雞重組α-干擾素凍干粉劑的凍干保護(hù)劑的篩選

姜正軍，康　梅，王少娟，黃　金,2，*

(1.山東華辰生物科技有限公司,山東濰坊 261061;2.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院,浙江杭州 310014)

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雞重組α-干擾素凍干粉劑的凍干保護(hù)劑的篩選

姜正軍1，康梅1，王少娟1，黃金1,2，*

(1.山東華辰生物科技有限公司,山東濰坊 261061;2.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院,浙江杭州 310014)

以獲得適宜于制備雞重組α-干擾素凍干粉劑的凍干保護(hù)劑為目標(biāo),通過凍干保護(hù)劑的篩選及凍干保護(hù)劑濃度的優(yōu)化,確定了最優(yōu)的凍干保護(hù)劑配方和裝液量等工藝參數(shù)。結(jié)果顯示:在最優(yōu)配方(甘露醇(3%)+PEG(3%))和最佳的裝液量(40%)條件下,凍干粉劑外觀呈海綿狀、表面平整、體積與凍結(jié)時(shí)的體積基本一致,顏色均勻,無起泡現(xiàn)象,復(fù)水迅速而完全。通過生物活性穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn),證明在最優(yōu)條件下制備的雞重組α-干擾素凍干粉的生物學(xué)效價(jià)較為穩(wěn)定(40 ℃條件下貯藏12個(gè)月,生物活性無變化)。最終獲得的凍干保護(hù)工藝,對(duì)雞重組α-干擾素凍干粉劑工業(yè)化生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)和借鑒意義。

雞α-干擾素,凍干保護(hù)劑,優(yōu)化,篩選

干擾素(Interferon)是一類由病毒誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的,具有干擾病毒在感染和非感染組織中復(fù)制的一類小分子蛋白,具有廣譜、高效和非特異性的作用特點(diǎn)。自從1957年Isaacs等在病毒感染的雞胚中發(fā)現(xiàn)了干擾素,到目前為止,干擾素一直是抗腫瘤和非特異性治療和抑制病毒的首選藥[1]。隨著我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和獸藥研究的不斷深入,干擾素已普遍應(yīng)用于畜禽各種疾病感染治療和預(yù)防。

研究已經(jīng)證實(shí):凍干粉劑具備價(jià)格低、藥效迅速、使用方便等生物新劑型特點(diǎn),研制和開發(fā)凍干粉劑已成為畜禽用干擾素的發(fā)展趨勢[2-4]。不同生物制劑中活性成分的分子結(jié)構(gòu)各不相同,所要求的凍干保護(hù)劑種類與濃度也各不相同,保護(hù)劑的種類與濃度決定著凍干產(chǎn)品的有效性和穩(wěn)定性[5-7]。到目前為止,尚未尋找到通用的凍干保護(hù)劑,能適用于所有生物制劑的凍干。目前,生物藥品凍干常用的凍干保護(hù)劑主要有蛋白質(zhì)類(人血清蛋白、白明膠)、氨基酸類(甘氨酸、精氨酸、丙氨酸)、醇類(甘露醇、聚乙二醇)、碳水化合物類(單糖、雙糖和多聚糖)和其他(礦物質(zhì)、表面活性劑、多聚物、緩沖鹽)[8-9]。

表1　單一和復(fù)合保護(hù)劑的篩選Table 1　Screening of the lyophilized protective

本研究通過凍干保護(hù)劑的篩選及凍干保護(hù)劑濃度的優(yōu)化,確定凍干保護(hù)劑的最優(yōu)配方。繼而通過裝液量的優(yōu)化和生物活性穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn),最終獲得凍干保護(hù)工藝,以期解決制約雞重組α-干擾素凍干粉劑制備的難題,對(duì)雞重組α-干擾素凍干粉劑工業(yè)化生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)和借鑒意義。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

雞重組α-干擾素原液山東華辰生物科技有限公司;水泡性口炎病毒(VSV)病毒株山東華辰生物科技有限公司研發(fā)中心;SPF雞胚山東華辰生物科技有限公司;凍干保護(hù)劑蔗糖、甘露醇、右旋糖酐、精氨酸、海藻糖、吐溫80、PEG及其他化學(xué)試劑均為化學(xué)純國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;脫脂乳蒙牛乳業(yè)集團(tuán)。

LaboGene CoolSafe 110-4冷凍干燥機(jī)丹麥LaboGene公司;DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;BHC-1300IIB2超凈工作臺(tái)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.2凍干方法

