響應(yīng)面法優(yōu)化植物乳桿菌高密度發(fā)酵參數(shù)

周金雨,龐雪輝,吳　桐,張秋雪,孟祥晨

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150030)

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響應(yīng)面法優(yōu)化植物乳桿菌高密度發(fā)酵參數(shù)

周金雨,龐雪輝,吳桐,張秋雪,孟祥晨*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150030)

本研究應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化植物乳桿菌KLDS 1.0391的高密度發(fā)酵參數(shù)。以玉米漿粉為培養(yǎng)基,活菌數(shù)為指標(biāo),在單因素實驗基礎(chǔ)上,采用中心組合實驗設(shè)計優(yōu)化發(fā)酵溫度、發(fā)酵pH以及接種量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)三個因素對發(fā)酵液中活菌數(shù)影響大小依次為:發(fā)酵溫度>接種量>pH;獲得的最優(yōu)發(fā)酵參數(shù)為:發(fā)酵溫度為34.7 ℃、pH為6.2、接種量為3.1%。在此條件下,發(fā)酵11 h后,發(fā)酵液中的活菌數(shù)達(dá)到9.58 lg CFU/mL,與模型預(yù)測值的相對誤差為1.33%,差異不顯著。說明所建立的模型能夠較好地反映實際發(fā)酵情況。

植物乳桿菌,響應(yīng)面,高密度培養(yǎng),發(fā)酵條件優(yōu)化

植物乳桿菌是常用的益生菌之一,在發(fā)酵乳制品、肉、蔬菜和飼料等中應(yīng)用廣泛,通常作為發(fā)酵劑或者附屬發(fā)酵劑使用,植物乳桿菌的高密度發(fā)酵是生產(chǎn)植物乳桿菌粉進(jìn)行應(yīng)用的前提。由于乳酸菌對環(huán)境和營養(yǎng)的需求比較苛刻,因此適宜的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件對菌種的良好生長至關(guān)重要。影響乳酸菌生長的條件很多,包括發(fā)酵溫度、pH、接種量、溶氧量等。針對乳酸菌及其代謝產(chǎn)物(如乳酸、細(xì)菌素等),多采用分批或分批補料方式發(fā)酵[1-7],Hwang等人曾使用分批補料方法發(fā)酵植物乳桿菌LP02,使細(xì)胞干重從2.53 g/L達(dá)到10.12 g/L[8]。Hwang等人將葡萄糖、酵母膏和玉米漿作為高密度培養(yǎng)基的成分,并對其進(jìn)行了優(yōu)化,使植物乳桿菌Pi06的細(xì)胞干重達(dá)到8.94 g/L[9]。Zixing Dong等人對唾液乳桿菌BBE 09-18高密度培養(yǎng)基(碳源、氮源和生長因子)等進(jìn)行了優(yōu)化,最終選擇葡萄糖、酵母膏和吐溫-80作為培養(yǎng)基的主要成分,使其最終菌濃度達(dá)到9.77 log CFU/mL[10]。上述這些研究通過優(yōu)化培養(yǎng)基和發(fā)酵參數(shù)提高了發(fā)酵時的菌體密度。在這些研究中,大多使用MRS培養(yǎng)基[9-12]進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)酵參數(shù)也基本設(shè)定為:發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵pH為6.0、接種量3%[13-14],采用這樣的條件,發(fā)酵后的活菌數(shù)在9.53[15]～12.48 lg CFU/mL[16]范圍內(nèi)。雖然MRS培養(yǎng)基能夠獲得比較好的發(fā)酵效果,但是在成本和處理方便性等方面不及天然培養(yǎng)基,而目前針對植物乳桿菌發(fā)酵用的天然培養(yǎng)基發(fā)酵時間長且報道很有限。

本實驗研究的植物乳桿菌KLDS 1.0391是分離自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品—“焦克”的一株乳酸菌,能代謝產(chǎn)生對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有抑制作用的細(xì)菌素[17],可以作為生物保護(hù)菌種用于食品生產(chǎn)。以直投式發(fā)酵劑形式使用時,需經(jīng)過高密度發(fā)酵、濃縮、干燥等環(huán)節(jié),這些環(huán)節(jié)都會影響最終菌粉的活力。因此針對具有工業(yè)化應(yīng)用潛力的菌株進(jìn)行發(fā)酵參數(shù)的優(yōu)化對于產(chǎn)品的開發(fā)至關(guān)重要。本課題組前期優(yōu)化出了一種用于該菌發(fā)酵的天然培養(yǎng)基——玉米漿粉,本研究以玉米漿粉為培養(yǎng)基,進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

植物乳桿菌KLDS 1.0391乳品科學(xué)教育部重點實驗室(東北農(nóng)業(yè)大學(xué));玉米漿粉山東省濟(jì)寧市雙華工貿(mào)有限公司;其他試劑均為分析純。

