玉米赤霉烯酮一步ELISA法的建立及應(yīng)用

王文珺,劉怡菲,韓　霄,王照鵬,蘇麗芳,敖海闊,吳雨洋

(1.北京維德維康生物技術(shù)有限公司,北京 100095;2.河北獸藥監(jiān)察所,河北石家莊 050035;3.北京交通大學(xué)理學(xué)院,北京 100044)

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玉米赤霉烯酮一步ELISA法的建立及應(yīng)用

王文珺1,劉怡菲2,韓霄3,王照鵬1,蘇麗芳1,敖海闊1,吳雨洋1

(1.北京維德維康生物技術(shù)有限公司,北京 100095;2.河北獸藥監(jiān)察所,河北石家莊 050035;3.北京交通大學(xué)理學(xué)院,北京 100044)

為了建立一種快速、準(zhǔn)確的檢測飼料及其原料中玉米赤霉烯酮的酶聯(lián)免疫一步法。在制備玉米赤酶烯酮半抗原、免疫原及單克隆抗體的基礎(chǔ)上,運(yùn)用方陣法確定包被抗原、抗體的濃度,篩選穩(wěn)定的ELISA檢測體系,并在此基礎(chǔ)上考察了抗體的特異性。建立了檢測飼料及其原料中玉米赤霉烯酮的方法,豬飼料、牛飼料、玉米渣和麥麩的檢測限分別為96.2、92.7、80.5和86.7 μg/kg。在飼料及原料中定量添加玉米赤霉烯酮,酶聯(lián)免疫的回收率為79.4%～104.9%,開發(fā)的酶聯(lián)免疫試劑盒與德國拜發(fā)試劑盒對實(shí)際樣本進(jìn)行檢測,兩種試劑盒對樣本陰陽性判定一致。本研究為飼料及其原料中玉米赤酶烯酮的監(jiān)管提供了技術(shù)支撐。

玉米赤霉烯酮,半抗原,單克隆抗體,酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA),飼料及其原料

由飼料污染導(dǎo)致的食品質(zhì)量安全問題引發(fā)越來越多的關(guān)注,真菌毒素是飼料污染的重要原因。據(jù)統(tǒng)計,每年全世界的農(nóng)產(chǎn)品和工業(yè)原料因真菌毒素污染引起的損失達(dá)數(shù)百億美元[1]。玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)是一種常見的真菌毒素,最初從患赤霉病的玉米中分離得到,其主要污染玉米和小麥等糧食。ZEN引起的污染相當(dāng)廣泛[2],中國、美國、加拿大、英國等國家相繼報告了由ZEN污染糧食引起的豬中毒事件。李榮濤[3]曾從全國各地采集玉米、小麥樣本進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)樣本中ZEN陽性率為100%,濃度范圍為0.014～0.73 mg/kg。被ZEN污染的飼料一旦被動物食用,可引起動物中樞神經(jīng)中毒,對于妊娠期的動物,可能會引起流產(chǎn)、死胎、畸胎等[4]。ZEN會通過食物鏈傳遞給人體,危害人類的健康。ZEN的存在日益引起人們的關(guān)注[5],近年來,人們著手研究建立了多種檢測ZEN的方法。ZEN儀器分析方法主要有液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS/MS)和高效液相色譜(HPLC)等[6-9],可同時定量檢測ZEN及其代謝物α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇等[10-11],但儀器分析需要昂貴的儀器,檢測周期長,不適合快速對大量樣本的檢測,常被用來作為確證的方法。因此,急需開發(fā)出一種靈敏度高、準(zhǔn)確的ZEN快檢方法,以滿足社會對ZEN污染情況的監(jiān)控。ELISA具有高靈敏度、高通量、操作簡便等優(yōu)點(diǎn),可實(shí)現(xiàn)短時間內(nèi)對大量樣本的篩查。美國分析化學(xué)家協(xié)會(AOAC)率先將ELISA應(yīng)用于檢測谷物、小麥、豬飼料中的ZEN[12]。我國GB/T13078.2-2006規(guī)定飼料中ZEN限量標(biāo)準(zhǔn)為500 μg/kg[13],檢測飼料中ZEN的國標(biāo)方法包括薄層色譜法、ELISA以及免疫親和柱—高效液相色譜聯(lián)用技術(shù)等[14-15]。目前,人們已逐步將免疫分析技術(shù)應(yīng)用于真菌毒素檢測的研究[16-19]。ZEN標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性直接影響ELISA方法的產(chǎn)業(yè)化,但很少有文獻(xiàn)報道涉及這方面的研究。