將一定濃度的凍干保護(hù)劑加入0.9%的氯化鈉溶液中進(jìn)行溶解,進(jìn)行過濾除菌,進(jìn)行單獨(dú)或混合配制成不同成分及含量的保護(hù)劑。凍干方法參照參考文獻(xiàn)[2],并有所改進(jìn)。在超凈工作臺(tái)內(nèi),將一定量的預(yù)先制備的保護(hù)劑與干擾素樣品按1∶1比例加入西林瓶中(干擾素的抗病毒活性為1×105IU/mL,初始總體積為1.0 mL/瓶),置-50 ℃預(yù)凍4～6 h,-40～-7 ℃自然抽真空干燥24 h,再逐漸升溫至10 ℃,保持3 h。

1.3分析方法

1.3.1溶解度測定每批樣品各取3支,分別向每支制劑中加入1 mL蒸餾水,記錄從開始至透明且無不溶物的時(shí)間。

1.3.2生物學(xué)活性測定以抗病毒活性為其生物活性測定的目標(biāo),所用細(xì)胞和病毒由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)贈(zèng)送,細(xì)胞為雞胚成纖維細(xì)胞(CEF),病毒為水泡性口炎病毒(VSV)。測定方法參照參考文獻(xiàn)[10]的抗病毒活性測定方法。

2　結(jié)果與討論

2.1凍干保護(hù)劑的篩選

在已有報(bào)道的凍干保護(hù)劑中選取蔗糖、甘露醇、右旋糖酐、精氨酸、海藻糖、脫脂乳作為單一保護(hù)劑,選取蔗糖、甘露醇、右旋糖酐與PEG或吐溫進(jìn)行復(fù)配制成復(fù)合保護(hù)劑,進(jìn)行了凍干保護(hù)劑的篩選,結(jié)果如表1所示。經(jīng)凍干后,從外觀來看蔗糖、海藻糖、蔗糖+吐溫80、甘露醇+吐溫80外觀均出現(xiàn)不同程度的氣泡或分層現(xiàn)象。從抗病毒活性角度看,右旋糖酐、精氨酸、脫脂乳、右旋糖酐(5%)+吐溫80(0.2%)、甘露醇(5%)+PEG(3%)、右旋糖酐(5%)+PEG(3%)的保護(hù)效果較好,凍干粉生物學(xué)活性顯著高于其他保護(hù)劑(p<0.05)。但從外觀、溶解度和凍干粉的生物學(xué)活性角度綜合考慮,最終選擇甘露醇和PEG的復(fù)合保護(hù)劑作為凍干保護(hù)劑。

2.2凍干保護(hù)劑濃度及裝液量的優(yōu)化

凍干保護(hù)劑中的低分子物質(zhì)可有效緩解水分子對(duì)生物活性物質(zhì)的副作用[11-12],并能使凍干生物制品仍含有一定量水分,還可促進(jìn)高分子物質(zhì)形成骨架,使凍干制品呈多孔的海綿狀,從而增加溶解度。低分子物質(zhì)主要包括糖類和氨基酸類等。高分子物質(zhì)在凍干生物制品中主要起骨架作用,防止低分子物質(zhì)的碳化和氧化,保護(hù)活性物質(zhì)不受加熱的影響,使凍干制品形成多孔性,疏松的海綿狀物,從而使溶解度增加,如聚乙二醇等聚合物。凍干保護(hù)劑濃度及西林瓶裝液量直接影響凍干后制品的外觀和溶解度等,并最終影響生物活性。基于此,在確定甘露醇和PEG的復(fù)合保護(hù)劑為凍干保護(hù)劑的基礎(chǔ)上,進(jìn)行了凍干保護(hù)劑配比濃度和西林瓶(20 mL)裝液量的優(yōu)化。

首先從產(chǎn)品成本控制角度對(duì)凍干保護(hù)劑配比濃度進(jìn)行分組(如表2所示),繼而進(jìn)行凍干實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明:與對(duì)照組比較,隨著甘露醇和PEG的濃度降低,凍干粉的生物活性在不斷降低,與對(duì)照組比較,甘露醇(3%)+PEG(3%)組的生物活性較對(duì)照組活性降低幅度不顯著(p>0.05)因此從產(chǎn)品成本控制角度,選擇的凍干保護(hù)劑配比濃度。