KRH-BIO300型發(fā)酵罐控制系統(tǒng)江蘇科海生物工程設(shè)備有限公司;HIRAYAMA HVE-50型高壓滅菌器日本HIRAYAMA公司;BCN1360型生物潔凈工作臺上海佳勝實驗設(shè)備有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1菌種的活化與培養(yǎng)植物乳桿菌KLDS 1.0391于-80 ℃冰箱中冷凍保存,使用前將凍存菌種接種于MRS液體培養(yǎng)基中,活化傳代2次,于37 ℃培養(yǎng)16 h,然后劃線培養(yǎng),37 ℃培養(yǎng)48 h,挑取單菌落,繼續(xù)液體培養(yǎng)。

1.2.2菌落總數(shù)的測定采用平板菌落計數(shù)法[18]。

1.2.3發(fā)酵培養(yǎng)基的制備配制4%(w/v)的玉米漿粉溶液6 L,放入10 L發(fā)酵罐中,然后添加2%乳糖,121 ℃滅菌15 min后,降至發(fā)酵溫度后進(jìn)行發(fā)酵。

1.2.4發(fā)酵條件的優(yōu)化

表1　Central composite實驗因素水平及編碼Table1　Codes and levels of factors in central composite design

1.2.4.1單因素實驗將1.2.3制備的培養(yǎng)基,pH調(diào)為6.0,以3%接種量接種發(fā)酵罐,發(fā)酵溫度分別設(shè)為32、34、36、38和40 ℃。發(fā)酵11 h后,放罐,取樣,測定菌落總數(shù)；pH調(diào)為6.0,發(fā)酵溫度為37 ℃,接種量分別設(shè)為1%、2%、3%、4%和5%。發(fā)酵11 h后,放罐,取樣,測定菌落總數(shù)；將1.2.3制備的培養(yǎng)基,發(fā)酵溫度為37 ℃,接種量為3%,培養(yǎng)基pH分別設(shè)為5.0、5.5、6.0、6.5和7.0。恒pH發(fā)酵11 h后,放罐,取樣,測定菌落總數(shù)。

1.2.4.2響應(yīng)面優(yōu)化實驗根據(jù)單因素實驗結(jié)果,得出的最佳水平,設(shè)計三因素五水平的響應(yīng)面優(yōu)化實驗(見表1),以發(fā)酵溫度(A)、接種量(B)和pH(C)為自變量,以菌落總數(shù)(R)為響應(yīng)值,進(jìn)行中心組合實驗設(shè)計。

1.3數(shù)據(jù)處理

每個實驗重復(fù)3次,運用Design-Expert 8.0.6和Microsoft Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.1.1單因素實驗

2.1.1.1發(fā)酵溫度植物乳桿菌KLDS 1.0391在34 ℃時進(jìn)行發(fā)酵,獲得的活菌數(shù)最高,偏離該溫度時,活菌數(shù)均下降(圖1)。發(fā)酵溫度會直接影響菌體細(xì)胞內(nèi)酶、RNA等的活性。溫度低時,會降低酶活力,引起細(xì)胞膜流動性的變化,從而影響菌體的正常生長。溫度高時,會使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性,影響RNA、核糖體等大分子的穩(wěn)定性。因此,在32～40 ℃范圍內(nèi)選擇實驗點進(jìn)行響應(yīng)面實驗設(shè)計。

圖1　發(fā)酵溫度對植物乳桿菌KLDS 1.0391活菌數(shù)的影響Fig.1　Effect of fermentation temperature on total number of colonies by Lactobacillus plantarum KLDS 1.0391

2.1.1.2發(fā)酵pH發(fā)酵pH5.5時,植物乳桿菌的活菌數(shù)最大,其余均低于該值(圖2)。發(fā)酵pH過高,影響酶的活性,抑制菌體中某些酶的活性,并且還影響細(xì)胞膜所帶電荷的狀態(tài),改變細(xì)胞膜的通透性,影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝產(chǎn)物的排泄,從而阻礙菌體的生長。發(fā)酵pH過低,菌體受酸脅迫的影響較大,所以菌體生長緩慢。因此,在pH5.0～7.0范圍內(nèi)選擇實驗點進(jìn)行響應(yīng)面實驗設(shè)計。

圖2　發(fā)酵pH對植物乳桿菌KLDS 1.0391活菌數(shù)的影響Fig.2　Effect of fermentation pH on total number of colonies by Lactobacillus plantarum KLDS 1.0391

2.1.1.3接種量接種量為3%進(jìn)行發(fā)酵時,獲得的活菌數(shù)最高,其余均低于該值(圖3)。接種量過高,菌體生長不佳,可能是因為在發(fā)酵初始階段培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)不能滿足大量菌體生長的需求。因此在1%～5%的接種量范圍內(nèi)選擇實驗點進(jìn)行響應(yīng)面實驗設(shè)計。

圖3　接種量對植物乳桿菌KLDS 1.0391 發(fā)酵后活菌數(shù)的影響Fig.3　Effect of inoculation on total number of colonies by Lactobacillus plantarum KLDS 1.0391

表3　響應(yīng)面二次回歸模型的方差分析Table 3　Analysis of variance for response surface quadratic regression equation

注:“*”表示影響顯著(p<0.05),“**”表示影響極顯著(p<0.01)。

表2　響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2　Design and result of response surface

