1,4-二氫吡啶類化合物對(duì) CHO-K1細(xì)胞的輻射防護(hù)作用

張宇睿 薛虛慧 李園園 徐文清

（北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院&中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所 天津市放射醫(yī)學(xué)與分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津 300192）

1,4-二氫吡啶類化合物對(duì) CHO-K1細(xì)胞的輻射防護(hù)作用

張宇睿 薛虛慧 李園園 徐文清

（北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院&中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所 天津市放射醫(yī)學(xué)與分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津 300192）

為探究1，4-二氫吡啶類化合物對(duì)于CHO-K1細(xì)胞的體外防護(hù)活性，實(shí)驗(yàn)分為DHP（2，6-二甲基-3，5-二乙酯基-l，4-二氫吡啶）給藥照射組（DHP）、單純照射組（Rad）和對(duì)照組（Con）。采用中性紅法測(cè)定DHP對(duì)CHO-K1細(xì)胞的細(xì)胞毒性和照射后細(xì)胞的存活率；DCFH-DA法檢測(cè)活性氧（Radical oxidative spices， ROS）水平；彗星實(shí)驗(yàn)測(cè)定DNA損傷情況。通過(guò)以上指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)DHP的輻射防護(hù)活性。結(jié)果顯示，與Con相比，Rad的ROS水平、DNA百分含量和尾距等指標(biāo)均上升，并且ROS探針熒光強(qiáng)度達(dá)到1 800，尾部DNA含量和尾距分別達(dá)到3.5%和1.7%，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05），提示照射后CHO-K1細(xì)胞中產(chǎn)生了過(guò)多的ROS和DNA鏈斷裂損傷。與Rad相比，DHP的ROS探針熒光強(qiáng)度降為945、尾部DNA含量和尾距分別降為0.83%和0.7%，3個(gè)指標(biāo)均明顯降低，其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05），提示DHP給藥能顯著降低照射引起的CHO-K1細(xì)胞ROS水平升高，通過(guò)清除照射產(chǎn)生的過(guò)多ROS，減輕照射所致的DNA損傷，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。這說(shuō)明DHP具有良好的輻射防護(hù)作用。

1，4-二氫吡啶類化合物，輻射防護(hù)劑，活性氧自由基，CHO-K1細(xì)胞

CLC R96， TL7

隨著電離輻射在核能、醫(yī)療診斷、工業(yè)探傷以及放射性同位素方面的應(yīng)用與發(fā)展，電離輻射與人類的關(guān)系越來(lái)越密切。人們接觸到低劑量電離輻射是不可以避免的，低劑量射線可以使體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)多的活性氧（Radical oxidative species， ROS），進(jìn)一步損傷體內(nèi)具有生物功能的蛋白質(zhì)和核酸等大分子。高劑量電離輻射不僅可以產(chǎn)生過(guò)多ROS，而且還可以造成DNA分子斷裂，這些損傷會(huì)通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路放大，從而對(duì)細(xì)胞和組織造成不可逆的損傷［1］。早在20世紀(jì)60年代科研人員就已經(jīng)致力于開(kāi)發(fā)有效的輻射防護(hù)藥物，在過(guò)去幾十年里，以氨磷汀為代表的巰基類化合物顯示出了較強(qiáng)抗輻射活性且僅有氨磷汀上市，但由于毒副作用大，限制了其臨床應(yīng)用。

1，4-二氫吡啶類化合物（2，6-二甲基-3，5-二乙酯基-l，4-二氫吡啶，簡(jiǎn)稱DHP）是一種傳統(tǒng)的鈣離子通道拮抗劑［2］，該類化合物在治療高血壓方面發(fā)揮了不可替代的作用，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖 1。硝苯地平為1971年上市的第一代二氫吡啶類鈣離子拮抗劑，其在臨床上主要作為冠脈舒張藥。在這之后，人們先后研制出了第二代鈣離子拮抗劑如尼莫地平、尼索地平，第三代鈣離子拮抗劑拉西地平和氨氯地等二氫吡啶類藥物。第二代和第三代因具有起效快、持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)和選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)而得到了廣泛的應(yīng)用［3-4］。二氫吡啶環(huán)為二氫吡啶類抗高血壓藥物的母核及活性藥效團(tuán)，同時(shí)也是輔酶NADH的母環(huán)結(jié)構(gòu)的一部分［5］。而輔酶NADH是體內(nèi)的還原性輔酶，能夠?qū)湄?fù)離子轉(zhuǎn)移給具有氧化性的自由基，達(dá)到清除自由基的作用。

