產(chǎn)抗菌肽腸球菌的篩選及其抗菌肽生物學(xué)性質(zhì)

王　品,姜鐵民,李菊芳,劉　斌,魏京華,景萌娜,陳歷俊,*

(1.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,遼寧大連 116000;2.北京三元食品股份有限公司國家母嬰乳品健康工程技術(shù)研究中心,北京 100163)

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產(chǎn)抗菌肽腸球菌的篩選及其抗菌肽生物學(xué)性質(zhì)

王品1,2,姜鐵民2,李菊芳2,劉斌2,魏京華1,2,景萌娜1,2,陳歷俊1,2,*

(1.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,遼寧大連 116000;2.北京三元食品股份有限公司國家母嬰乳品健康工程技術(shù)研究中心,北京 100163)

利用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法從新生兒糞便中篩選到一株產(chǎn)廣譜抗菌肽的乳酸菌菌株,經(jīng)菌體形態(tài)觀察、生理生化分析、全自動(dòng)微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)和16S rDNA序列分析確定該菌株為屎腸球菌(Enterococcusfaecium)。經(jīng)過氧化氫酶處理后,發(fā)酵上清液仍具有抑菌活性,而胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K處理后,抑菌活性基本消失,說明該抑菌物質(zhì)為蛋白類似物,即抗菌肽。該菌株所產(chǎn)抗菌肽在pH2.0～5.0范圍內(nèi)保持活性,45～100 ℃處理1 h后抑菌活性基本不變。發(fā)酵液中的抗菌肽經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)和數(shù)據(jù)庫APD比對得出3條不同的抗菌肽氨基序列,具有重要的研究價(jià)值。

屎腸球菌,篩選,抗菌肽,液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

食品中含有豐富的營養(yǎng),其生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)均可見腐敗變質(zhì),造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,危害人體健康。微生物污染及其生長繁殖是導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)的主要原因?，F(xiàn)今,化學(xué)防腐劑的添加是應(yīng)對食品腐敗的主要措施,但其濫用已導(dǎo)致了新的食品安全問題,因而天然產(chǎn)物作為食品防腐劑已成為研究的熱點(diǎn)[1]。乳酸抗菌肽(細(xì)菌素)是由乳酸菌產(chǎn)生的具有抗菌作用的蛋白或多肽類物質(zhì),具有強(qiáng)抗菌性,能抑制食品中的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等腐敗菌和致病菌,被廣泛應(yīng)用于食品加工過程中[2]。乳酸菌中的屎腸球菌是人、動(dòng)物腸道及某些食品的重要菌群,可以代謝產(chǎn)生穩(wěn)定性強(qiáng)、水溶性大、安全無毒、抑菌譜廣、不易獲得抗性的抗菌肽[3]。對于腸球菌的鑒定,由于其表型的可變性和16S rDNA基因序列的高度類似性[4],且核糖體分型技術(shù)能夠利用核糖體基因的相對保守性原理得到細(xì)菌的特異性圖譜,達(dá)到細(xì)菌的分型效果[5],因此在進(jìn)行常規(guī)的生化檢測和16S rDNA基因鑒定的同時(shí),輔以全自動(dòng)微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)(RiboPrinter)的應(yīng)用,使腸球菌鑒定結(jié)果更可靠。

本研究從新生兒糞便中分離篩選產(chǎn)抗菌肽的優(yōu)良菌株,通過形態(tài)學(xué)觀察、生化檢測、RiboPrinter鑒定和分子鑒定以確定其細(xì)菌分類,并對所產(chǎn)生的抗菌肽進(jìn)行初步分析,以期豐富抗菌肽種類,為食品工業(yè)中開發(fā)新生物防腐劑提供理論支持和參考價(jià)值。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

菌株乳酸菌從通州婦幼保健醫(yī)院的健康新生兒胎糞中篩選;指示菌大腸桿菌 ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、嗜熱鏈球菌CICC 6038、保加利亞乳桿菌CICC 6103、釀酒酵母 ATCC 9080、東方伊薩酵母YB-3,為三元公司實(shí)驗(yàn)室保藏;沙門氏菌ATCC 19585、蠟樣芽孢桿菌CMCC 63301、綠膿假單胞菌CMCC 10104、枯草芽孢桿菌CICC 10033、單增李斯特菌ATCC 19115、痢疾志賀氏菌CMCC 51252,為中科院微生物所提供;MRS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司;API 20 Strep試劑條生物梅里埃中國有限公司;過氧化氫酶(3.5 U/μg)、胃蛋白酶(2.5 U/μg)、胰蛋白酶(2 U/μg)、蛋白酶K(30 U/mg)美國Sigma公司;PCR相關(guān)試劑賽百盛公司;RiboPrinter試劑套裝、樣品制備包美國杜邦公司;HLB固相萃取柱美國Waters公司。

