酶解鵝血制備高氨基酸血紅素

秦春青,黃　可,李本姣,程亞嬌,冷安鐘，劉　雄，*

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶 400715;2.重慶清水灣食品有限公司,重慶 408307)

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酶解鵝血制備高氨基酸血紅素

秦春青1,黃可1,李本姣1,程亞嬌1,冷安鐘2，劉雄1，*

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶 400715;2.重慶清水灣食品有限公司,重慶 408307)

利用Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計對堿性蛋白酶水解鵝血提取高氨基酸鵝血血紅素的工藝條件進行了優(yōu)化。結(jié)果表明:對水解度的影響次序為酶濃度>水解溫度>水解時間>溶液pH。鵝血提取高氨基酸血紅素的最佳酶解工藝參數(shù):酶濃度5%,溫度50 ℃,pH8.80,水解時間5.15 h,水解度為14.36%±0.18%。水解后,水解液中血紅素含量為1.210 mg/mL,鐵離子的含量為90.42 μg/mL。

鵝血,酶解,水解度,高氨基酸血紅素

血紅素是由卟啉和一分子的亞鐵離子結(jié)合,構(gòu)成的鐵卟啉類化合物[1]。血紅素存在于各種動物的肌肉和血液組織中,具有非常重要的生理功能和很高的使用價值,在醫(yī)藥、食品、化工、保健品、建筑及化妝品行業(yè)中有廣泛應(yīng)用[2]。

鵝血是一種高蛋白質(zhì)資源,蛋白質(zhì)含量高達19%,其中血紅蛋白含量約為11.6～12.99 g/100 mL,占全血蛋白的2/3[3-4]。鵝血中含有豐富的微量元素,以鐵的含量最高,是瘦肉含鐵量的20倍,可作為良好的補血劑[5]。血液的利用以血豆腐、血粉、血漿粉等初級加工形式為主[6],而在補鐵方面很少涉及。在我國,缺鐵性貧血的患病率較高。常見補鐵劑為硫酸亞鐵等無機鐵,雖有補鐵的效果,但在體內(nèi)利用率較低,毒副作用較大,且有特殊金屬鐵銹味。血紅素鐵是一種生物態(tài)鐵,可直接被腸粘膜細(xì)胞吸收,不產(chǎn)生任何消化道刺激癥狀,生物利用率高,是理想補鐵劑[7]。

目前血紅素的提取方法主要為:有機溶劑法(冰醋酸和丙酮法)、羧甲基纖維素法、表面活性劑法和酶法[8]等。這些方法,雖然可以提取到較高純度的血紅素,但有些對人體有害,有些生產(chǎn)成本高,通常認(rèn)為不適宜于工廠化生產(chǎn)[9]。酶解法是獲得高功能性和高營養(yǎng)價值產(chǎn)品最有效的方法[10],與其他提取血紅素的方法相比,酶解提高血紅蛋白利用率,并且避免酸、堿水解血紅蛋白時生產(chǎn)周期長、腐蝕設(shè)備、污染環(huán)境等缺陷,擴大了水解產(chǎn)物的應(yīng)用范圍。許多研究人員證明,堿性蛋白酶是各種蛋白質(zhì)水解物的制備中效果最好的酶[11]。

本研究以鵝血為原料,用堿性蛋白酶酶解鵝血,運用響應(yīng)面法優(yōu)化堿性蛋白酶酶解鵝血提取富含氨基酸鵝血血紅素工藝參數(shù),旨在為高氨基酸鵝血血紅素的提取提供理論指導(dǎo)。

1　材料與方法

1.1材料和儀器

鵝血由重慶市北碚區(qū)農(nóng)貿(mào)市場提供;98%血紅素標(biāo)準(zhǔn)品國藥集團化學(xué)試劑有限公司;堿性蛋白酶200000 U/g,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;檸檬酸三鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、甲醛、硫酸銅、硫酸鉀、亞甲基紅、亞甲基藍、濃硫酸均為分析純。

