高效液相法測定草魚糜發(fā)酵過程中生物胺變化

曾　妮,江　勇,陳麗麗,趙　利，*,白春清,袁美蘭,魏　穎

(1.江西科技師范大學 生命科學學院,江西南昌 330013;2.國家淡水魚加工技術研發(fā)分析中心(南昌),江西南昌 330013)

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高效液相法測定草魚糜發(fā)酵過程中生物胺變化

曾妮1，2,江勇1，2,陳麗麗1，2,趙利1，2，*,白春清1，2,袁美蘭1，2,魏穎1，2

(1.江西科技師范大學 生命科學學院,江西南昌 330013;2.國家淡水魚加工技術研發(fā)分析中心(南昌),江西南昌 330013)

本文采用納豆芽孢桿菌和戊糖片球菌組成的混合發(fā)酵劑對草魚魚糜進行發(fā)酵,建立了發(fā)酵魚制品中六種生物胺(色胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺)的高效液相色譜分析方法,研究了魚糜發(fā)酵過程中生物胺含量的變化以及微生物數(shù)量的變化。結果發(fā)現(xiàn),在30 min內(nèi)各種生物胺得到很好的分離,且線性關系良好(R2>0.999),回收率在97.35%～103.00%,精密度、重現(xiàn)性RSD均小于10%。添加混合發(fā)酵劑可以明顯抑制金黃色葡萄球菌、假單胞菌和大腸桿菌等雜菌的生長,降低發(fā)酵過程中腐胺、尸胺、組胺和酪胺含量的積累;利用納豆芽孢桿菌,戊糖片球菌組成的混合發(fā)酵劑以及一系列負控脫羧酶活動能有效抑制魚糜發(fā)酵過程中生物胺的形成,抑制腐敗菌和致病菌的生長,提高魚糜發(fā)酵食品的品質(zhì)。

高效液相色譜,生物胺,草魚糜,混合發(fā)酵劑,微生物數(shù)量分析

水產(chǎn)品是世界上重要的食物之一,利用海水魚或者淡水魚發(fā)酵生產(chǎn)的魚糜制品是一種傳統(tǒng)的提高成品感官和衛(wèi)生質(zhì)量的方式[1],例如plaa-som[2]就是一種利用乳酸菌和酵母菌發(fā)酵制得的泰國食品。

本研究在國標的基礎上進行修改,提高生物胺檢出限為1000 mg/kg,通過簡化流動相和改變梯度洗脫程序,得到了生物胺衍生物出峰時間短,雜峰干擾少,分離度好,且精密度、平均加標回收率和相對標準偏差都符合檢測要求的生物胺的高效液相色譜-紫外檢測方法。以混合發(fā)酵劑發(fā)酵的魚糜為研究對象,檢測其發(fā)酵過程中主要生物胺含量的變化,同時測定了微生物指標的變化,為淡水產(chǎn)品加工中生物胺的安全風險評估及食用淡水產(chǎn)品安全性提供理論支持。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

草魚魚糜 新鮮草魚肉-18 ℃凍藏30±3 d后絞碎;納豆芽孢桿菌(n-3)江西農(nóng)業(yè)大學食品學院提供;戊糖片球菌(x-4、x-5)南昌大學食品科學重點實驗室提供;膠原蛋白腸衣 上海班泰食品腸衣廠。

組胺、腐胺、尸胺、色胺、酪胺、亞精胺美國Fluka公司;丹磺酰氯(99%)美國sigma公司;乙腈(色譜純)美國天地公司;1,7-二氨基庚烷(98%)、高氯酸(優(yōu)級純)成都格雷西亞化學技術有限公司;水平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、甘露醇高鹽培養(yǎng)基、CN瓊脂培養(yǎng)基、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基等青島高科園海博生物技術有限公司;丙酮、碳酸氫鈉、氨水、氯化鈉優(yōu)級純。

Agilent 1100高效液相色譜儀美國安捷倫公司;BHC 1000ⅡA/B3型生物安全柜蘇州安泰空氣技術有限公司;HA-300MD型高壓滅菌器日本株式會社平山制作所;絞肉機 TJ12-H廣東恒聯(lián)食品機械有限公司;SPX-100B-Z型生化培養(yǎng)箱上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.2實驗方法