對上述回歸方程分析(表3),發(fā)酵溫度(A)的影響達(dá)到極顯著,發(fā)酵溫度、接種量的交互項(AC)和A2影響顯著,其他均不顯著。各因素對發(fā)酵活菌數(shù)影響的大小順序為:發(fā)酵溫度(A)>接種量(C)>pH(B)。

Expert 8.0.6軟件對各因素及其之間的交互作用進(jìn)行分析(僅列出交互作用顯著項見圖4),發(fā)現(xiàn)3個響應(yīng)曲面均為開口向下的凸形曲面,每個響應(yīng)面都有極高值。通過各因素之間的交互作用發(fā)現(xiàn),發(fā)酵溫度(A)與pH(B)之間的交互作用對活菌數(shù)的影響最小,發(fā)酵溫度(A)與接種量(C)之間的交互作用影響則最大。

圖4　發(fā)酵溫度與接種量交互作用 對菌落總數(shù)影響的響應(yīng)面圖Fig.4　Response surface graph of fermentation temperature and inoculation on total number of colonies

通過軟件分析,獲得以玉米漿粉為發(fā)酵培養(yǎng)基時,高密度發(fā)酵參數(shù)如下:發(fā)酵溫度34.70 ℃,發(fā)酵pH6.18,接種量3.13%,在此條件下,活菌數(shù)的預(yù)測值為9.71 lg CFU/mL。考慮到實際的可操作性,設(shè)定發(fā)酵溫度為34.7 ℃,發(fā)酵pH為6.2,接種量為3.1%,在此條件下進(jìn)行發(fā)酵,獲得的發(fā)酵活菌數(shù)為9.58 lg CFU/mL,與理論值相對誤差為1.33%,說明實驗結(jié)果與模型符合良好。

2.2發(fā)酵時間的確定

由圖5可知,1～6 h為發(fā)酵的遲滯期,6～11 h為發(fā)酵的對數(shù)生長期,之后進(jìn)入穩(wěn)定期,確定發(fā)酵時間為11 h,此時,植物乳桿菌KLDS 1.0391的菌落總數(shù)達(dá)到9.58 lg CFU/mL。與已經(jīng)發(fā)表的文獻(xiàn)對比發(fā)現(xiàn),該水平能夠達(dá)到采用MRS進(jìn)行發(fā)酵的水平(9.53 lg CFU/mL)[17],雖然與目前已知的最高水平有一定差距[16],但是在培養(yǎng)基成本與處理方式等方面存在一定優(yōu)勢。

圖5　以玉米漿粉為培養(yǎng)基時的發(fā)酵時間確定Fig.5　Determine fermentation time of corn steep powder medium

3　結(jié)論

以玉米漿粉為發(fā)酵培養(yǎng)基,通過響應(yīng)面法優(yōu)化獲得植物乳桿菌KLDS 1.0391的發(fā)酵條件為:發(fā)酵溫度34.7 ℃,pH6.2,接種量3.1%。在此條件下發(fā)酵11 h后,發(fā)酵液中活菌數(shù)的預(yù)測值為9.71 lg CFU/mL,實際發(fā)酵測得值為9.58 lg CFU/mL,與模型預(yù)測值的相對誤差為1.33%,說明實驗結(jié)果與模型符合良好。本研究結(jié)果為工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)植物乳桿菌KLDS 1.0391奠定了基礎(chǔ),后續(xù)將進(jìn)一步放大發(fā)酵規(guī)模來檢驗發(fā)酵效果。

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Optimization of high-density fermentation conditions forLactobacillusplantarumby response surface methodology

ZHOU Jin-yu,PANG Xue-hui,WU Tong,ZHANG Qiu-xue,MENG Xiang-chen*

(Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

In this study,response surface methodology was applied to optimize high density fermentation parameters forLactobacillusplantarumKLDS 1.0391. Central composite design was used to optimize fermentation temperature,fermentation pH and inoculation following the single factor tests. Corn steep powder was used as fermentation medium and the total number of viable bacteria was used as the main indicator. The results showed that the influence of three factors on the number of viable bacteria in the fermentation broth was in order as follows:fermentation temperature>inoculation>fermentation pH. The number of viable bacteria achieved 9.58 lg CFU/mL under the optimum fermentation parameter which included fermentation temperature of 34.7 ℃,fermentation pH of 6.2,inoculation of 3.1% and fermentation time of 11 h. There’s no significant difference between the results obtained according to optimum conditions and the predicted value,and the relative error was 1.33% between them. The established model can effectively reflect the actual fermentation conditions.

Lactobacillusplantarum;response surface method;high-density culture;fermentation conditions optimization

2015-12-25

周金雨(1990-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)，E-mail：zjy984697957@outlook.com。

孟祥晨(1970-)，女，博士，教授，研究方向：食品微生物與生物技術(shù)，乳品科學(xué)與技術(shù)，乳酸菌與益生菌的功能及應(yīng)用等，E-mail：xchmeng@163.com。

TS201.1

A

1002-0306(2016)14-0206-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.033