生化培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司;PCR儀BIO-RAD公司;凝膠成像儀上海天能科技有限公司;全自動(dòng)微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)DU PONT公司;UltiMate 3000鈉升液相色譜儀美國Dionex公司;Q Exactive Orbitrap高分辨質(zhì)譜儀美國Thermo Fisher公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1抑菌菌株的分離和純化取1.0 g新鮮嬰兒糞便,用無菌生理鹽水梯度稀釋,取稀釋度為10-5、10-7和10-9的溶液各1 mL涂布于含1.5% CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基平板中,37 ℃培養(yǎng)48 h。從涂布平板中挑選溶鈣圈大的單菌落,進(jìn)行劃線分離2次后挑選的單菌落,在MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h后的發(fā)酵液在4 ℃、5000 r/min離心20 min,將上清液4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2抑菌菌株的篩選

1.2.2.1指示菌(大腸桿菌和金黃色葡萄球菌)的活化將指示菌按2%的接種量接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中,37 ℃培養(yǎng)24 h,連續(xù)活化3代。調(diào)整菌體濃度為106CFU/mL的菌懸液,吸取200 μL涂布于營養(yǎng)瓊脂平板中。打開平板蓋置于無菌空氣中0.5 h,使平板培養(yǎng)基散失一定量的水分,利于抑菌物質(zhì)的擴(kuò)散。

1.2.2.2抑菌菌株的初篩參考牛津杯瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)[6],用無菌鑷子將牛津杯(直徑8 mm)輕輕放置于平板上,向其中加入發(fā)酵上清液200 μL。將平板輕輕放于4 ℃冰箱中擴(kuò)散3 h左右后置于37 ℃下培養(yǎng)12 h觀察抑菌圈的出現(xiàn),并記錄大小,每組實(shí)驗(yàn)三次平行,結(jié)果以x±s表示,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0軟件中Linear Models程序,差異顯著性(p<0.05)采用最小顯著差權(quán)法分析,下同。

1.2.2.3抑菌最低濃度稀釋度的確定將1 mL發(fā)酵上清液在無菌水中梯度稀釋,分別用指示菌(大腸桿菌和金黃色葡萄球菌)對各稀釋度進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.4抑菌菌株的復(fù)篩將活化好的指示菌調(diào)整濃度為106CFU/mL,檢測發(fā)酵上清液對指示菌的抑制效果,從而確定菌株的抑菌譜。

1.2.3抑菌菌株的鑒定

1.2.3.1菌體形態(tài)觀察包括菌落特征、革蘭氏染色、菌體形態(tài)特征。

1.2.3.2生理生化鑒定將菌株單菌落在滅菌生理鹽水中制成菌懸液,接種于API 20 Strep鑒定卡[7]上的小管,放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。依照鑒定卡說明,根據(jù)試劑卡顏色變化,分析目標(biāo)菌株的歸屬。

1.2.3.3 RiboPrinter鑒定按操作說明,分別取兩個(gè)菌落于一個(gè)盛有40 μL緩沖液的EP管中,預(yù)熱25 min后,分別加入A、B兩種裂解液各5 μL。開機(jī)自檢,按操作提示放入凝膠板、MP堿緩沖液、DNA解旋酶、膜與剛處理好的產(chǎn)物等,輸入每個(gè)產(chǎn)品的系統(tǒng)編號,運(yùn)行。

1.2.3.416S rDNA分子生物學(xué)鑒定應(yīng)用CTAB法提取菌株DNA[8],引物為27F:5′-AGAGTTTGAT CCTGGCTC AG-3′;1492R:5′-GGTTACCTTGTTA CGACTT-3′。50 μL反應(yīng)體系:DNA模板2 μL,引物各1 μL,10×Taq緩沖液5 μL,PCR染料5 μL,dNTP Mixture 1 μL,Taq聚合酶(5 U/μL)0.5 μL,超純水34.5 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序:95 ℃ 2 min,95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,循環(huán)35次,72 ℃ 10 min。