本研究系統(tǒng)闡述了ZEN抗原抗體制備、檢測體系建立、樣本分析,建立了飼料及其原料中ZEN的檢測方法(檢測限100 μg/kg),探討了保持標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性的思路及方法,以期為真菌毒素類ELISA方法的應(yīng)用提供技術(shù)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

玉米赤霉烯酮、玉米赤霉酮、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇中國獸藥監(jiān)察所;Proclin 300、明膠、酶穩(wěn)定劑、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑等Sigma公司;羊抗鼠IgG-HRP美國Jackson公司;ELISA酶標(biāo)板廈門云鵬;新生牛血清民海生物;吡啶、甲醇等分析純化合物北京國藥集團(tuán);ELISA所用的緩沖液包被液:碳酸鹽緩沖液0.05 mol/L,pH9.6;磷酸鹽緩沖液(0.02 mol/L,PBS):PB緩沖液中加入0.15 mol/L NaC1,pH7.4;洗滌液:1000 mL PBS加1 mL Tween-20;酶稀緩沖液:2 mL Tween-20、1 g明膠、200 mL新生牛血清、0.2 g酶穩(wěn)定劑和300 μL ProClin 300,加入到0.02 mol/L PBS中,定容到1000 mL;封閉液:1000 mL PBS加入5 g明膠、2%蔗糖和500 μL ProClin 300;專用標(biāo)準(zhǔn)品緩沖液:0.02 mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液,pH6.0;A/B雙組份顯色底物液:北京維德維康生物技術(shù)有限公司自制;終止液:1 mol/L H2SO4。

MK3酶標(biāo)儀美國,Thermo fisher科技;TDL-40C離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠;HQ-60型渦動儀北京方正生物科技發(fā)展有限公司;Milli-Q型超純水儀美國,Milli-Q公司;微量移液器德國,Eppendorf;90-3 型磁力攪拌器上海青浦滬西儀器廠;電子天平德國,賽多利斯科學(xué)儀器公司。

1.2實(shí)驗方法

1.2.1ZEN半抗原(玉米赤霉烯酮-6′-羧甲氧肟)的合成由于ZEN本身沒有活性基團(tuán),無法直接偶聯(lián)蛋白,需要先合成半抗原,參考Liu的方法[20]略有改動。ZEN(10 mg)溶于6 mL吡啶中,加入8.0 mg O-羧甲基羥胺半鹽酸鹽,攪拌反應(yīng)24 h,真空干燥后的殘留物溶于5 mL蒸餾水中,用Na2CO3將pH調(diào)到8.0,用乙酸乙酯從水相中除去未反應(yīng)的ZEN。水相的pH用HCl調(diào)到3.0,沉淀反應(yīng)產(chǎn)物,并用10 mL乙酸乙醋提取四次,提取物用無水Na2SO4干燥,減壓濃縮得半抗原ZEN-CMO。

1.2.2活性酯法制備ZEN人工抗原人工抗原制備參考王照鵬的方法[21],略有改進(jìn)。將5.19 mg ZEN-CMO溶于2 mL 二甲基甲酰胺(DMF)中,加入5.0 mg NHS 和6.0 mg EDC中,室溫攪拌反應(yīng)2 h,得到活化的A液;稱取67 mg BSA溶于5.0 mL 0.02 mol/L(pH7.4)的PBS中,得到B液;在4 ℃條件下,邊攪拌邊在B液中緩慢的加入A液,然后室溫攪拌24 h;將反應(yīng)產(chǎn)物裝入干凈的透析袋(15 cm)中,用0.01 mol/L PBS(pH7.4)在4 ℃下攪拌透析3 d,每天更換透析液3次,透析產(chǎn)物(免疫原:ZEN-CMO-BSA)在4500 r/min離心6 min,0.5 mL/管分裝,將抗原編號,-20 ℃保存?zhèn)溆?。ZEN-CMO-BSA制備方法見圖1。同法合成包被原ZEN-CMO-OVA。

