利用核磁共振技術(shù)研究食鹽對(duì)鴨蛋黃品質(zhì)的影響

劉斯琪,林向陽,朱　豐,李雙雙,朱銀月,陳慧玲

(福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,福建福州 350108)

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利用核磁共振技術(shù)研究食鹽對(duì)鴨蛋黃品質(zhì)的影響

劉斯琪,林向陽*,朱豐,李雙雙,朱銀月,陳慧玲

(福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,福建福州 350108)

利用低場(chǎng)核磁共振及其成像技術(shù)研究食鹽對(duì)鴨蛋黃品質(zhì)影響的作用機(jī)制。在不同食鹽添加量條件下,測(cè)定蛋黃質(zhì)構(gòu)特性、可溶性蛋白含量和出油率的變化,并分析蛋黃弛豫特性分別與質(zhì)構(gòu)特性和出油率之間的相關(guān)性。結(jié)果表明:食鹽對(duì)蛋黃質(zhì)構(gòu)特性及弛豫特性有顯著性影響,且隨著食鹽添加量的增加呈現(xiàn)規(guī)律性變化,而隨著食鹽添加量的增加,蛋黃可溶性蛋白含量先增加后下降,出油率先下降后上升,并分析得出蛋黃弛豫特性與蛋黃質(zhì)構(gòu)特性和出油率均呈顯著相關(guān)性。表明食鹽會(huì)改變鴨蛋黃內(nèi)部氫質(zhì)子的遷移及分布,導(dǎo)致鴨蛋黃質(zhì)構(gòu)特性及出油率發(fā)生改變,進(jìn)而影響鴨蛋黃的品質(zhì)。

低場(chǎng)核磁共振,質(zhì)構(gòu),出油率,可溶性蛋白含量,鴨蛋黃

鴨蛋黃含有豐富的脂溶性維生素、多不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì),更因咸蛋黃油露松沙的質(zhì)地及獨(dú)特的風(fēng)味,深受消費(fèi)者喜愛和市場(chǎng)的青睞。雖然自1985年起,我國禽蛋產(chǎn)量一直位列全球首位[1],但我國禽蛋加工仍處于初級(jí)階段,加工品大都以傳統(tǒng)蛋制品為主,極度限制了禽蛋附加值的增長(zhǎng)[2],因此對(duì)禽蛋精深加工的研究具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益[3]。而傳統(tǒng)咸蛋黃主要是鴨蛋經(jīng)過鹽水或含鹽的純凈黃泥、紅泥、草木灰等腌制而成[4-5],其存在資源浪費(fèi),生產(chǎn)周期長(zhǎng)、食品衛(wèi)生得不到保證和產(chǎn)品品質(zhì)不穩(wěn)定等問題,因此對(duì)咸蛋黃單獨(dú)腌制已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。

核磁共振技術(shù),具有無侵入、無污染;測(cè)量迅速、準(zhǔn)確等特點(diǎn)[6]。林向陽[7]等應(yīng)用NMR 和MRI 技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)影響雞蛋腐敗的主要因素是水分的遷移和蛋黃膜的強(qiáng)度。林婉瑜[8]等利用核磁共振技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)在蒸煮過程中蛋清先于蛋黃逐漸變性,弛豫時(shí)間T23對(duì)應(yīng)的質(zhì)子密度逐漸降低,最后達(dá)到穩(wěn)定的狀態(tài),即在蒸煮過程中整個(gè)帶殼雞蛋的流動(dòng)性下降。本實(shí)驗(yàn)利用低場(chǎng)核磁共振及其成像技術(shù),并結(jié)合出油率和可溶性蛋白含量的測(cè)定等方法,研究食鹽對(duì)鴨蛋黃品質(zhì)的影響,為單獨(dú)快速制備優(yōu)質(zhì)的咸蛋黃制品提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮鴨蛋福建省仙游市大老古食品有限公司;食鹽福建省鹽業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司;四氧化鋨、異丙醇、正己烷、考馬斯亮藍(lán)G250國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)寶生物工程有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

MINI MR核磁共振分析儀(23 MHz,0.56 T)上海紐邁電子科技有限公司;TA-XT plus Texture Analyzer質(zhì)構(gòu)儀北京微訊超技儀器技術(shù)有限公司;UV-1100紫外可見分光光度計(jì)上海美譜達(dá)儀器有限公司;BS110S電子天平賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)樣品的制作