日立L-8800型全自動氨基酸分析儀天美科技有限公司;KQ 3200DB型數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司;pHS-3型精密酸度計上海三信儀器有限公司;722S紫外分光光度計上海菁華儀器有限公司;HWS-26數(shù)顯水浴鍋上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;JA2003電子天平上海精天儀器有限公司;TGL16G型臺式離心機上海安亭科學(xué)儀器廠;B5-2A恒溫磁力攪拌器常州博遠(yuǎn)實驗分析儀器有限公司;ZDDN-II全自動凱氏定氮儀浙江托普儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1鵝血酶解制備血紅素的工藝鵝血的洗滌→凍藏→解凍→加水?dāng)嚢?5 min→超聲→靜置過夜→酶解→滅酶→離心取上清

將鵝血解凍,然后加蒸餾水,配成10%的溶液,充分?jǐn)嚢?100 W超聲處理15 min,震蕩30 min,靜止12 h,使紅細(xì)胞充分溶脹。加酶進行酶解,在酶解過程中,4 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)水解液pH,使水解液pH穩(wěn)定,酶解完成后90 ℃滅酶15 min,冷卻,4000 r/min離心10 min,取上清液,即可得到富含氨基酸血紅素的鵝血水解液。

其中鵝血的洗滌工藝為:鵝血→加檸檬酸鈉抗凝劑→4000 r/min離心10 min→沉淀物→加生理鹽水→4000 r/min離心10 min→沉淀物→加生理鹽水→4000 r/min離心10 min→沉淀物

1.2.2鵝血提取血紅素水解度的測定氨基態(tài)氮的含量(AN,Amino Nitrogen):采用甲醛電位滴定法測定[12]。操作步驟:取水解蛋白液5.0 mL于小燒杯中加入60 mL去離子水并磁力攪拌,用精密pH計指示其pH,并用0.1 mol/L氫氧化鈉滴定至pH為8.2,然后加入pH為8.2甲醛溶液20 mL,滴定至pH為9.2,記錄所耗氫氧化鈉的毫升數(shù);做空白實驗(以5.0 mL水做空白);則水解蛋白液的氨基氮含量為:

式中，X為樣品中氨基氮含量(mmol/L);M為所用氫氧化鈉溶液的摩爾濃度(mol/L);V1為樣品滴定所耗氫氧化鈉的體積數(shù)(mL);V2為空白實驗所耗氫氧化鈉的體積數(shù)(mL)。

其中,DH:水解度;TN(Total Nitrogen):總氮量按照國際GB 5009.5-2010測定;AN(Amino Nitrogen):氨基態(tài)氮的含量。

1.2.3制備工藝的單因素實驗分別考察加酶濃度、水解溫度、水解時間、pH 4個實驗因素對鵝血提取血紅素的影響,進行單因素實驗。

1.2.3.1酶濃度對水解度的影響將10%的鵝血紅細(xì)胞溶液,在溫度55 ℃,pH9.5的條件下分別按紅細(xì)胞的量添加1%、2%、3%、4%、5%的堿性蛋白酶,酶解5 h,然后測定酶解溶液的水解度。

1.2.3.2溫度對水解度的影響將10%的鵝血紅細(xì)胞溶液,在酶濃度3%,pH9.5的條件下分別在40、45、50、55、60 ℃的溫度下,酶解5 h,然后測定酶解溶液的水解度。

1.2.3.3水解時間對水解度的影響將10%的鵝血紅細(xì)胞溶液,在酶濃度3%,pH9.5,溫度55 ℃的條件下酶解,分別酶解2、3、4、5、6 h,然后測定酶解液的水解度。

1.2.3.4溶液的pH對水解度的影響將10%的鵝血紅細(xì)胞溶液,在酶濃度3%,溫度55 ℃,分別在溶液pH為8、9、10、11、12的條件下酶解5 h,然后測定酶解溶液的水解度。

1.2.4響應(yīng)面優(yōu)化實驗設(shè)計根據(jù)單因素實驗結(jié)果,選擇對水解度影響較大的因素,采用Box-Behnken進行實驗設(shè)計,采用Design-Expert(Version 8.0)實驗設(shè)計原理,建立數(shù)學(xué)回歸模型,進行數(shù)據(jù)分析,其因素水平設(shè)計見表1。