1.2.1發(fā)酵魚糜的制備冷凍草魚肉絞碎,5000 r/min離心10 min后棄去上清液→空擂混勻5 min→加入2%葡萄糖和2%NaCl斬拌10 min→加入3%由納豆芽孢桿菌(n-3)、戊糖片球菌(x-4、x-5)組成的混合發(fā)酵劑(菌種比例為1∶1∶1)并斬拌10 min→灌腸→37 ℃恒溫發(fā)酵36 h→制得發(fā)酵腸樣品。

1.2.2生物胺的測定根據(jù)國標GB/T 20768-2006[15]中的生物胺檢測法進行修改,將生物胺的檢出限提高至1000 mg/kg,簡化流動相,修改梯度洗脫程序,以縮短所有溶劑峰的出峰時間并減少雜峰的干擾。

1.2.2.1標準溶液的制備精確稱取色胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺或者亞精胺標準品,用0.1 mol/L HCl溶液配制成質(zhì)量濃度為1.0000 mg/mL的生物胺單標儲備液。分別吸取相同體積各生物胺單標儲備液,混勻后稀釋成100 μg/mL的生物胺混標工作液。精確稱取1,7-二氨基庚烷,用0.1000 mol/L鹽酸溶液配制成1 mg/mL的內(nèi)標使用液。所有溶液均4 ℃避光保存。

1.2.2.2樣品預處理取5.0 g絞碎后的發(fā)酵魚糜制品,加20 mL 0.4 mol/L高氯酸溶液,250 μL內(nèi)標溶液后均質(zhì),振蕩提取5 min,靜置后5000×g離心35 min,將上清液移入50 mL容量瓶中,沉淀重復提取一次,上清液合并并定容至刻度。

1.2.2.3樣品的衍生衍生過程參考Ben[16]等人的方法并稍作修改。取1 mL生物胺混標工作液或樣品提取液至5 mL容量瓶中,依次加入200 μL 2 mol/L氫氧化鈉溶液和300 μL飽和碳酸氫鈉溶液,將溶液調(diào)整pH至10.5,再加入2 mL內(nèi)標使用液,密封避光45 ℃反應45 min,加100 μL氨水終止反應,靜置15 min后氮氣吹去丙酮,乙腈定容,混勻后取上清液過0.22 μm微孔濾膜,供液相色譜使用。

1.2.2.4色譜條件色譜柱:Waters C18柱,4.6 mm×150 mm,5 μm;流動相:A為純水,B為乙腈;柱溫35 ℃;進樣量10 μL;流速1 mL/min,梯度洗脫程序見表1;紫外檢測器波長:254 nm;以峰面積內(nèi)標法定量。

表1　生物胺衍生樣品的分離洗脫梯度Table 1　Elution gradient of mobile phase for separation of benzyl derivertives of biogenic amines

1.2.2.5線性實驗、精密度實驗及加標回收率實驗線性實驗:將生物胺混標工作液用0.1 mol/L鹽酸溶液分別稀釋至100、80、60、40、20、10、5、1和0.5 μg/mL,按1.2.2.3節(jié)中衍生方法和1.2.2.4節(jié)色譜條件進行測定,以生物胺混標工作液的質(zhì)量濃度為橫坐標、生物胺與內(nèi)標的峰面積比為縱坐標制作標準曲線,得到線性回歸方程及其相關系數(shù)R2。

精密度實驗:制備質(zhì)量濃度為10 μg/mL的生物胺混標工作液,平行衍生2次,分別進樣3次,采用上述方法進行處理和測定,計算相對標準偏差RSD%。

加標回收率實驗:選取樣品(添加混合發(fā)酵劑組發(fā)酵36 h)分別加入質(zhì)量濃度為100 μg/mL的生物胺混標工作液,使其添加量分別相當于5 μg/mL和10 μg/mL,衍生后平行測定3次,計算各生物胺回收率及相對標準偏差。

1.2.3微生物數(shù)量分析無菌取樣10 g置于均質(zhì)袋內(nèi),加入90 mL無菌生理鹽水,用拍擊式均質(zhì)器8000 r/min均質(zhì)2 min,吸取1 mL上清液,依次進行10倍梯度稀釋,用稀釋平板法在不同的選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)計數(shù):