1　材料與方法

1.1材料

DHP（批號(hào)：D3375，TCI公司），CHO-K1細(xì)胞（本實(shí)驗(yàn)室凍存），PBS（Hyclone公司），中性紅（Solarbio公司），雙抗（Solarbio公司），血清（美國(guó)Gibco公司），DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Hyclone公司），胰酶（美國(guó)Gibco公司），2'，7'-二氯二氫熒光素二乙酯（DCFH-DA，美國(guó)sigma公司），乙醇（天津市江天化工有限責(zé)任公司），分析天平（Sartorius BS124s），多功能酶標(biāo)儀（型號(hào)：Infinite F200，Tecan公司），熒光顯微鏡（型號(hào)：Nikon 90i，日本Nikon公司），137Cs源（加拿大GammaⅡ40型）。

1.2細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)分為 3組，分別為 DHP給藥照射組（DHP），單純照射組（Rad）和對(duì)照組（Con）。本實(shí)驗(yàn)用中性紅法評(píng)價(jià)DHP對(duì)CHO-K1細(xì)胞的毒性［6］。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔4 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁過(guò)夜，將原培養(yǎng)液換為分別含0、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L DHP的新鮮培養(yǎng)基，每組設(shè)置 5個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24 h和48 h。終止培養(yǎng)前，移去含有藥液的培養(yǎng)基，加入 100 μL飽和中性紅培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱孵育2 h 后棄去中性紅培養(yǎng)液，用150 μL PBS洗滌2次，甩干PBS，加入150 μL中性紅溶解液（乙酸：乙醇：水的體積比=1：50：49），震蕩3 min，用酶標(biāo)儀在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值（A），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3照射后細(xì)胞存活率

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的CHO-K1細(xì)胞以每孔4 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，按照上述方法分組，分別置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)貼壁過(guò)夜，照射前30 min，分別給含0、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L DHP的新鮮培養(yǎng)基每孔100 μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，分別給予γ射線照射（吸收劑量4 Gy，劑量率0.98 Gy/min），于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，移去培養(yǎng)液，然后每孔加入 100 μL飽和的中性紅培養(yǎng)液于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，使細(xì)胞充分?jǐn)z取中性紅，吸出中性紅培養(yǎng)液，用150 μL PBS洗滌2次，洗去未吸收的殘留中性紅，甩干PBS，加入150 μL中性紅溶解液（乙酸：乙醇：水的體積比=1：50：49），震蕩3 min，用酶標(biāo)儀在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A）值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4活性氧清除能力測(cè)定

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的CHO-K1細(xì)胞以每孔10 000個(gè)細(xì)胞接種在6孔板內(nèi)，按照上述方法分組，分別置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，照射前30 min加入含10-4mol/L DHP 的新鮮培養(yǎng)液，每孔1 mL，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。采用γ射線照射（吸收劑量4 Gy，劑量率0.98 Gy/min），并于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，移去含有藥液的培養(yǎng)液，加入濃度為5 μmol/L 2'，7'-二氯二氫熒光素二乙酯（DCFH-DA）培養(yǎng)液1 mL，避光37 ℃孵育20 min，移去DCFH-DA培養(yǎng)液，用PBS洗滌3次，一部分用胰酶消化收集細(xì)胞，吹打均勻后取200 μL，用酶標(biāo)儀在488 nm激發(fā)波長(zhǎng)，525 nm發(fā)射波長(zhǎng)條件下測(cè)定熒光強(qiáng)度［7］；另一部分直接在倒置熒光顯微鏡實(shí)驗(yàn)下拍攝圖片，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5彗星實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的CHO-K1細(xì)胞，按照上述方法分組，分別加入不含DHP的新鮮培養(yǎng)基和含有10-4mol/L DHP新鮮DHP培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，采用γ射線照射（吸收劑量4 Gy，劑量率0.98 Gy/min）。 制作正常熔點(diǎn)凝膠； 取5×105個(gè)/mL細(xì)胞懸液體20 μL與60 μL低熔點(diǎn)凝膠（7.5%）混勻后滴于第一層上；堿性裂解液中 4 ℃裂解2.5 h；電泳液中4 ℃解旋20 min；4 ℃條件下電泳20 min （30 V， 40 mA）；4 ℃下用中和液中和20 min。溴化乙錠（EB， 2 μg/mL）染色1 min，去離子水漂洗，去掉多余染液，于熒光顯微鏡（40倍物鏡）下觀察彗星，用圖像傳感器對(duì)每份樣品隨機(jī)拍攝100個(gè)彗星圖像。采用波蘭弗羅茨瓦夫大學(xué)提供的CASP慧星分析軟件系統(tǒng)對(duì)所得彗星圖像進(jìn)行分析，觀察彗星尾部DNA百分比和Olive尾矩指標(biāo)［8］。