PCR產(chǎn)物交于英濰捷基進(jìn)行測序,測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST分析[9],以GenBank中的標(biāo)準(zhǔn)菌株作為參比,采用MEGA 6.0軟件的Neighbor-Join法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[10]。

1.2.4菌株所產(chǎn)抑菌物質(zhì)生物學(xué)特征

1.2.4.1抑菌物質(zhì)對酶的敏感性用5 mol/L HCl和5 mol/L NaOH分別調(diào)節(jié)無細(xì)胞發(fā)酵上清液的pH至過氧化氫酶、胰蛋白酶、蛋白酶K和胃蛋白酶的最適pH(依次為7.2、7.4、7.4、2.0),加入各酶液使終濃度達(dá)到1 mg/mL,37 ℃溫浴2 h,沸水處理5 min使酶滅活,再將無細(xì)胞發(fā)酵上清液分別調(diào)至pH5.0,以未經(jīng)酶處理的pH5.0發(fā)酵上清液為對照。

1.2.4.2抑菌物質(zhì)對pH的敏感性用5 mol/L HCl和5 mol/L NaOH分別調(diào)節(jié)無細(xì)胞發(fā)酵上清液的pH至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0,以相同pH的MRS液體培養(yǎng)基為對照,測定抑菌活性。

1.2.4.3抑菌物質(zhì)對熱穩(wěn)定性將無細(xì)胞發(fā)酵上清液分別在45、60、80、100 ℃處理1 h后,測定其抑菌活性。

1.2.5抗菌肽的LC-MS/MS分析發(fā)酵上清液加入等體積的24% TCA溶液,靜置30 min后5000×g離心20 min。收集上清,用HLB柱洗脫,洗脫液冷凍干燥后用0.1%甲酸-水溶液復(fù)溶。

色譜條件:分析柱為Acclaim Pep Map RSLC C18柱(15 cm×50 μm,2 μm,100 ?);富集柱為Acclaim Pep Map 100 C18柱(2 cm×75 μm,5 μm,100 ?);柱溫為35 ℃;流動(dòng)相:A為0.1%甲酸-水溶液,B為0.1%甲酸-乙腈溶液;流速為0.25 μL/min。質(zhì)譜條件:Nanospray Flex納升電噴霧源;離子源溫度為300 ℃;正離子掃描,掃面范圍為200～3000 m/z;流動(dòng)相:A為0.1%甲酸-水溶液,B為20%水-乙腈溶液;流速為0.25 μL/min。

掃描得到的肽段結(jié)果在Thermo Proteome Discoverer軟件上分析,并在數(shù)據(jù)庫ADAM和CAMP進(jìn)行肽段的抑菌性預(yù)測以及在數(shù)據(jù)庫APD上進(jìn)行序列比對。

2　結(jié)果與分析

2.1菌株篩選結(jié)果

2.1.1菌株的初篩從嬰兒糞便中共篩選出61株具有溶鈣圈和抑菌圈的菌株,其中溶鈣圈明顯且抑菌活性強(qiáng)的菌株有7株,對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑范圍分別為14.2～26.5 mm和13.3～24.2 mm,結(jié)果見表1?？梢钥闯龃竽c桿菌抑菌圈較大的菌株C1、C23與其他菌株的相比有顯著性差異,金黃色葡萄球菌抑菌圈較大的菌株C1與其他菌株均具有顯著性差異,因此選擇菌株C1進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)。

表1　不同菌株上清液的抑菌活性Table 1　Antibacterial activity of the supernatants of different strains

注:同列不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05);表7同。

2.1.2菌株最低抑菌濃度稀釋度的檢測由表2可知,菌株C1在稀釋度為10-4時(shí)對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有抑菌活性,在稀釋度為10-5時(shí)均沒有抑菌活性,表明其最低抑菌濃度梯度為10-4,參考李成海[11]的分析方法,所以該菌株有進(jìn)一步研究的必要。