細菌總數(shù)用PCA培養(yǎng)基(PlatecountAgar),37 ℃培養(yǎng)48 h;金黃色葡萄菌用甘露醇高鹽(Mannitol Salt Agar)瓊脂培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)48 h;假單胞菌用CN(CN Agar)瓊脂培養(yǎng)基,30 ℃培養(yǎng)48 h;腸道菌用VRBA結晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基(Violet Red Bile Agar),37 ℃雙層培養(yǎng)24 h后挑取10個不同類型的紅色典型菌落,分別移種于煌綠乳糖膽鹽(Brilliant Green Lactose Bile,BGLB)肉湯管內(nèi),37 ℃培養(yǎng)48 h,觀察產(chǎn)氣情況,產(chǎn)氣者可視為腸道菌,按所占比例計算樣品腸道菌數(shù);乳酸菌用MRS培養(yǎng)基,37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h;芽孢桿菌用無菌取樣樣液在85 ℃處理15 min,冷卻后用PCA培養(yǎng)基(PlatecountAgar),37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.3數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 17.0軟件進行統(tǒng)計分析,采用Origin 7.5軟件作圖。

2　結果與分析

2.1生物胺的高效液相色譜檢測法

2.1.1生物胺標準品圖譜和實際樣品圖譜采用梯度程序洗脫,生物胺標準品衍生物圖譜見圖1。結果顯示,使用該流動相及梯度洗脫程序可在前30 min內(nèi)流出全部溶劑峰,在30 min內(nèi)試樣中所有待檢生物胺可以全部洗脫出來。經(jīng)計算相鄰兩種生物胺衍生物的分離度分別為20.60、7.55、3.62、15.94、19.90和9.76,均大于2,說明經(jīng)該流動相及洗脫程序洗脫后,6種生物胺標準品及內(nèi)標衍生物能有效得到分離且峰型良好。從圖2實際樣品色譜可以看出各生物胺衍生物峰型對稱,雜質(zhì)干擾少,因此該流動相梯度洗脫檢測生物胺是可行的。

圖1　生物胺標準品HPLC色譜圖(100 μg/mL)Fig.1　HPLC chromatogram of biogenic amine standards(100 μg/mL)注：Tyr:色胺，Put：腐胺,Cad:尸胺，His:組胺, Tyr:酪胺，Spd:亞精胺，IS：內(nèi)標，圖2同。

圖2　接種混合發(fā)酵劑樣品A(MSC36h) 和未接種混合發(fā)酵劑樣品B(NS36h)HPLC色譜圖Fig.2　HPLC chromatogram of sample A(MSC36h)fermented with mixed starter cultures and sample B(NS36h) fermented without mixed starter cultures

2.1.2標準曲線回歸方程、精密度及加標回收率將不同質(zhì)量濃度的生物胺標準溶液依次進樣,計算標準曲線的回歸方程及相關系數(shù)。從表2中可知,各生物胺衍生物線性回歸方程在0.5～100 μg/mL線性范圍內(nèi)的線性關系系數(shù)R2均大于0.999,說明峰面積與生物胺衍生物含量之間具有顯著的線性關系,符合測定要求。從表3中可知,對10 μg/mL的生物胺混標工作液連續(xù)進樣實驗中,色胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺和亞精胺的測定結果RSD值分別為1.01%、1.86%、1.82%、1.85%、1.70%和1.20%,RSD值均小于2%,精密度符合檢測要求。各添加水平的平均加標回收率和相對標準偏差如表4所示,6種生物胺標準品回收率在97.35%～103.00%,重現(xiàn)性RSD在1.70%～4.81%,均小于10%,因此該方法可以用來檢測發(fā)酵魚糜制品中的生物胺含量。

表2　標準曲線的回歸方程及其他線性實驗結果Table 2　Result of regression equations and other linear experiment

表3　精密度實驗結果Table 3　Precision results

表4　發(fā)酵魚糜樣品中生物胺回收率實驗結果Table 4　Recovery of biogenic amines in fermented with mixed starter cultures

表5　魚糜發(fā)酵過程中生物胺的變化Table 5　Changes of biogenic amines in frozen grass crap surimi fermentation