表1　Box-Behnken因素水平表

1.2.5水解液中其他物質(zhì)的測定

1.2.5.1水解液中血紅素含量的測定血紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，精密稱取經(jīng)105 ℃干燥至恒重的血紅素標(biāo)準(zhǔn)品(16.0±0.1)mg,置于100 mL容量瓶中,加0.1 mol/L NaOH溶液適量使完全溶解后,再用0.1 mol/L NaOH溶液稀釋至刻度,搖勻,得標(biāo)準(zhǔn)液待用。精密量取血紅素標(biāo)準(zhǔn)液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL,用0.1 mol/L的NaOH溶液定容于100 mL容量瓶,搖勻,以0.1 mol/L的NaOH溶液為空白,在383 nm波長處測定其吸光度值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[13]。

水解液中血紅素的測定在優(yōu)化工藝的基礎(chǔ)上,用最優(yōu)工藝酶解鵝血,然后取1 mL水解液,用0.1 mol/L NaOH定容至100 mL,以0.1 mol/L NaOH為空白,在383 nm波長處測定其吸光度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血紅素的含量。

1.2.5.2水解液中鐵離子的測定在優(yōu)化工藝的基礎(chǔ)上,用最優(yōu)工藝酶解鵝血,然后取5 mL水解液,加入10 mL HNO3∶HClO4=4∶1的混酸,消化,測定鐵離子的含量[14]。

1.2.5.3水解液中游離氨基酸的測定在優(yōu)化工藝的基礎(chǔ)上,用最優(yōu)工藝酶解鵝血,然后用全自動氨基酸分析儀測定游離氨基酸的含量。樣品的前處理:水解液用6%磺基水楊酸稀釋6倍,水解前的鵝血(空白樣)1.1694 g加入6%磺基水楊酸1.2 mL,150 W超聲30 min置4 ℃冰箱2 h,16500 r/min離心2 min用0.22 μm濾膜過濾上機分析。分析條件:一個樣品分析周期53 min;分離柱:(4.6 mm×60 mm),洗脫液流速0.4 mL/min,柱溫70 ℃,柱壓9.627 MPa;反應(yīng)柱:茚三酮及茚三酮緩沖液流速0.35 mL/min,柱溫135 ℃,柱壓1.078 MPa。

1.2.5.4數(shù)據(jù)處理單因素實驗采用Origin進行數(shù)據(jù)分析,響應(yīng)面實驗設(shè)計采用軟件Design Expert進行二次回歸模型分析以及響應(yīng)面分析圖象處理。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實驗

2.1.1酶濃度對水解度的影響從圖1可以看出,隨著加酶量的增加,酶解液的水解度呈上升趨勢。在加酶量4%時水解度達到最大,此后呈現(xiàn)平穩(wěn)的趨勢。這可能是酶添加量對酶促反應(yīng)有一定的影響,酶添加量越大,與底物作用的酶分子就越多,反應(yīng)就越充分;但是酶添加到一定量的時候,酶分子將底物飽和,再增加酶量對反應(yīng)起不到促進作用。因此選擇酶濃度為4%。

圖1　酶濃度對水解度的影響Fig.1　Effect of enzyme concentration on the degree of hydrolysis

2.1.2水解溫度對水解度的影響從圖2可看出隨著水解溫度的升高,水解度的變化很顯著。在40～50 ℃之間水解度急劇上升,50 ℃時達到最大,之后呈下降趨勢。酶的催化作用受溫度的影響很大。溫度對酶催化的反應(yīng)有雙重效應(yīng),一方面,溫度上升可以使反應(yīng)加快;另一方面,溫度升高可使酶因變性而失活。各種酶的反應(yīng)有其最適的溫度,此時,酶的反應(yīng)速度最快?？赡苁?0 ℃時,酶的作用力最強,能較好的酶解血紅蛋白;血紅蛋白在50 ℃時能較好的伸展開,使作用位點充分的暴露,有利于酶的作用。因此選擇水解溫度50 ℃。

圖2　水解溫度對水解度的影響Fig.2　Effect of temperature on degree of hydrolysis

2.1.3pH對水解度的影響圖3可以看出,pH對水解度的影響很大,pH在8～9時,隨著pH升高,水解度增大,在9時達到最大,之后呈下降趨勢。酶是一種特殊的蛋白質(zhì),其催化反應(yīng)的能力很大程度上受所處環(huán)境pH的影響。環(huán)境pH影響酶分子的構(gòu)象及酶分子與底物的結(jié)合,所以pH過高或過低均不利于酶的活性從而影響酶促反應(yīng)的速度。各種酶對底物的作用均有一個最佳的pH,堿性蛋白酶對鵝血血紅蛋白作用的最適pH為9。

