,HAN Shun-yu1,2,3，*

(1.College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Key Laboratory of Viticulture and Enology in Gansu Province,Lanzhou 730070,China;3.Research and Development Center of Wine Industry Technology in Gansu Province,Lanzhou 730070,China)

By the screening of diethyl sulfate(DES)mutation and death rate determination,a mutant strain UV-E-16,which characterized by stableβ-glucosidase producing capability and enzyme activity of 74.26 U/mL,was obtained from a laboratory savedSaccharomycescerevisiaeUV-45.Compared with the original strain,enzyme activity of UV-E-16 was improved by 22.74%.Initial pH,temperature,and inoculation dose were selected as the significant impact factors affecting on enzyme production according to Plackett-Burman design.Further optimizing was conducted by Box-Behnken design and response surface methodology.Related results showed that the optimized conditions were initial fermentation pH of 5.62,culture temperature of 29.5 ℃ and inoculum 6.12%,and theβ-glucosidase producing activity of UV-E-16 was 90.91 U/mL under the conditions.The activity ofβ-Glucosidase synthesis was improved by 50.24% in comparison with UV-45,UV-E-16 can be regarded as a promising strain with industrial application properties.

β-glucosidase;diethyl sulfate;chemistry mutagenic;optimized conditions

2015-03-23

王婧(1969- )，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：微生物學(xué)，E-mail：wangjing@gsau.edu.cn。

韓舜愈(1963- )，男，博士，教授，研究方向：果蔬加工及葡萄酒釀造，E-mail：gsndhsy@163.com。

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31160310)；甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)專項(xiàng)(GNSW-2013-16)。

TS261.2

A

1002-0306(2016)09-0139-08

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.019