注:NS(對照組)未添加發(fā)酵劑;MSC(發(fā)酵劑組),添加混合發(fā)酵劑。

2.2草魚糜發(fā)酵過程中生物胺含量及微生物數(shù)量的變化

2.2.1生物胺含量表5是魚糜發(fā)酵過程中生物胺的變化,比較了草魚魚糜分別在未接種混合發(fā)酵劑(對照組)和接種混合發(fā)酵劑(發(fā)酵劑組)后,在37 ℃發(fā)酵至36 h過程中6種生物胺含量的變化情況。從表5中可知,在0 h時,即新鮮草魚肌肉組織中,生物胺的含量非常低,經(jīng)檢測最低的生物胺為腐胺0.1 mg/kg,最高的為酪胺10.09 mg/kg。

對照組中幾種生物胺的含量隨著發(fā)酵時間的延長急劇增加,部分生物胺類即使在初始原料中含量相對較低,但隨著發(fā)酵時間的延長,逐漸產(chǎn)生并積累,如經(jīng)37 ℃發(fā)酵12 h后,尸胺含量快速上升,從0.52 mg/kg上升至22.78 mg/kg,上升了22.26 mg/kg,酪胺含量從10.09 mg/kg上升至45.39 mg/kg,上升了35.3 mg/kg;經(jīng)37 ℃發(fā)酵至24 h時,腐胺和組胺含量上升較慢,尸胺和酪胺含量快速上升;發(fā)酵36 h后,對照組中尸胺含量上升了258.84 mg/kg,為原料中尸胺含量的497.8倍,腐胺含量上升了16.68 mg/kg,為原料中腐胺含量的166.8倍,其后分別是酪胺、色胺、亞精胺、腐胺和組胺,生物胺的含量與發(fā)酵前相比有顯著增加,特別是尸胺和酪胺。對照組在發(fā)酵后期腐胺含量接近20 mg/kg,有腐敗和臭味[10]。

發(fā)酵劑組的草魚魚糜中,亞精胺含量上升最少,經(jīng)37 ℃發(fā)酵至36 h時僅為14.75 mg/kg;酪胺含量上升至79.41 mg/kg;組胺含量上升至7.38 mg/kg;尸胺含量上升最多,由0.52 mg/kg上升至185.66 mg/kg,上升了356倍。總體來說,與對照組相比,發(fā)酵組的魚糜中,色胺、腐胺、尸胺和組胺含量的累積速度變慢。對照組魚糜中生物胺含量高度累積與幾種微生物相關,如微球菌,腸道菌,假單胞菌和部分乳酸菌。多數(shù)腸道菌和假單胞菌具有組氨酸和賴氨酸等氨基酸脫羧酶活力,能分解產(chǎn)生尸胺、酪胺和組胺等[17]。對照組魚糜中乳酸菌生長緩慢,不能抑制有害微生物的生長,蛋白酶和氨基酸脫羧酶活性較高,從而導致發(fā)酵過程中更易產(chǎn)生大量的生物胺。接種含有乳酸菌的混合發(fā)酵劑后,乳酸菌大量生長,魚糜pH快速降低,發(fā)酵過程中的酸化環(huán)境能較好的抑制雜菌生長,抑制蛋白酶和氨基酸脫羧酶,同時經(jīng)篩選的不具有氨基酸脫羧酶活性的菌種組成的混合發(fā)酵劑,能明顯抑制生物胺的形成,提高產(chǎn)品的安全性,Zhong[1]等人的研究得到了類似的結論。

圖3　發(fā)酵草魚魚糜過程中微生物的變化Fig.3　Microbiological changes in frozen grass crap surimi fermented with/without mixed starter cultures