1.2.1.1工藝流程

1.2.1.2操作要點(diǎn)a.選擇未破損、無裂痕、無異味的新鮮鴨蛋,用流水洗凈,將蛋白蛋黃分離,用濾紙吸掉多余的蛋清液和系帶,挑破蛋黃膜,得到新鮮的蛋黃液。

b.將蛋黃液與食鹽按指定比例混合均勻,獲得樣品a。

c.將樣品a置于沸水中煮制,獲得樣品b。

d.將樣品b置于2.5%戊二醛溶液中定型(0.2 mol/L磷酸緩沖液)2 h,用0.2 mol/L磷酸緩沖液沖洗2次,每次15 min,然后用1%的四氧化鋨(0.2 mol/L磷酸緩沖液)溶液定型24 h,將定型后的樣品蛋黃用50%、70%、80%、90%和100%的乙醇進(jìn)行梯度脫水,每次30 min,獲得樣品c[9]。

1.2.2可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定參考Bradford的方法[10]。以牛血清蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取1 g樣品a,加50 mL Tris-HCl緩沖溶液(0.05 mol/L,pH6.5),5000 r/min均質(zhì)2 min,然后10000×g 離心20 min,取上清液2 mL稀釋50倍,測(cè)定吸光度(595 nm),標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量記為ρ(μ g/mL),提取液總體積記為VT(mL),樣品質(zhì)量記為m(g)，樣品中蛋白質(zhì)含量計(jì)算公式:

1.2.3弛豫時(shí)間T2及質(zhì)子密度M2的測(cè)定稱取兩份2.000 g樣品b,其中一份制得樣品c,分別放入玻璃試管(口徑18 mm),而后將樣品管置于NMR探頭中(保持溫度32 ℃),使用CPMG序列測(cè)試橫向弛豫時(shí)間T2,其中接收機(jī)帶寬SW=200 kHz,采樣起始點(diǎn)控制參數(shù)RFD=0.020 ms,重復(fù)采樣時(shí)間間隔TW=3000.000 ms,模擬增益RG1=20.0 db,90°和180°脈寬分別是P90=18 μs,P180=36 μs,時(shí)延DL1=0.150,采樣點(diǎn)數(shù)TD=19851.9,數(shù)字增益DRG1=3,數(shù)據(jù)半徑DR=1,累加掃描次數(shù)NS=16,回波個(gè)數(shù)NECH=2800。實(shí)驗(yàn)取3份平行,每份平行測(cè)3次。

對(duì)樣品b所得圖譜進(jìn)行反演,得到蛋黃弛豫時(shí)間T2和質(zhì)子密度M2。弛豫時(shí)間T2表征的是蛋黃氫質(zhì)子的流動(dòng)性大小,而質(zhì)子密度M2表征的是在某個(gè)相應(yīng)的弛豫時(shí)間下蛋黃氫質(zhì)子的含量。對(duì)樣品c所得圖譜進(jìn)行反演,得到蛋黃油脂弛豫時(shí)間T″2和質(zhì)子密度M″2。弛豫時(shí)間T″2表征的是蛋黃油脂氫質(zhì)子的流動(dòng)性大小,而質(zhì)子密度M″2表征的是在某個(gè)相應(yīng)的弛豫時(shí)間下蛋黃油脂氫質(zhì)子的含量。

1.2.4核磁共振成像取樣品b,采用多層自旋回波序列(Multi-Slice Echo,MSE)進(jìn)行質(zhì)子加權(quán)成像,Y軸為選層梯度,X軸為相位梯度,Z軸為讀出梯度,90°和180°軟脈沖均為1200 μs,重復(fù)采樣時(shí)間D0為1000.000 ms,半回波時(shí)間D4為0.500 ms,選層梯度脈沖(90°)對(duì)應(yīng)的補(bǔ)償梯度GA1為14.5%,選層梯度脈沖(180°)對(duì)應(yīng)的補(bǔ)償梯度脈沖GA2為80.0%,相位編碼脈沖的幅度GA3為72.0%,頻率編碼方向的補(bǔ)償梯度脈沖的幅度GA4為51.0%,頻率編碼脈沖的幅度GA5為28.0%。

1.2.5出油率的測(cè)定稱取3.000 g樣品b加入35 mL有機(jī)溶劑(V正己烷∶V異丙醇=3∶2),5000 r/min均質(zhì)10 min,用濾紙過濾,去濾液于沸水浴55 ℃中濃縮蒸發(fā)后在105 ℃烘干至質(zhì)量恒定,稱濾渣質(zhì)量作為總的脂質(zhì)質(zhì)量。取5.000樣品b加25 mL蒸餾水,5000 r/min均質(zhì)30 s,勻漿在25 ℃條件下9500×g離心30 min,然后取上清液并加入25 mL有機(jī)溶劑(正己烷∶異丙醇=3∶2,v/v)用來溶解懸浮物。可用分液漏斗分離得到脂質(zhì)層,將脂質(zhì)層中的溶劑在沸水浴中蒸發(fā),然后在105 ℃加熱至質(zhì)量恒定,稱殘?jiān)|(zhì)量作為游離脂質(zhì)的質(zhì)量[11]。可用游離脂質(zhì)量和總的脂質(zhì)量的比表示出油率,計(jì)算公式:

1.2.6質(zhì)構(gòu)測(cè)定實(shí)驗(yàn)及參數(shù)設(shè)定采用輕型刀片P/36R探頭進(jìn)行TPA(模擬兩次咀嚼實(shí)驗(yàn))模式的質(zhì)構(gòu)測(cè)定,測(cè)前速度(pre-test speed)=1.00 mm/s,測(cè)后速度(post-test speed)=1.00 mm/s,測(cè)試速度(test speed)=1.00 mm/s,觸發(fā)力(trigger force)=5 g,壓縮程度為50%,兩次壓縮停留間隔時(shí)間(time)=5 s,數(shù)據(jù)采集速率為400 p/s,主要研究指標(biāo)為硬度、粘性、彈性和咀嚼性。每組選取9個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)定,取平均值。

1.3數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行結(jié)果處理,并以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示,相關(guān)性分析采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行。

2　結(jié)果與討論

2.1食鹽添加量對(duì)鴨蛋黃可溶性蛋白含量的影響

圖1為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性回歸方程:Y=0.0079X+0.0186,相關(guān)系數(shù)R2=0.9967,線性良好。蛋黃可溶性蛋白含量隨食鹽添加量的變化見圖2,由圖2可知,蛋黃可溶性蛋白含量隨食鹽添加量的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),并在食鹽添加量為3%時(shí)達(dá)到最大值。在上升階段首先是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在一定的食鹽濃度范圍內(nèi)具有鹽溶作用,其次是由于蛋黃顆粒主要以高密度脂蛋白—卵黃高磷蛋白通過鈣、磷橋形成復(fù)合物的形式存在,隨著食鹽添加量的增大,導(dǎo)致更多維持顆粒結(jié)構(gòu)的鈣、磷橋中的鈣離子被鈉離子取代,從而破壞了蛋黃的顆粒結(jié)構(gòu),使可溶性的卵黃高磷蛋白被溶出[12]。但是當(dāng)食鹽添加量超過一定范圍后,促使蛋白質(zhì)發(fā)生鹽析反應(yīng),其次隨著食鹽添加量的增加,使得蛋黃體系的粘度增加,蛋黃微粒和蛋黃漿液之間可能發(fā)生相互作用,產(chǎn)生分子間和分子內(nèi)聚集,進(jìn)而導(dǎo)致蛋黃可溶性蛋白含量顯著降低。對(duì)不同食鹽添加量條件下的蛋黃可溶性蛋白含量進(jìn)行SPSS單因素方差分析,得到p<0.01,結(jié)果表明食鹽添加量對(duì)蛋黃可溶性蛋白含量具有極顯著性影響。

圖1　考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　The standard curve of BSA with Coomassie brilliant blue method

圖2　不同食鹽添加量對(duì)蛋黃可溶性蛋白含量的影響Fig.2　Soluble protein content of duck yolk with different salt contents

2.2蛋黃及其油脂的核磁共振分析

圖3　蛋黃的橫向弛豫時(shí)間T2Fig.3　The transverse relaxation time T2 of duck yolk

圖4　蛋黃油脂的橫向弛豫時(shí)間T″2Fig.4　The transverse relaxation time T″2 of yolk oil

2.3不同食鹽添加量對(duì)蛋黃水分和油脂分布的影響

同樣由圖5～圖6可知,隨著食鹽添加量的增加蛋黃內(nèi)油脂的質(zhì)子密度M″21呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì),其弛豫時(shí)間T″21則先減少后增加,即在食鹽添加量少于3%時(shí)脂質(zhì)與蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的結(jié)合能力隨著食鹽添加量的增加而增加,大于3%時(shí)脂質(zhì)與蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的結(jié)合能力隨著食鹽添加量的增加而降低,且此弛豫部分的脂質(zhì)含量逐漸降低。首先是因?yàn)槭雏}的加入導(dǎo)致蛋黃體系粘度增加,脂蛋白質(zhì)分子間進(jìn)行相互作用,形成凝膠一樣的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),并且食鹽促使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的一些硫氫鍵向二硫鍵轉(zhuǎn)化[15],蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,導(dǎo)致蛋白質(zhì)之間的引力增大,并且脂蛋白在低濃度的食鹽體系中會(huì)形成低密度脂蛋白-水-NaCl復(fù)合物[16],因此結(jié)合水的含量逐漸增加,其次脂蛋白在食鹽的作用下發(fā)生變性,導(dǎo)致脂質(zhì)從蛋白質(zhì)中脫離出來,遷移為T″22的油脂。但是當(dāng)食鹽含量過多時(shí),蛋黃體系乳化特性降低,反而導(dǎo)致油脂弛豫時(shí)間增加。