表2　凍干保護(hù)劑配比濃度分組Table 2　Definition the lyophilized protective concentration

注:從產(chǎn)品成本控制角度進(jìn)行分組。

圖1　凍干保護(hù)劑濃度 對(duì)雞重組α-干擾素凍干粉劑制備的影響Fig.1　Effects of the lyophilized protectant concentration on the production of lyophilized recombinant chicken α-interferon

其次,在凍干保護(hù)劑配方確定的基礎(chǔ)上,對(duì)西林瓶的裝液量進(jìn)行了優(yōu)化。由圖2可看出,裝液量在30%和40%,生物學(xué)活性變化不顯著(p>0.05),但30%裝液量的凍干粉劑有明顯的掛壁現(xiàn)象,產(chǎn)品外觀存在明顯缺陷,不適宜進(jìn)行市場銷售。隨著裝液量的增加凍干粉的生物學(xué)活性有了大幅度下降,因此選擇40%作為最終的裝液量標(biāo)準(zhǔn)。從最終凍干粉劑的外觀來看(如圖3所示),均呈現(xiàn)海綿狀、表面平整、體積與凍結(jié)時(shí)的體積基本一致,顏色均勻,無起泡現(xiàn)象,復(fù)水迅速而完全(30 s內(nèi)復(fù)水為合格)。

圖2　裝液量對(duì)雞重組α-干擾素凍干粉劑制備的影響Fig.2　Effects of medium volume on the production of lyophilized recombinant chicken α-interferon

圖3　雞重組α-干擾素凍干粉劑外觀圖Fig.3　Lyophilized power image of recombinant chicken α-interferon

2.3生物活性穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將凍干后的樣品,分別置于4、37、40 ℃條件下進(jìn)行生物活性穩(wěn)定性追蹤實(shí)驗(yàn),結(jié)果如表3所示,從定期取樣測定生物活性的結(jié)果可以看出,一年內(nèi),無論在4 ℃還是在40 ℃(常規(guī)加速實(shí)驗(yàn)溫度),樣品的生物活性均變化不顯著(p>0.05),該結(jié)果亦表明凍干保護(hù)劑的選擇是恰當(dāng)?shù)摹?/p>

表3　凍干樣品的生物活性穩(wěn)定性考察Table 3　Biological activity stability of lyophilized recombinant chicken α-interferon

3　結(jié)論

本研究通過凍干保護(hù)劑的篩選及凍干保護(hù)劑濃度的優(yōu)化,確定凍干保護(hù)劑的最終配方(甘露醇(3%)+PEG(3%)),繼而確定了最佳的裝液量(40%)。凍干粉劑外觀呈海綿狀、表面平整、體積與凍結(jié)時(shí)的體積基本一致,顏色均勻,無起泡現(xiàn)象,復(fù)水迅速而完全(30 s內(nèi)復(fù)水為合格)。通過生物活性穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn),40 ℃條件下貯藏12個(gè)月,生物活性無明顯變化,證明凍干保護(hù)劑的選擇是恰當(dāng)?shù)?。最終獲得的凍干保護(hù)工藝對(duì)雞重組α-干擾素凍干粉劑工業(yè)化生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)和借鑒意義。

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Screening of the lyophilized protectant for recombinant chicken alpha-interferon preparation

JIANG Zheng-jun1,KANG Mei1,WANG Shao-juan1,HUANG Jin1,2,*

(1.Shandong Huachen Bio-tech Co.,Ltd,Weifang 261061,China;2.Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310014,China)

In order to achieve excellent component of lyophilized protectant for chicken alpha-interferon production,lyophilized protectants were screened at first. Secondly,the concentration of protectants and the medium volume were optimized. As the results showed,the mannitol and PEG were selected as the best lyophilized multi-protectants and the concentrations were defined as 3% and 3% respectively. And with the optimized medium volume of 40%,the physical appearance was sponginess and uniform,tabulated,bubble-free and quickly soluble. Under the optimized conditions,the lyophilized recombinant chicken alpha interferon was harvested. The anti-virus activity of alpha-interferon showed no significant difference after 12 months under the temperature at about 40 ℃. This process was successfully established and could be advantageous to its application for chicken alpha interferon production.

chicken alpha-interferon;lyophilized protectant;optimization;screening

2015-08-31

姜正軍(1971-)，男，碩士，高級(jí)工程師，研究方向：E-mail:sinostar5555@gmail.com。

黃金(1979-)，男，博士，副教授，研究方向：蛋白類藥物,E-mail:huangjin979@zjut.edu.cn。

山東省2011年科技發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目(2011GGH22109)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)09-0089-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.009