圖3　溶液pH對水解度的影響Fig.3　Effect of pH on the degree of hydrolysis

2.1.4水解時間對水解度的影響從圖4可以看出,酶促反應(yīng)在開始時反應(yīng)比較劇烈,5 h后反應(yīng)趨于平緩,說明反應(yīng)已經(jīng)基本達到平衡。延長水解時間有利于提高水解度,但是超過5 h后對于反應(yīng)的意義不大。綜合生產(chǎn)過程中的電能消耗、生產(chǎn)周期、溶劑損失、經(jīng)濟效益和水解液的質(zhì)量等因素,選取水解時間5 h適宜。

圖4　水解時間對水解度的影響Fig.4　Effect of hydrolysis time on the degree of hydrolysis

2.2工藝優(yōu)化實驗

2.2.1響應(yīng)面實驗結(jié)果通過單因素實驗確定實驗的最佳水平,采用Box-Behnken進行實驗設(shè)計,設(shè)計4因素3水平共29個實驗,其中24個分析因素實驗,5個零點實驗,優(yōu)化堿性蛋白酶酶解鵝血提取血紅素的工藝條件。設(shè)計的實驗方案和結(jié)果見表2。

表2　Box-Behnken中心實驗設(shè)計方案及結(jié)果

2.2.2回歸模型的建立和方差分析使用響應(yīng)面分析法對表2中的實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合,得到酶濃度、pH、水解溫度、水解時間相關(guān)回歸系數(shù),其回歸方程為:

Y=14.64+0.78A-0.092B+0.45C+0.21D-0.18AB-0.52AC+0.12AD+0.38BC+0.010BD-0.013CD-0.88A2-0.64B2-0.90C2-1.04D2

進一步對回歸方程進行分析,所得的方差分析結(jié)果見表3。

2.2.3兩因素交互作用分析酶濃度與水解溫度、溶液pH和水解溫度交互作用的響應(yīng)面圖,如圖5所示。

圖5　交互作用對水解度的響應(yīng)面圖Fig.5　Response surface plot of effect of interaction on the degree of hydrolysis

依據(jù)響應(yīng)面的等高線的形狀越接近橢圓形和曲面傾斜度越陡,響應(yīng)值對于處理條件改變的敏感程度越大,因素間交互作用越顯著,反之則交互作用不顯著[15]。由圖5可以看出,在一定的范圍內(nèi),水解度隨著酶濃度和水解溫度的增加而升高,兩者交互作用為極顯著。同樣,可以看出,在一定的范圍內(nèi),水解度隨著溶液pH和水解溫度的增加而升高,兩者交互作用為顯著;而酶濃度和pH、酶濃度和水解時間以及水解溫度和水解時間交互作用不明顯。

2.3最佳工藝的確定與驗證

從上述回歸模型中求得最佳工藝條件為:酶濃度5%、水解溫度49.63 ℃、水解時間5.15 h、pH8.80,此條件下水解度預(yù)測值為14.60%?？紤]到實際操作,將上述條件修正為:酶濃度5%、水解溫度50 ℃、水解時間5.15 h、pH8.80。

驗證實驗結(jié)果表明:在修正的最佳工藝條件下,水解度為14.36%±0.18%,預(yù)測精度高達98.36%,再次證明回歸模型的準(zhǔn)確性。

2.4水解液中血紅素及鐵離子的含量

根據(jù)吸光度y對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)血紅素濃度x的關(guān)系,得到血紅素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=0.04551x+0.00376,相關(guān)系數(shù)R2=0.9980,在0～10 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