1.2.3ZEN單克隆抗體制備制備單克隆抗體(單抗)的流程參考王文珺描述的方法[22]:免疫Balb/C小鼠,待效價大于5000后,取小鼠脾臟與骨髓瘤細(xì)胞融合,用選擇培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞,經(jīng)五次克隆后,篩出穩(wěn)定分泌ZEN抗體的細(xì)胞,細(xì)胞培養(yǎng)上清或注射小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的腹水含有大量的ZEN單克隆抗體。經(jīng)進(jìn)一步純化后可用于ZEN試劑盒研發(fā)。

1.2.4ZEN標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線的建立首先,方陣法篩選抗原、抗體的工作濃度,建立間接競爭性ELISA(icELISA)的標(biāo)準(zhǔn)曲線[23]:a.包被:以確定的抗原濃度包被酶標(biāo)板,4 ℃過夜,棄包被液,洗滌一次;b.封閉:加入封閉液(150 μL/孔),室溫下封閉2 h,棄封閉液,拍干;c.加樣:取50 μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品(0、0.1、0.2、0.4、0.8、2.4 ng/mL)分別加入各平行孔中,再按順序加入50 μL IgG-HRP工作液、50 μL ZEN單抗,避光反應(yīng)30 min,洗滌四次;d.顯色:加入新鮮配制的底物液100 μL,避光孵育10～15 min;e.終止:加入50 μL終止液,在450 nm/630 nm 雙波長下讀出數(shù)據(jù)。

圖1　ZEN半抗原合成和偶聯(lián)物制備反應(yīng)圖Fig.1　Reactions used to synthesize the hapten(ZEN-CMO)and conjugates(ZEN-CMO-BSA)

ZEN標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo),結(jié)合率(B/B0)為縱坐標(biāo)。用軟件Origin 8.0繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,建立四參數(shù)回歸方程[24]:

其中:Y為結(jié)合率;A1代表零標(biāo)準(zhǔn)品的OD值；A2是最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品的OD值；P為曲線拐點(diǎn)的斜率;X0為IC50所代表的藥物濃度。

1.2.5ZEN抗體的特異性考察ZEN單抗與其結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng),分別建立標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線,計算各自的IC50,按下式計算交叉反應(yīng)率:

交叉反應(yīng)率(CR%)=IC50(ZEN)/IC50(結(jié)構(gòu)類似物)×100

1.2.6標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性考評三種標(biāo)準(zhǔn)品緩沖液(標(biāo)緩)配制標(biāo)準(zhǔn)品:0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)、0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)+20%甲醇、專用標(biāo)準(zhǔn)品緩沖液(見1.1)?？疾觳煌瑯?biāo)緩中標(biāo)準(zhǔn)品在4、37 ℃放置0、3、6、9 d的情況,通過考評IC50值、零孔OD值選擇合適的標(biāo)緩。

1.2.7樣品的測定

1.2.7.1添加實(shí)驗稱取粉碎后的待測樣品1.0 g于50 mL離心管中,樣品包括:豬飼料(幼仔)、牛飼料(肉牛)、玉米渣、麩皮,每種樣品稱量4份,樣品分別按100、200、500 ng/g濃度添加ZEN,同時設(shè)置未添加ZEN的試樣平行處理做空白。然后加入6 mL樣品稀釋液(20%甲醇+0.02 mol/mL PBS),高速渦動2 min后4000×g離心10 min;取20 μL上清液用380 μL樣品稀釋液,充分混勻后,取50 μL用于ELISA分析。