2.2.2微生物數(shù)量分析由圖3中可看出,發(fā)酵劑組在發(fā)酵過程中菌落總數(shù)、金黃色葡萄球菌數(shù)、假單胞菌數(shù)和大腸桿菌數(shù)均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢;對照組中菌落總數(shù)、金黃色葡萄球菌數(shù)和假單胞菌數(shù)一直持續(xù)上升,大腸桿菌數(shù)在發(fā)酵后期有少量下降,但也明顯高于發(fā)酵劑組。在發(fā)酵初期,魚糜中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì),且水分含量高,適宜微生物的生長,接種混合發(fā)酵劑后,隨著時間的延長,乳酸菌表現(xiàn)出較高的競爭性,由7.96 log CFU/g上升到10.48 log CFU/g,后穩(wěn)定在8.6 log CFU/g以上。乳酸菌利用原料中的碳水化合物快速生長繁殖,產(chǎn)生乳酸,使得pH快速降低,較低的pH能有效抑制葡萄球菌、假單胞菌和腸科桿菌等雜菌的生長[18-19]。對照組中乳酸菌生長緩慢,產(chǎn)酸速率低,在36 h時菌落總數(shù)達到8.73 log CFU/g,金黃色葡萄球菌數(shù)為7.80 log CFU/g,假單胞菌數(shù)為3.41 log CFU/g,大腸桿菌數(shù)為7.30 log CFU/g,均高于發(fā)酵劑組。Yin等[18]認為乳酸菌產(chǎn)生有機酸或其他抑菌物質(zhì)能抑制有害雜菌生長。在所選擇的發(fā)酵時間范圍內(nèi),乳酸菌數(shù)量都遠高于其他幾種微生物,發(fā)酵劑組和對照組中芽孢桿菌數(shù)之間無顯著差異,故推斷乳酸菌為草魚魚糜發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌,能有效抑制發(fā)酵過程中腐敗菌和致病微生物的生長,抑制發(fā)酵魚糜制品中的生物胺積累。

3　結論

以丹磺酰氯為衍生劑,1,7-二氨基庚烷為內(nèi)標,在國標的基礎上進行了修改,將檢出限提高至1000 mg/kg,簡化了流動相,并調(diào)整梯度洗脫程序,縮短了目標生物胺衍生物的出峰時間,建立了發(fā)酵草魚魚糜中生物胺的高效液相色譜-紫外檢測方法。使用該方法可將目標生物胺在30 min內(nèi)全部分離,各生物胺衍生物分離效果好,在0.5～100 μg/mL線性范圍內(nèi)的線性關系系數(shù)R2均大于0.999,生物胺回收率在97.35%～103.00%,重現(xiàn)性RSD均小于10%,各目標峰未受到雜峰干擾,方法靈敏可靠。

測定了接種混合發(fā)酵劑的草魚魚糜中生物胺含量和微生物數(shù)量變化,接種混合發(fā)酵劑的草魚魚糜在發(fā)酵過程中腐胺、尸胺、組胺、酪胺含量下降明顯,亞精胺含量有少量下降,乳酸菌為發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌,且能有效抑制葡萄球菌、假單胞菌和腸科桿菌等雜菌的生長。

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Determination of biogenic amines in the fermentation process of grass carp surimi by a high-performance liquid chromatography method

ZENG Ni1,2,JIANG Yong1,2,CHEN Li-li1,2,ZHAO Li1,2,*,BAI Chun-qing1,2,YUAN Mei-lan1,2,WEI Ying1,2

(1.College of Life Science,Jiangxi Science and Technonlgy Normal University,Nanchang 330013,China;2.National Freshwater Fish Processing Technology Research and Development Branch,Nanchang 330013,China)

The effects of one group mixed starter cultures,combined withBacillusnattoandLactobacilluspentosus,and a batch without starter as control on biogenic amines accumulation in the grass carp surimi during fermentation were investigated.Methods of simultaneous determination of six biogenic amines(tryptamine,putrescine,cadaverine,histamine,tyramine,spermine)by high-performance liquid chromatography were developed.The method had a good resolution in 30 minutes and good linearity(R2>0.999),the recovery rate was between 97.35%～103.00%,and the RSD of precision,repeatability were all lower than 10%.Fermentation inoculated with mixed starter cultures can inhibited the growth of contaminant microoroganisms,such asStaphylococcusaureus,EnterobacteriaceaeandPseudomonas, and suppressed the accumlation of putrescine,cadaverine,histamine,tyramine.In order to improve hygienic quality of fermented surimi,Bacillusnatto,Lactobacilluspentosuswere added to activate the function of negative-decarboxylase which can prevent biogenic amine formation,inhibited the spoilage bacteria and pathogens.

high-performance liquid chromatography;biogenic amines;grass carp surimi;mixed starter cultures;microbiological analysis

2015-10-16

曾妮(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：微生物學，E-mail:15170071552@163.com。

趙利(1967-)，女，博士，教授，研究方向：食品化學，E-mail:lizhao618@hotmail.com。

江西省高等學校科技落地計劃項目(KJLD12009)；國家農(nóng)業(yè)科技成果轉化項目(國科辦農(nóng)[2014]42號)；江西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項資金資助。

TS254

B

1002-0306(2016)09-0117-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.015