1.6數(shù)據(jù)處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，數(shù)據(jù)以x±s表示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果與討論

2.1細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

CHO-K1細(xì)胞經(jīng)γ射線照射后24 h、48 h，中性紅法測(cè)得結(jié)果（圖2）可知，不同濃度的DHP處理后細(xì)胞活力值均在 90%以上，提示 DHP對(duì)于CHO-K1細(xì)胞的毒性較低。γ射線照射至吸收劑量為4 Gy后48 h的CHO-K1細(xì)胞活力值均高于24 h 的CHO-K1細(xì)胞活力值，且照射后48 h的細(xì)胞活力值均在100%以上，提示在48 h內(nèi)DHP可能促進(jìn)了CHO-K1細(xì)胞的損傷恢復(fù)，從而發(fā)揮促細(xì)胞生長(zhǎng)作用。由于10-4mol/L的DHP處理時(shí)，其細(xì)胞活力值較其他濃度好，我們選取10-4mol/L作為下一步實(shí)驗(yàn)的給藥濃度。

DHP作為一種低毒的化合物，它能夠有效地清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧，防止細(xì)胞的氧化應(yīng)激，且二氫吡啶環(huán)是體內(nèi)NADH酶的活性基團(tuán)，能夠在生理環(huán)境下還原氧化性的大分子物質(zhì)，保持體內(nèi)諸如谷胱甘肽、類脂和蛋白的生物活性，因此，它能在正常條件下促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中出現(xiàn)的 γ射線照射后 48 h的 CHO-K1細(xì)胞活力值均高于100%，DHP可能促進(jìn)了CHO-K1細(xì)胞的損傷恢復(fù)，其發(fā)揮的促細(xì)胞生長(zhǎng)作用很可能是通過(guò)清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧實(shí)現(xiàn)的。為進(jìn)一步驗(yàn)證此猜測(cè)，我們進(jìn)行了活性氧清除能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)。

此外，DHP能促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育，提高生產(chǎn)性能和繁殖性能，增強(qiáng)免疫功能；而且飼喂安全，已被廣泛用于飼料的添加劑。DHP雖然屬于二氫吡啶鈣離子通道阻滯劑，但由于4位上沒(méi)有取代基，從該類化合物的構(gòu)效關(guān)系可以看出［9］，與傳統(tǒng)的4位芳基取代二氫吡啶化合物相比，DHP與鈣離子通道結(jié)合能力減弱，降壓的活性也非常弱，因此，可以作為一種高效安全的輻射防護(hù)藥物。

2.2照射后細(xì)胞存活率

照前30 min給藥，CHO-K1細(xì)胞經(jīng)γ射線照射后24 h結(jié)果顯示，10-4、10-5、10-6、10-7mol/L的DHP與Rad的細(xì)胞存活率相比均有所提高，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05），且在 10-4mol/L濃度時(shí)，CHO-K1細(xì)胞的存活率最高（圖3）。