圖5　不同食鹽添加量對(duì)弛豫時(shí)間T21的影響Fig.5　Effect of different salt contents on transverse relaxation time T21

圖6　不同食鹽添加量對(duì)質(zhì)子密度M21的影響Fig.6　Effect of different salt contents on the proton density M21

圖7　不同食鹽添加量對(duì)弛豫時(shí)間T23的影響Fig.7　Effect of different salt contents on transverse relaxation time T23

圖8　不同食鹽添加量對(duì)弛豫時(shí)間M23的影響Fig.8　Effect of different salt contents on the proton density M23

2.4不同食鹽添加量下的蛋黃核磁共振成像分析

實(shí)驗(yàn)對(duì)不同食鹽添加量條件下的樣品取樣進(jìn)行質(zhì)子密度成像,并對(duì)成像結(jié)果進(jìn)行對(duì)比,由圖9可知,信號(hào)量越大則圖像亮度越高,即亮度越高的地方表示氫質(zhì)子活度越高,分布越多。如圖9(a～f)可知,樣品成像區(qū)域亮度都較為均勻,即氫質(zhì)子分布均勻,當(dāng)食鹽添加量低于3%時(shí),隨食鹽添加量的增加樣品成像的亮度越高,即蛋黃樣品的氫質(zhì)子流動(dòng)性逐漸增加,結(jié)合圖7、圖8可知,主要是因?yàn)榈包S內(nèi)部水分向外遷移的程度大于脂質(zhì)向內(nèi)部遷移的程度,導(dǎo)致蛋黃體系整體氫質(zhì)子的弛豫時(shí)間和質(zhì)子密度增加。當(dāng)食鹽添加量過多后,樣品成像亮度逐漸減弱,主要是由于蛋黃體系整體氫質(zhì)子的弛豫時(shí)間與質(zhì)子密度均減小的緣故。

圖9　不同食鹽添加量下的蛋黃質(zhì)子密度成像Fig.9　Proton density images of duck yolkunder different salt contents注:a. 0%;b. 1%;c. 2%;d. 3%;e. 4%;f. 5%。

2.5食鹽添加量對(duì)鴨蛋黃出油率的影響

蛋黃出油率隨食鹽添加量的變化曲線見圖10,由圖10可知,蛋黃出油率隨食鹽添加量的增加呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì),并在食鹽添加量為3%時(shí)達(dá)到最小值。主要是因?yàn)榈包S是由蛋白質(zhì)、油脂和水分組成的相互包裹、相互作用的復(fù)雜體系,起初隨著食鹽添加量的增加,蛋黃粘度及硬度逐漸增加,蛋黃球體積逐漸減小,油脂被束縛。當(dāng)食鹽添加量過大后,破壞了蛋黃體系,使得蛋黃乳化容量降低,從而導(dǎo)致油脂游離出來。對(duì)不同食鹽添加量條件下的蛋黃出油率進(jìn)行SPSS單因素方差分析,結(jié)果表明食鹽添加量對(duì)蛋黃出油率具有極顯著性影響(p<0.01)。

圖10　不同食鹽添加量對(duì)蛋黃出油率的影響Fig.10　Effect of different salt contents on the duck yolk oil