1.2.7.2實(shí)際樣本分析用本研究開發(fā)的試劑盒(WDWK)和德國拜發(fā)(RIDA)試劑盒對20個實(shí)際樣本進(jìn)行分析,通過檢測結(jié)果的比對,確定該檢測方法的準(zhǔn)確性。

2　結(jié)果與討論

2.1ZEN人工抗原及單抗制備

ZEN是一種小分子物質(zhì)(MW=318.6),需要與大的載體蛋白(如BSA、OVA、KLH等)偶聯(lián)才具有免疫原性。本研究在保持ZEN基本空間構(gòu)型的前提下,合成具有羧基長鏈的半抗原,通過羧基與載體蛋白BSA偶聯(lián)制備免疫原。根據(jù)紫外掃描確定ZEN與BSA的偶聯(lián)比為12.8∶1(見圖2)。一般來說,偶聯(lián)比在8∶1～25∶1范圍內(nèi),免疫效果較好。免疫小鼠制備單克隆抗體,經(jīng)過四次克隆,獲得一株能穩(wěn)定分泌抗體,編號為4C-1H-5F-3D細(xì)胞株。

圖2　偶聯(lián)物的紫外圖譜Fig.2　UV spectrum of conjugates

2.2ZEN 標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線

在優(yōu)化條件下,建立ZEN的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線(圖3),IC50=0.35 ng/mL,低于文獻(xiàn)報道中的IC50=(1.13±0.16) μg/L及線性范圍為1～50 ng/mL的檢測結(jié)果[16,20]。本研究采用一步法,即抗原、抗體和酶標(biāo)二抗的反應(yīng)一步完成,如果采用傳統(tǒng)的兩步法,IC50值更低(IC50=0.19 ng/mL)。但這樣會增加檢測步驟,延長檢測時間,不符合快檢產(chǎn)品的要求。在保證檢測限滿足國標(biāo)的情況下,本文優(yōu)先考慮一步法。

圖3　ZEN標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線Fig.3　The standard inhibition curve of ZEN determined by icELISA

2.3抗體特異性

ZEN單抗的特異性用其與ZEN結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)來表示。由表1可知,ZEN單抗與歐盟及農(nóng)業(yè)部“235”號公告[25]禁用藥物玉米赤霉醇有很大的交叉,因此該抗體也可用來開發(fā)玉米赤霉醇的檢測試劑盒?？贵w與其結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)越大,說明該結(jié)構(gòu)類似物具有與待測物相同或相近結(jié)構(gòu),即相同的抗原決定簇。在免疫檢測中,交叉反應(yīng)的存在常被利用檢測一類物質(zhì),如磺胺總量的檢測。

表1　ZEN抗體的交叉反應(yīng)Table 1　Cross-reaction of ZEN and structurally related compounds

表2　標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性考評Table 2　Evaluation for stability of standard

表3　飼料及其原料*中添加ZEN回收實(shí)驗Table 3　Recovery for ZEN from Feed and feedstuffs* by icELISA

注:*:飼料及原料陰性樣本來自農(nóng)業(yè)部飼料工業(yè)中心。

2.4穩(wěn)定性考評

標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性是ELISA試劑盒質(zhì)量控制的一個重要指標(biāo)[26-28]。ZEN屬于內(nèi)酯類化合物,如選擇的標(biāo)緩不合適,會引起ZEN的空間構(gòu)型發(fā)生改變,影響抗原-抗體的特異性結(jié)合,即破壞了ZEN標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性。關(guān)于ZEN ELISA的研究報告,很少涉及標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性的研究[17,29-30]。事實(shí)上,真菌毒素類標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性是制約其產(chǎn)品穩(wěn)定的關(guān)鍵因素。