表3　水解度的回歸方程各項的方差分析

注:p<0.01為極顯著,用**表示;p<0.05為顯著,用*表示。

優(yōu)化工藝酶解鵝血,測水解液中血紅素及鐵離子的含量。得水解液中血紅素的含量為1.210 mg/mL;鐵離子的含量為90.42 μg/mL。

2.5水解液中游離氨基酸的測定

由鵝血酶解前后游離氨基酸含量(沒有色氨酸標(biāo)品未測色氨酸)分析結(jié)果見表4,可知,鵝血中含有18氨基酸,其中包括人體必需的8種氨基酸,且這些氨基酸不僅含量高,而且種類平衡。鵝血中游離必需氨基酸占總游離氨基酸的21.95%,游離必需氨基酸占游離非必需氨基酸的28.13%。鵝血酶解后,水解液中的游離必須氨基酸占總游離氨基酸的52.17%,游離必需氨基酸占游離非必需氨基酸的109.07%,人體必需氨基酸和嬰兒體內(nèi)不能合成的組氨酸共9種氨基酸,除蘇氨酸減少外,其余的8種氨基酸百分含量均增加,總必需氨基酸所占百分比大大增加,酶解后水解液中必需氨基酸的百分比高達52.17%。本實驗的必需氨基酸百分比,與高楊[16]酶解鵝血水解液中必需氨基酸的百分比為29.37%相比,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其含量,并且種類更齊全。氨基酸能與鐵離子絡(luò)合,促進鐵離子的吸收,酶解后水解液中氨基酸含量極高,水解液可大大促進人體對鐵離子的吸收。陳潔等[17]研究表明氨基酸對硫酸亞鐵有顯著促進吸收的作用。所以,水解液可作為理想的補鐵補血原料。此外,氨基酸提供幾個健康益處,例如降低血液中的膽固醇,減少冠狀動脈心臟疾病和提高抗肥胖癥的潛力[18]。天冬氨酸、甘氨酸和谷氨酸也已知在傷口愈合的過程中發(fā)揮作用[19]。人們將酪氨酸、蛋氨酸、組氨酸、賴氨酸和色氨酸作為抗氧化劑[20],可生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的功能性食品。水解液中同時富含多肽,可作為富含小肽成分的蛋白質(zhì)營養(yǎng)來源,提高蛋白的消化利用率,也可作為理想的配體,生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的飼料添加劑。

表4　鵝血酶解前后游離氨基酸含量

3　結(jié)論

本文通過單因素和響應(yīng)曲面優(yōu)化實驗,得到了堿性蛋白酶酶解鵝血提取血紅素的工藝條件為:酶濃度5%、水解溫度50 ℃、水解時間5.15 h、pH8.80,該條件下水解度為14.36%±0.18%,預(yù)測精度高達98.36%,證明該模型具有準(zhǔn)確性和可行性。

水解液中血紅素的含量為1.210 mg/mL,鐵離子的含量為90.42 μg/mL,游離必需氨基酸占總游離氨基酸的52.17%,游離必需氨基酸占游離非必需氨基酸的109.07%,可作為理想的補鐵補血原料。

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Enzymolysis goose blood preparation high amino acid goose blood heme

QIN Chun-qing1,HUANG Ke1,LI Ben-jiao1,CHENG Ya-jiao1,LENG An-zhong2,LIU Xiong1,*

(1.Coleege of Food Science,Southwest University,Chongqing 400715,China;2.Qing shui-wan Food Co.,Ltd.,of Chongqing,Chongqing 400715,China)

Box-Behnken experiment was designed to optimize the process conditions of alkaline protease enzyme goose blood to preparate high amino acid heme. The results showed that enzyme concentration had the greatest impact on the degree of hydrolysis,the next one was hydrolysis temperature,the third was the hydrolysis time and the last was the pH of solution. The optimal process conditions for goose blood preparation high amino acid goose blood heme were:enzyme concentration 5%,hydrolysis temperature 50 ℃,hydrolysis time 5.15 h and pH8.80,the degree of hydrolysis was 14.36%±0.18%. After hydrolysis,the content of heme in the hydrolysate was 1.210 mg/mL,and the content of iron ion was 90.42 μg/mL.

goose blood;enzymatic hydrolysis;degree of hydrolysis;high amino acids heme

2015-12-25

秦春青(1989-)女,碩士研究生,研究方向:食品化學(xué)與營養(yǎng)學(xué),E-mail:158722614@qq.com。

劉雄(1970-)男,博士,教授,研究方向:碳水化合物資源開發(fā)與利用,E-mail:liuxiong848@hotmail.com。

TS201.1

B

1002-0306(2016)12-0172-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.025