2.3活性氧清除能力測(cè)定

DCFH-DA是一種不具有熒光性能，但能透過(guò)細(xì)胞膜裝載在細(xì)胞內(nèi)的活性氧探針，該化合物進(jìn)入細(xì)胞中初步代謝成為2'，7'-二氯二氫熒光素，當(dāng)ROS與其相遇時(shí)就會(huì)將其氧化為 2'，7'-二氯熒光素呈現(xiàn)綠色熒光。我們將給藥組、照射組和對(duì)照組同時(shí)用探針處理后，一部分用熒光顯微鏡拍照，另一部分通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度。

細(xì)胞照射后24 h后，ROS探針熒光強(qiáng)度顯示為1 800，與Rad相比，CHO-K1細(xì)胞照前30 min給予10-4mol/L DHP并經(jīng)γ射線照射后24 h結(jié)果顯示，ROS含量降低為Rad的二分之一，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05），提示照射后CHO-K1細(xì)胞中產(chǎn)生了過(guò)多ROS。與DHP的ROS含量相比，Rad 的ROS水平的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05），提示DHP給藥能顯著降低照射引起CHO-K1細(xì)胞ROS水平升高，通過(guò)清除照射產(chǎn)生過(guò)多ROS，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用（圖4）。

DHP的核心結(jié)構(gòu)是二氫吡啶環(huán)，二氫吡啶是體內(nèi)還原型輔酶NADH的藥效團(tuán)，NADH是體內(nèi)重要的遞氫體，參與氧化呼吸和合成代謝過(guò)程中的電子傳遞，且能夠保持體內(nèi)谷胱甘肽的還原態(tài)，在細(xì)胞生命活動(dòng)中有著不可替代的作用。

DHP能夠有效地模仿NADH輔酶在體內(nèi)的活性。首先，二氫吡啶環(huán)作為一種高效低毒的遞氫體，能夠有效地中和體內(nèi)的ROS；其次，作為一種參與體內(nèi)各種代謝活動(dòng)的電子傳遞體，能夠協(xié)助參與細(xì)胞的各種信號(hào)通路，使細(xì)胞各種代謝維持在正常水平；最后，它能夠幫助維持體內(nèi)某些分子的正常還原態(tài)，如谷胱甘肽、過(guò)氧化氫酶和超氧化物歧化酶的還原性，從而確保體內(nèi)清除氧化應(yīng)激系統(tǒng)的正?；钚裕?0］。

2.4彗星實(shí)驗(yàn)

彗星實(shí)驗(yàn)是用來(lái)檢測(cè)有核細(xì)胞DNA損傷的技術(shù)，可在單個(gè)細(xì)胞水平上檢測(cè)DNA損傷程度。與Con相比，CHO-K1細(xì)胞照前30 min給予10-4mol/L DHP并經(jīng)γ射線照射后24 h，尾部DNA百分含量由原來(lái)的3.5%降低到0.83%，尾距由1.7%降低到0.7%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05），提示照射后CHO-K1細(xì)胞中DNA鏈被射線損傷，DNA損傷顯著增多，DHP給藥能顯著減輕照射引起的CHO-K1細(xì)胞DNA損傷，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用（圖5）。

3　結(jié)論

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，CHO-K1細(xì)胞在各種濃度的DHP中生存率基本接近100%，說(shuō)明DHP對(duì)于正常的 CHO-K1細(xì)胞的生長(zhǎng)基本沒(méi)有毒副作用；ROS實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給藥組的ROS水平相比照射組降低了一半，并且基本達(dá)到了照射前細(xì)胞中的ROS水平，說(shuō)明DHP能夠有效地清除照射后細(xì)胞中過(guò)多的ROS；彗星實(shí)驗(yàn)指標(biāo)中，給藥后細(xì)胞核尾部DNA含量較照射組降低了約4倍，尾距較照射組降低了2倍，結(jié)果表明，DHP發(fā)揮了良好的細(xì)胞輻射防護(hù)作用。

電離輻射會(huì)導(dǎo)致有機(jī)生物體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)多自由基，通過(guò)直接或者間接作用攻擊生物體內(nèi)的生物大分子，如蛋白質(zhì)、DNA和類脂膜，活化相關(guān)的激酶和信號(hào)分子，進(jìn)一步激活相關(guān)信號(hào)通路，破壞機(jī)體氧化還原平衡，引起放射性損傷。