根據(jù)阿倫尼烏斯公式[31],試劑在37 ℃條件下(熱加速實(shí)驗)放置1 d,相當(dāng)于4 ℃條件下保存1.6個月,9 d熱加速實(shí)驗相當(dāng)于4 ℃保存一年兩個月。在試劑研發(fā)過程中,常用熱加速實(shí)驗考察試劑的穩(wěn)定性。本研究工作重點(diǎn)考察了不同緩沖液配制的標(biāo)準(zhǔn)品在4 ℃和熱加速實(shí)驗條件下參數(shù)的變化情況,不同考評天數(shù)之間的數(shù)值,最大允許存在40%以內(nèi)的差異,不同處理方法之間的差異不應(yīng)該超過20%(以4 ℃為對照),對稀釋倍數(shù)較大的前處理方法,這種差異應(yīng)該控制在10%之內(nèi)。由表2 OD值和IC50可以看出,使用專用標(biāo)緩可以很好地維持標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性。

2.5樣本分析

2.5.1添加實(shí)驗在陰性樣本中添加不同濃度ZEN,添加回收率范圍在79.4%～107.9%之間(見表3),結(jié)果表明,樣本前處理方法準(zhǔn)確,可滿足市場需求。

同時,通過對大量陰性樣本的篩查,得到豬飼料(幼仔)、牛飼料(肉牛)、玉米渣、麩皮的檢測限分別為96.2、92.7、80.5、86.7 μg/kg。

2.5.2實(shí)際樣本分析通過Wdwk和RIDA試劑盒對20個實(shí)際樣本的分析(結(jié)果見表4),經(jīng)單因素方差分析,兩種方法的分析方法結(jié)果無顯著差異(p>0.05)。檢測樣本中沒有ZEN濃度≥500 μg/kg的樣本。

表4　WDWK試劑盒與RIDA試劑盒檢測結(jié)果的比較Table 4　Comparision of results determinedly by WDWK kits and RIDA kits

3　結(jié)論

本研究在制備高靈敏度抗體的前提下,采用一步ELISA法,開發(fā)出具有反應(yīng)時間短、操作簡單、結(jié)果穩(wěn)定的ELISA試劑盒,滿足市場對快檢免疫試劑的要求。本研究工作的重點(diǎn)是解決了ELISA試劑盒中ZEN標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性問題,采用了專用緩沖液,標(biāo)準(zhǔn)品可穩(wěn)定保存12個月。在樣本添加實(shí)驗中,回收率在79.4%～107.9%之間,實(shí)際樣本分析表明本研究開發(fā)的試劑盒與德國拜發(fā)試劑盒的檢測結(jié)果非常接近,進(jìn)一步證明了本研究工作的可靠性及可行性。

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Development and application of one-step enzyme-linked immunosorbent assays for zearalenone

WANG Wen-jun1,LIU Yi-fei2,HAN Xiao3,WANG Zhao-peng1,SU Li-fang1,AO Hai-kuo1,WU Yu-yang1

(1.Beijing WDWK Biotechnology Co.,Ltd.,Beijing 100095,China;2.Hebei Institute of Veterinary Drug Control,Shijiazhuang 050035,China;3.College of Science,Beijing Jiaotong University,Beijing 100044,China)

With aim of developing a speed,accurate,one-step enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)for the detection of zearalenone in feed and feed stuffs was set. Hapten was synthesized firstly,conjugated then to carrier proteins for complete antigen,which was used as antigen in mice for monoclonal antibody. Concentrations of coating antigen and antibody were determined with chessboard format. A stable analytical system was established and the specificity of monoclonal antibody was evaluated. The results showed that the detection of limit of this developed ELISA for zearalenone in pig feed、cow feed、maize pulp and wheat bran was 96.2,92.7,80.5 and 86.7 μg/kg,respectively. Feed samples were spiked with zearalenone and the recoveries of ELISA were 79.4%～104.9%. There was no distinct difference between the results of WDWK and RIDA kits. This study could bring a technical basis for the monitor of zearalenone.

zearalenone;hapten;monoclonal antibody;enzyme-linked immunosorbent assays(ELISA);feed and feed stuffs

2015-11-24

王文珺(1975-)，女，博士，副研究員，研究方向：農(nóng)業(yè)及環(huán)境毒物檢測研究，E-mail：wwj107@163.com。

河北省科技計劃項目(15277107D)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)14-0078-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.007