表2　不同稀釋度上清液的抑菌活性Table 2　Antibacterial activity of the dilute fermented broth

注:“+”為有抑菌活性,“-”為無抑菌活性。

2.1.3菌株的復(fù)篩由于革蘭氏陰性菌菌體有外膜,一般乳酸菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)不能結(jié)合到細(xì)胞膜上,只能對革蘭氏陽性菌有抑制作用,而由表3知,菌株C1的發(fā)酵上清液對革蘭氏陰性菌同樣具有明顯的不同程度抑制作用。文獻(xiàn)[12]中篩選的嬰兒糞便乳酸菌對沙門氏菌不具有抑制性,而本實(shí)驗(yàn)中菌株具有明顯的抑制性,可見該菌株對一般的食品腐敗菌和致病菌都具有抑制作用,所以該菌株發(fā)酵液具有制備廣譜防腐劑的潛力。

表3　發(fā)酵上清液的抑菌譜Table 3　Antibacterial spectrum of the fermented broth

注:抑菌圈直徑(mm):+,12～17;++,18～23;+++,24～29。

2.2抑菌菌株的鑒定

2.2.1菌體形態(tài)特征菌株C1菌落呈白色,圓形,凸起,濕潤,邊緣整齊。菌株革蘭氏染色后顯微鏡觀察可知,菌株為革蘭氏陽性菌,單個(gè)、成對或鏈狀排列、無芽孢,不運(yùn)動(dòng)的球菌。

2.2.2生理生化鑒定根據(jù)試劑卡顏色變化,陽性結(jié)果記錄為“﹢”;陰性結(jié)果記錄為“-”。經(jīng)APIweb系統(tǒng)軟件分析所得生化譜為7155531。菌落呈白色,且在45 ℃生長,結(jié)合表4中與屎腸球菌相比的鑒定率為99.3%,可知菌株C1為屎腸球菌(Enterococcusfaecium)。

表4　菌株C1的API 20 Strep鑒定結(jié)果Table 4　API 20 Strep identification result of strain C1

2.2.3RiboPrinter鑒定選取對數(shù)期的腸球菌進(jìn)行RiboPrinter系統(tǒng)鑒定,約8 h后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。與杜邦編號具體相似比見表5,可以看出,與菌株C1相似性最高的為屎腸球菌。

2.2.416S rDNA分子生物學(xué)鑒定將測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比對,采用MEGA6.0軟件Neighbor-Join法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,如圖1所示?？芍闏1與EnterococcusfaeciumC1S2位于同一小分支,親緣關(guān)系最為接近,同源性可達(dá)99.8%。

表5　菌株C1的RP系統(tǒng)比對結(jié)果Table 5　The result of RiboPrinter? of strain C1

綜合形態(tài)學(xué)觀察、API 20 strep生化鑒定、RiboPrinter鑒定和16S rDNA分子生物學(xué)鑒定,可以確定菌株C1為屎腸球菌。

表7　菌株C1所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的pH敏感性Table 7　pH stability of bacteriocin produced by strain C1

圖1　基于16S rDNA序列C1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1　Phylogenetic tree of strain C1 based on the 16S rDNA sequence

2.3菌株所產(chǎn)抑菌物質(zhì)生物學(xué)特征

2.3.1抑菌物質(zhì)對酶的敏感性由表6可知,經(jīng)過過氧化氫酶處理的上清液抑菌活性未見明顯變化,由此排除過氧化氫的作用。經(jīng)過胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K處理后其抑菌活性完全喪失。相較于文獻(xiàn)[13]中上清液經(jīng)蛋白酶處理后仍具有小部分抑菌活性,本實(shí)驗(yàn)更能說明所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)是一種蛋白類活性物質(zhì),初步確定是一類抗菌肽。而人體消化道中含有胃蛋白酶和胰蛋白酶,所以此抗菌肽不會(huì)在體內(nèi)殘留,安全性相對較高,進(jìn)一步證明其成為食品天然防腐劑的可能性。

表6　不同酶對抑菌活性的影響Table 6　Effect of different enzymes on the antibacterial activity

2.3.2抑菌物質(zhì)對pH的敏感性由表7可知,所產(chǎn)抑菌物質(zhì)在pH2.0～5.0有抑菌圈出現(xiàn),說明該抑菌物質(zhì)在酸性條件下具有活性,隨著pH的升高,抑菌圈逐漸變小,抑菌活性逐漸下降;可能是由于pH的升高導(dǎo)致抑菌物質(zhì)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,使抑菌活性減弱,與很多乳酸菌產(chǎn)生抗菌肽的性質(zhì)相似[14],即在酸性條件下穩(wěn)定,在中性或堿性條件下即失活,可初步歸為酸性抗菌肽,可以用為酸性食品的防腐劑。