2.6食鹽添加量對(duì)鴨蛋黃質(zhì)構(gòu)的影響

對(duì)不同食鹽添加量條件下的蛋黃質(zhì)構(gòu)特性進(jìn)行了測(cè)定,由圖11可知,隨著食鹽添加量的增加蛋黃硬度、粘性、咀嚼性先增加后趨于平緩,均在食鹽添加量為3%左右開始趨于平緩,蛋黃彈性隨著食鹽添加量的增加呈現(xiàn)先增加后下降的的趨勢(shì)。首先食鹽可使蛋黃球破裂釋放出蛋黃顆粒,促進(jìn)蛋黃凝膠,提高凝膠強(qiáng)度[17],其次隨著食鹽濃度的增加,維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的二硫鍵與巰基進(jìn)行交換及巰基的氧化,使得巰基含量降低,導(dǎo)致蛋黃硬度、粘性及咀嚼性不斷增加[18]。而后,隨著食鹽濃度的增加,蛋黃油不斷浸出,含量不斷增大,蛋黃油在蛋黃球及蛋黃顆粒之間起到潤(rùn)滑的作用,使得蛋黃硬度、粘度及咀嚼性到達(dá)一個(gè)平穩(wěn)的狀態(tài)。對(duì)不同食鹽添加量的蛋黃質(zhì)構(gòu)特性進(jìn)行SPSS單因素方差分析,其中硬度、粘性和咀嚼性均為p<0.01,彈性的單因素方差結(jié)果為0.05>p=0.01>0.01,即食鹽添加量對(duì)蛋黃硬度、粘性和咀嚼性有極顯著的影響,對(duì)彈性具有顯著影響。

圖11　不同食鹽添加量對(duì)蛋黃質(zhì)構(gòu)特性(TPA模式)的影響Fig.11　Effect of different salt contents on texture proterties(TPA model)of duck yolk

2.7不同食鹽添加量條件下的弛豫特性與質(zhì)構(gòu)特性及出油率的相關(guān)性分析

表1　不同食鹽添加量條件下蛋黃弛豫特性與質(zhì)構(gòu)特性及出油率的相關(guān)性

注:**:相關(guān)性在0.01水平(雙側(cè))上顯著;*:相關(guān)性在0.05水平(雙測(cè))上顯著;表2、表3同。

表2　不同食鹽添加量條件下蛋黃水分的弛豫特性與質(zhì)構(gòu)特性及出油率的相關(guān)性

表3　不同食鹽添加量條件下蛋黃油脂的弛豫特性與質(zhì)構(gòu)特性及出油率的相關(guān)性

3　結(jié)論

通過單因素方差分析可知,食鹽添加量對(duì)鴨蛋黃樣品的可溶性蛋白含量、出油率、質(zhì)構(gòu)特性等均有顯著影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,隨著食鹽添加量的增加,鴨蛋黃的粘性、硬度、咀嚼性均先逐漸增加后趨于平緩,彈性呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì),鴨蛋黃的可溶性蛋白含量先上升后下降,而出油率則隨著食鹽添加量的增加先減少后逐漸上升。利用SPSS進(jìn)行相關(guān)性分析可知,不同食鹽添加量條件下樣品的弛豫特性與樣品質(zhì)構(gòu)特性和出油率顯著相關(guān),表明食鹽導(dǎo)致鴨蛋黃內(nèi)部氫質(zhì)子的活性及分布發(fā)生改變,從而影響鴨蛋黃整體的質(zhì)構(gòu)特性及出油率,因此食鹽對(duì)鴨蛋黃的品質(zhì)有明顯的影響。

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Using the NMR to study the quality of duck egg yolk with salt

LIU Si-qi,LIN Xiang-yang*,ZHU Feng,LI Shuang-shuang,ZHU Yin-yue,CHEN Hui-ling

(College of Biological Science and Engineering,Fuzhou University,Fuzhou 350108,China)

The NMR as the main method combining with MRI were used to study the mechanism on the effect of the quality of duck yolk with salt. The experiment determined the changes of the sample texture,soluble protein content,and oil exudation under different salt content. At the same time,the correlation of relaxation behavior between texture properties and oil exudation were analyzed respectively. The result showed that:firstly,salt had a significant effect on yolk’s relaxation behaviors and texture properties. Both of them showed regular changes with the increase of salt content. Secondly,with the increase of salt content the content of soluble protein increased first and then decreased,the oil exudation decreased and then increased.Meanwhile,the relaxation behavior was significantly correlated with the texture properties and oil exudation. It showed that salt could change the distribution and migration of hydrogen in duck yolk,causing the changes of the content of soluble protein and oil exudation and further affecting the quality of duck yolk.

NMR;texture;oil exudation;soluble protein content;egg yolk

2015-11-11

劉斯琪(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：核磁共振技術(shù)在食品工程中的應(yīng)用，E-mail：liusq920@foxmail.com。

林向陽(1969-)，男，博士，教授，研究方向：生物質(zhì)轉(zhuǎn)化可再生能源技術(shù)、核磁共振技術(shù)、臭氧及等離子等冷殺菌技術(shù)在食品工程中的應(yīng)用，E-mail：xylin@fzu.edu.cn。

福建省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目(2009N0036)。

TS253.1

A

1002-0306(2016)12-0160-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.023