外源性給予抗氧化劑能夠有效地幫助細(xì)胞清除產(chǎn)生的ROS，減輕細(xì)胞受到的射線損傷，從而及時(shí)維持細(xì)胞的正常狀態(tài)。DHP的低毒性又能夠給予大劑量給藥并作為外源性的抗氧劑，對(duì)于ROS的清除有著至關(guān)重要的作用。本研究采用的DHP作為一種高效低毒的抗氧化劑，能夠有效地抑制照射后細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧自由基，降低活性氧對(duì)于DNA的損傷并提高細(xì)胞的存活率。

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8邢曉萌， 王彥， 杜利清， 等. 白藜蘆醇對(duì)肺癌 A549 細(xì)胞的放射增敏作用及其機(jī)制研究［J］. 輻射研究與輻射工藝學(xué)報(bào)， 2014， 32（6）: 060203. DOI: 10.11889/j.1000-3436. 2014.rrj.32.060203. XING Xiaomeng， WANG Yan， DU Liqing， et al. Study on radiosensitization effect and mechanism of resveratrol on lung A549 cells［J］. Journal of Radiation Research and Radiation Processing， 2014， 32（6）: 060203. DOI: 10. 11889/j.1000-3436. 2014.rrj.32.060203.

9Miyashita K， Nishimotoa M， Ishino T， et al. Studies on novel and chiral 1，4-dihydropyridines. V. Hantzsch-type 1，4-dihydropyridines having a chiral sulfinyl group: syntheses， structures， and biological activity as a calcium channel antagonist［J］. Tetrahedron， 1997， 53（12）: 4279-4290.

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Radioprotective effect of 1,4- dihydropyridine in CHO-K1 cell

ZHANG Yurui XUE Xuhui LI Yuanyuan XU Wenqing
(Tianjin Key Laboratory of Radiation Medicine and Molecular Nuclear Medicine, Institute of Radiation Medicine, Peking Union Medical College & Chinese Academy of Medical Science, Tianjin 300192, China)

The aim is to study the radiation protection effect of 1，4-dihydropyridine in CHO-K1 cell. There were three groups which were DHP treated group， radiation group and control group， respectively. Diethyl 2，6-dimethyl-1，4-dihydropyridine-3，5-dicarboxylate （DHP） cell viability and cell cytotoxicity were measured by neutral red assay， DCFH-DA was used to test the level of reactive oxygen species （ROS） and comet assay was adopted to measure DNA damages. Radioprotective activity was evaluated by these three indices. The fluorescence intensity of DCF was 1 800， tail DNA and tail moment were 3.5% and 1.7% in radiation group， which significantly increased （p＜0.05） compared with control group. The results indicated that radiation could produce more ROS to cause DNAdamage. The fluorescence intensity of DCF was 945， tail DNA and tail moment were 0.83% and 0.7% in DHP treated group， which significantly decreased （p＜0.05） compared with radiation group. The results indicated that radiation could induce DNA damage and DHP could relief this injury to DNA. It can be concluded that DHP could protect cell against radiation-induced damage in CHO-K1 cell.

ZHANG Yurui （male） was born in November 1991， and graduated from Hebei Medical University in 2014. Now he is a master candidate in the Institute of Radiation Medicine， Chinese Academy of Medical Sciences

18 March 2016； accepted 28 April 2016

1，4-dihydropyridine， Radioprotector， Reactive oxygen species， CHO-K1 cell

XU Wenqing， professor， E-mail: xuwenqing@irm-cams.ac.cn

R96，TL7

10.11889/j.1000-3436.2016.rrj.34.040601

國(guó)家自然科學(xué)基金（81273005）、天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（14JCZDJC36400）、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所發(fā)展基金項(xiàng)目（SF1528）資助

張宇睿，男，1991年11月出生，2014年畢業(yè)于河北醫(yī)科大學(xué)，現(xiàn)為中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所藥物化學(xué)專業(yè)碩士研究生

徐文清，研究員，E-mail: xuwenqing@irm-cams.ac.cn

初稿2016-03-18；修回2016-04-28

Supported by National Natural Science Foundation of China （81273005）， Tianjin Municipal Science and Technology Commission （14JCZDJC36400） and the IRM-CAMS Research Fund （SF1528）