2.3.3抑菌物質(zhì)對熱的穩(wěn)定性菌株發(fā)酵液經(jīng)過45～100 ℃,處理1 h后,殘留的抑菌活性基本保持在0.90以上,該結(jié)果同文獻(xiàn)[15]結(jié)論一致,可以認(rèn)為菌株C1具有很好的熱穩(wěn)定性。常用的食品巴氏滅菌溫度不超過100 ℃,這表明該抑菌物質(zhì)可以應(yīng)用于食品加工工業(yè)中。

圖2　菌株C1所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性Fig.2　Heat stability of bacteriocin produced by strain C1

2.4抗菌肽的LC-MS/MS分析結(jié)果

根據(jù)LC-MS/MS產(chǎn)生的離子片段信息,在Thermo Proteome Discoverer軟件上顯示的肽段運(yùn)用數(shù)據(jù)庫ADAM和CAMP進(jìn)行肽段的抑菌性預(yù)測,合并兩庫結(jié)果,共有22條肽段被預(yù)測為抗菌肽。這些肽段在抗菌肽數(shù)據(jù)庫APD中比對篩選出3條可能具有抗菌活性的肽段序列(表8)。參照李尚偉[16]的實(shí)驗(yàn)方法,組成3條肽段的氨基酸個(gè)數(shù)都不小于相對應(yīng)的比對序列的,因此可以認(rèn)為檢測得到的肽段是完整肽段,與文獻(xiàn)中腸球菌素的產(chǎn)生菌大多產(chǎn)生兩種及以上細(xì)菌素[17]結(jié)論相一致。

表8　APD中比對得到的抗菌肽Table 8　Antibacterial peptides blasted from APD

3　結(jié)論

從新生兒糞便中分離獲得1株能夠產(chǎn)生抗菌肽的菌株,其具有廣譜抑菌活性,經(jīng)多項(xiàng)鑒定,可以確定該菌為屎腸球菌。發(fā)酵上清液排除有機(jī)酸、過氧化氫作用,用蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后抑菌活性基本喪失,表明該菌株產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)具有肽段性質(zhì),初步確定為抗菌肽。該抗菌肽活性依賴于酸性環(huán)境,并對熱穩(wěn)定,可以作為一種天然防腐劑應(yīng)用于酸性食品的防腐過程中。通過LC-MS/MS進(jìn)行檢測及序列比對分析,得到3條抗菌肽肽段。為了驗(yàn)證所得肽段的抗菌活性,還需人工合成相應(yīng)序列進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn),對于其分離純化還需進(jìn)一步的探索。

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Screening of antimicrobial peptide-producingEnterococcusand its antibacterial peptide biological features

WANG Pin1,2,JIANG Tie-min2,LI Ju-fang2,LIU Bin2,WEI Jing-hua1,2,JING Meng-na1,2,CHEN Li-jun1,2,*

(1.School of Biological Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian 116000,China;2.National Maternal and Infant Health Dairy Researching Center of Beijing Sanyuan Foods Co.,Ltd.,Beijing 100163,China)

A antimicrobial peptides-producing lactic acid bacterial strain with broad-spectrum was selected from newborn by the oxford cup agar diffusion method. Based on cell morphological,physiological,biochemical characteristics,RiboPrinter and 16S rDNA sequence analysis,the strain was identified asEnterococcusfaecium. The antimicrobial activity of the fermented supernatant remained by catalase treatment. In addition,the inhibitory activity was lost after treated with trypsin,pepsin and proteinase K. Therefore,the inhibitory substance was preliminary determined as antimicrobial peptide. The antibacterial activity of antimicrobial peptide was not affected by low pH(2.0～5.0)and the antimicrobial peptide exhibited good thermal stability by treatment from 45 ℃ to 100 ℃ for 1 hour. Three amino acid sequences of the antimicrobial peptide were identified by LC-MS/MS and APD database. The antibacterial peptide has great research value.

Enterococcusfaecium;screening;antimicrobial peptide;LC-MS/MS

2016-01-20

王品(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵乳制品，E-mail：wangpin225@126.com。

陳歷俊(1967-),男，博士,教授級高工，研究方向：乳品加工，E-mail：chenlijun@sanyuan.com.cn。

北京市科技計(jì)劃(D141100004814002)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)14-0201-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.032